糖及其代谢物的测定.docx
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糖及其代谢物的测定
第八章糖及其代谢物的测定
第一节血清（浆）葡萄糖测定
血液中的葡萄糖称为血糖。
血糖测定是临床生化检验中历史最久、占日常工作量比重较大的项目之一。
过去测定血糖多采用全血，但目前多采用血清或血浆。
测定血糖的方法很多，可分为三大类：
氧化还原法、缩合法及酶法。
国际上推荐的参考方法是已糖激酶法，但试剂比较昂贵，不适用于常规分析。
我国已淘汰氧化还原法，推荐的方法是葡萄糖氧化酶法，而目前有些基层单位仍沿用邻甲苯胺法。
实验39葡萄糖氧化酶法测定血清（浆）葡萄糖
【原理】葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。
过氧化物酶（peroxidase，POD）在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色醌类化合物，即Trinder反应。
红色醌类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。
【试剂】
1．0.1mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.0）称取无水磷酸氢二钠8.67g及无水磷酸二氢钾5.3g溶于蒸馏水800ml中，用1mol/L氢氧化钠（或1mol/L盐酸）调pH至7.0，用蒸馏水定容至1L。
2．酶试剂称取过氧化物酶1200U，葡萄糖氧化酶1200U，4-氨基安替比林10mg，叠氮钠100mg，溶于磷酸盐缓冲液80ml中，用1mol/LNaOH调pH至7.0，用磷酸盐缓冲液定容至100ml，置4℃保存，可稳定3个月。
3．酚溶液称取重蒸馏酚100mg溶于蒸馏水100ml中，用棕色瓶贮存。
4．酶酚混合试剂酶试剂及酚溶液等量混合，4℃可以存放1个月。
5．12mmol/L苯甲酸溶液溶解苯甲酸1.4g于蒸馏水约800ml中，加温助溶，冷却后加蒸馏水定容至lL。
6．100mmol/L葡萄糖标准贮存液称取已干燥恒重的无水葡萄糖1.802g，溶于12mmol/L苯甲酸溶液约70ml中，以12mmol/L苯甲酸溶液定容至100ml。
2h以后方可使用。
7．5mmol/L葡萄糖标准应用液吸取葡萄糖标准贮存液5.0ml放于100ml容量瓶中，用12mmol/L苯甲酸溶液稀释至刻度，混匀。
【操作步骤】
1．自动分析法按仪器说明书的要求进行测定。
2．手工操作法取试管3支，按表8-1操作。
表8-1葡萄糖氧化酶法测血糖操作步骤
加入物（ml）
空白管
标准管
测定管
血清
－
－
0.02
葡萄糖标准应用液
－
0.02
－
蒸馏水
0.02
－
－
酶酚混合试剂
3.0
3.0
3.0
混匀，置37℃水浴中，保温15min，在波长505nm处比色，以空白管调零，读取标准管及测定管吸光度。
【计算】
【参考范围】空腹血清葡萄糖为3.89～6.11mmol/L。
【临床意义】
1．生理性高血糖可见摄入高糖食物后，或情绪紧张肾上腺分泌增加时。
2．病理性高血糖
（1）糖尿病：
病理性高血糖常见于胰岛素绝对或相对不足的糖尿病患者。
（2）内分泌腺功能障碍：
甲状腺功能亢进，肾上腺皮质功能及髓质功能亢进。
引起的各种对抗胰岛素的激素分泌过多也会出现高血糖。
注意升高血糖的激素增多引起的高血糖，现已归入特异性糖尿病中。
（3）颅内压增高：
颅内压增高刺激血糖中枢，如颅外伤、颅内出血、脑膜炎等。
（4）脱水引起的高血糖：
如呕吐、腹泻和高热等也可使血糖轻度增高。
3．生理性低血糖见于饥饿和剧烈运动。
4．病理性低血糖（特发性功能性低血糖最多见，依次是药源性、肝源性、胰岛素瘤等）
（1）胰岛β细胞增生或胰岛β细胞瘤等，使胰岛素分泌过多。
（2）对抗胰岛素的激素分泌不足，如垂体前叶功能减退、肾上腺皮质功能减退和甲状腺功能减退而使生长素、肾上腺皮质激素分泌减少。
（3）严重肝病患者，由于肝脏储存糖原及糖异生等功能低下，肝脏不能有效地调节血糖。
【注意事项】
1．葡萄糖氧化酶对β-D葡萄糖高度特异，溶液中的葡萄糖约36%为α型，64%为β型。
葡萄糖的完全氧化需要α型到β型的变旋反应。
国外某些商品葡萄糖氧化酶试剂盒含有葡萄糖变旋酶，可加速这一反应，但在终点法中，延长孵育时间可达到完成自发变旋过程。
新配制的葡萄糖标准液主要是α型，故须放置2h以上（最好过夜），待变旋平衡后方可应用。
2．葡萄糖氧化酶法可直接测定脑脊液葡萄糖含量，但不能直接测定尿液葡萄糖含量。
因为尿液中尿酸等干扰物质浓度过高，可干扰过氧化物酶反应，造成结果假性偏低。
3．测定标本以草酸钾－氟化钠为抗凝剂的血浆较好。
取草酸钾6g，氟化钠4g。
加水溶解至100ml。
吸取0.1ml到试管内，在80℃以下烤干使用，可使2～3ml血液在3～4天内不凝固并抑制糖分解。
4．本法用血量甚微，操作中应直接加标本至试剂中，再吸试剂反复冲洗吸管，以保证结果可靠。
5．严重黄疽、溶血及乳糜样血清应先制备无蛋白血滤液，然后再进行测定。
【评价】线性范围至少可达22.24mmol/L，回收率94%～105%，批内CV为0.7%～2.0%。
批间CV为2%左右，日间CV为2%～3%。
葡萄糖氧化酶法与己糖激酶法比较，73份标本葡萄糖氧化酶法均值为8.31mmol/L，已糖激酶法均值8.21mmol/L，相关系数为0.9986，回归方程y=1.0026x－2.29。
本法测定葡萄糖非常特异，从原理反应式中可知第一步是特异反应，第二步特异性较差。
误差往往发生在反应的第二步。
一些还原性物质如尿酸、维生素C、胆红素和谷胱甘肽等，可与色原性物质竞争过氧化氢，从而消耗反应过程中所产生的过氧化氢，产生竞争性抑制，使测定结果偏低。
然而，在本法的测定条件下，溶血标本血红蛋白的浓度达10g/L，黄疽标本胆红素浓度达342μmol/L，维生素C小于30mg/L，均不影响测定结果。
氟化钠浓度达2g/L不干扰测定结果。
标本中含尿素浓度达46.7mmol/L，尿酸浓度达2.95mmol/L，肌酐浓度达4.42mmol/L。
半胱氨酸浓度达3.30mmol/L，甘油三酯浓度达5.6mmol/L，胆固醇4.40mmol/L，对测定结果均无显著影响。
左旋多巴100mg/L，维生素C5mg/L以上，谷胱甘肽100mg/L时，可引起负误差；半胱氨酸达10mmol/L时，产生相当0.72mmol/L葡萄糖的正误差。
实验40邻甲苯胺法测定血清（浆）葡萄糖
【原理】在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺缩合、脱水，生成希夫氏碱（Schiffbase），经分子重排生成蓝绿色化合物，其颜色深浅在一定范围内与血糖浓度成正比。
缩合脱水
邻甲苯胺＋葡萄糖葡萄糖基胺希夫氏碱蓝绿色化合物
【试剂】
1．0.38mol/L硼酸溶液称取硼酸24g，溶于蒸馏水800ml中，再用蒸馏水定容至1000ml，摇匀即可。
2．邻甲苯胺试剂称取硫脲（AR）1.5g，溶于冰醋酸（AR）700ml中。
将此液转入1L容量瓶内，加邻甲苯胺60ml，0.38mol/L硼酸溶液100ml，用冰醋酸定容至刻度。
此溶液应置棕色瓶内室温保存，至少可应用2个月。
新配制试剂应放置24h后待“老化”使用，否则反应产物的吸光度低。
3．100mmol/L葡萄糖标准贮存液见实验39。
4．5mmol/L葡萄糖标准应用液见实验39。
5．0.3mol/L三氯醋酸溶液称取三氯醋酸5g，溶于蒸馏水70ml中，然后用蒸馏水定容至100ml，混匀即可。
【操作步骤】
1．血清、血浆、脑脊液及清亮的胸腹水按表8-2操作。
表8-2邻甲苯胺法操作步骤
加入物（ml）
空白管
标准管
测定管
蒸馏水
0.1
－
－
葡萄糖标准应用液
－
0.1
－
血清（血浆、脑脊液）
－
－
0.1
邻甲苯胺试剂
3.0
3.0
3.0
混匀，置沸水中煮沸5min，取出置冷水中冷却3min，在630nm处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
2．严重黄疸、溶血及乳糜样血清制备无蛋白血滤液：
取血清0.2ml，加入0.3mol/L三氯醋酸溶液l.8ml，混匀，静置5min，离心5min，取上清液按表8-3操作。
表8-3溶血、脂浊、黄疸血清操作步骤
加入物（ml）
空白管
标准管
测定管
0.3mol/L三氯醋酸溶液
1.0
0.9
－
葡萄糖标准应用液
－
0.1
－
无蛋白血滤液
－
－
1.0
邻甲苯胺试剂
5.0
5.0
5.0
混匀，置沸水浴中煮沸12min，取出置自来水中冷却3min，在波长630nm处比色，以空白管调零，读取各管吸光度。
【计算】
【参考范围】3.89～6.11mmol/L。
【临床意义】见实验39。
【注意事项】
1．邻甲苯胺为浅黄色油状液体，易氧化。
配制前宜重蒸馏，收集199～201℃的馏出部分，此部分馏出液应为无色或浅黄色，然后加入盐酸经胺（1g/L）防止氧化，置棕色瓶密封避光保存。
2．邻甲苯胺在冰醋酸中并不十分稳定，易氧化产生棕色物质而干扰比色，故在邻甲苯胺试剂中加入硫脲，使试剂有抗氧化作用，减少棕色干扰，增加试剂的稳定性，降低空白管的吸光度，并有一定的增色效应。
3．硼酸与α-葡萄糖的羟基结合，能促进葡萄糖转变醛式构型，增加反应的活性。
4．沸水浴时沸水一定要盖过管内的液面，否则温度不均匀，影响显色。
5．此法受煮沸时间、比色时间、试剂存放时间等因素的影响。
一般不宜以校正曲线法进行计算，故每次应同时作标准管。
6．最终反应液偶尔会产生混浊，最常见原因是高脂血症。
此时，可向显色液3ml中加入异丙醇1.5ml，充分混匀。
溶解脂质可消除混浊，所测吸光度乘以1.5。
注射右旋糖酐时，由于右旋糖酐不溶于邻甲苯胺试剂而产生混浊。
冷水浴太冷时亦会出现混浊。
【评价】
1．准确度回收率98.6%～99.6%。
葡萄糖标准液在16.65mmol/L范围以内时，测得值与真值的相关系数为0.9996。
与己糖激酶（HK）法比较，结果十分相近；y（HK法）＝1.03x－0.8（mg/dl）。
邻甲苯胺法的结果略高于酶法，但差异并不明显。
2．线性范围可达30.8mmol/L。
3．精密度日内CV2%左右，日间CV不大于4%。
4．特异性和干扰邻甲苯胺法较Folin-Wu法特异，但不及酶法。
D-甘露糖能以相同的反应速率与邻甲苯胺试剂发生反应，产生与葡萄糖相似的吸收光谱，造成正误差。
果糖和戊糖与邻甲苯胺试剂发生反应，分别在375nm和480nm处产生吸收峰。
乳糖、麦芽糖和阿拉伯糖也可造成不同程度的干扰。
但在正常情况下，血中这些糖含量甚微，对测定结果影响不大。
轻度溶血无干扰，但1g/LHb能使结果增高0.11mmol/L。
胆红素171μmol/L无影响。
浓度达342μmol/L时测定结果偏高为1.39mmol/L。
重度脂血可使反应产生混浊，向最终反应液加异丙醇可消除。
实验41己糖激酶法测定血清（浆）葡萄糖
【原理】葡萄糖和三磷酸腺苷（ATP）在己糖激酶（hexokinase，HK）催化下，发生磷酸化反应，生成葡萄糖-6-磷酸（G-6-P）与二磷酸腺苷（ADP）。
G-6-P在葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G-6-PD）的催化下脱氢，生成6-磷酸葡萄糖酸（6-PGA），同时使NADP+还原成NADPH＋H+，还原型NADPH的生成速度与葡萄糖浓度成正比，在波长340nm监测吸光度升高速率，可计算血清中葡萄糖浓度。
【试剂】
l．酶混合试剂己糖激酶测定葡萄糖，多用试剂盒，目前国外生产试剂盒的厂家很多，但酶混合试剂的配方大同小异。
酶混合试剂的组成成分与浓度如下：
三乙醇胺盐酸缓冲液（pH7.5）50mmol/L
MgSO42mmol/L
ATP2mmol/L
NADP2mmol/L
HK＞1500U/L
G-6-PD2500U/L
根据试剂盒说明书配制，保存于4℃冰箱。
2．100mmol/L葡萄糖标准贮存液见实验39。
3．5mmol/L葡萄糖标准应用液见实验39
【操作】
1．速率法使用自动分析仪器。
仪器的操作程序，测定的主要参数（如系数、延迟时间、监测时间及次数、波长、被测样品和试剂用量、温度等）须按说明书进行。
2．终点测定法
（1）按表8-4加入样品及试剂：
表8-4己糖激酶法操作步骤
加入物（ml）
空白管
标准管
对照管
测定管
血清
－
－
0.02
0.02
葡萄糖标准应用液
－
0.02
－
－
生理盐水
0.02
－
2.0
－
酶混合试剂
2.0
2.0
－
2.0
（2）以上各管充分混合，在37℃水浴，准确放置10min，用蒸馏水调零，用5mm径比色皿，在340nm波长处读取各管吸光度。
【计算】
1．速率法
空白管以蒸馏水代替血清。
2．终点法
【参考范围】3.89～6.11mmol/L（空腹）。
【临床意义】见实验39。
【注意事项】
1．HK是关键的工具酶，必须使用高纯度产品，其比活性应＞140IU/mg酶蛋白（25℃）。
杂酶G-6-DP、谷胱甘肽还原酶、6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应＜0.01%HK活性单位，磷酸葡萄糖异构酶＜0.02%HK活性单位。
HK的最适pH6.0～9.0，pI为4.5～4.8。
Mg2+为HK的激活剂，EDTA为抑制剂。
2．G-6-PD亦是关键的工具酶，其纯度要求高，比活性应＞140IU/mg酶蛋白（25℃）。
杂酶磷酸葡萄糖变位酶和6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶均应＜0.01%G-6-PD活性单位，谷胱甘肽还原酶和磷酸葡萄糖异构酶均应＜0.02%G-6-PD活性单位。
以NADP+为辅酶的最适pH＞8.5，以NAD+为辅酶的最适pH为7.8。
3．NAD+或NADP+的纯度要求达98%以上。
4．对整个试剂的要求
（1）试剂空白在保温30min时吸光度小于0.1，保温6min与30min间吸光度变化＜0.01。
（2）33.3mmol/L葡萄糖标准液在保温30min后的吸光度在1.6～1.8之间，保温8min与30min吸光度之差＜0.01。
5．如用耐热的葡萄糖激酶代替HK，即可提高专一性，又可提高稳定性。
【评价】
1．线性范围可达33.31mmol/L，最高达40.8mmol/L。
2．准确度回收率99.4%～101.6%，平均为100.5%（样品含量为2.22、4．86、8.34mmol/L）。
3．精密度日内CV为0.6%～1.0%，日间CV为1.3%左右。
4．方法学比较与质谱法比较，y=1.02x－0.5。
与GOD-POD法比较，r=0.998，y=1.01x＋0.190。
5．特异性和干扰HK法最大优点是特异性相当高，干扰少。
HK对D－葡萄糖、D-甘露糖、D-果糖、D-葡糖胺均有催化作用，来源于牛脑和酵母的HK的最适底物是D-甘露糖和D-葡萄糖。
但G-6-PD的最适底物是G-6-P，对G-6-P具有高度专一性，对6-磷酸果糖和6-磷酸甘露糖不起作用，因此HK法的特异性很强。
轻度溶血、脂血、黄疽、维生素C、氟化钠、肝素、D-甘露糖、草酸盐、谷胱甘肽及某些药物如左旋多巴、肼苯哒嗪等均无干扰。
严重溶血（Hb2～5.12g/L）致使红细胞内有机磷酸酯及一些酶类释放，消耗NADP+，可使葡萄糖测定值下降6.6%～32%。
第二节血清（浆）糖化蛋白的测定
葡萄糖可以和体内多种蛋白质中的氨基不可逆地以共价键结合，这个过程不需要酶的参与，反应速度主要取决于葡萄糖的浓度。
这种被葡萄糖糖化的蛋白主要存在于糖尿病或其他高血糖患者中，糖化过程经常缓慢地进行，一旦形成，不再解离。
故对血糖或尿糖波动较大的患者来说，采用糖化蛋白来诊断或追踪病情的发展有其独特的临床意义，它可以反映较长时期以来的平均血糖浓度。
临床上测定的糖化蛋白主要有糖化血红蛋白（glycohemoglubin，GHb）和糖化血清蛋白（glycatedserumprotein，GSP）。
测定糖化蛋白的方法有比色法、电泳法、等电聚焦法、离子交换层析法、高效液相层析法、亲和层析法、免疫化学法、毛细管电泳法等。
国内以比色法、离子交换层析法及电泳法较常用。
实验42微柱法分离糖化血红蛋白
【原理】带负电荷的Bio-Rex70阳离子交换树脂与带正电荷的HbA及HbA1有亲和力，但由于HbA1的两个β链N-末端正电荷被糖基清除，正电荷较HbA少，二者对树脂的亲和力不同。
用pH6.7磷酸盐缓冲液可首先将带正电荷较少、吸附力较弱的HbA1洗脱下来，用分光光度计测定洗脱液中的HbA1占总Hb的百分数。
【试剂】
1．0.2mol/L磷酸氢二钠溶液称取无水Na2HPO428.369g，溶于蒸馏水中并定容至1L。
2．0.2mol/L磷酸二氢钠溶液称取NaH2PO4·2H2O31.206g，溶于蒸馏水中并定容至1L。
3．溶血剂取0.2mol/L磷酸二氢钠25ml，加TritonX-100100mg，加蒸馏水定容至100ml。
4．磷酸盐缓冲液（pH6.7）取0.2mol/L磷酸氢二钠100ml，0.2mol/L磷酸二氢钠150ml，加蒸馏水定容至1L。
5．磷酸盐缓冲液（pH6.4）取0.2mol/L磷酸氢二钠300ml，0.2mol/L磷酸二氢钠700ml，加蒸馏水300ml，混匀即成。
6．Bio-Rex70阳离子交换树脂200～400目，钠型，分析纯级。
【操作】
1．树脂处理称取树脂10g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液30ml，搅匀，置室温30min，间常搅拌2～3次。
然后加浓盐酸数滴，调至pH6.7，弃去上清液。
用蒸馏水约50ml洗1次，用磷酸盐缓冲液（pH6.4）洗2次，再用磷酸盐缓冲液（pH6.7）洗4次即可。
2．装柱将树脂加磷酸盐缓冲液（pH6.7）搅匀，用毛细滴管加入塑料微柱内，使树脂床高度达3～4cm即可，树脂床应均匀，无气泡无断层即可。
3．血红蛋白溶液的制备取EDTA抗凝血或毛细管血20μl，加入生理盐水2.0ml中摇匀，离心弃上清液，仅留下细胞。
加溶血剂0.3ml，摇匀，置37℃水浴中15min，以除去不稳定的HbA1。
4．柱的准备将微柱摇动使树脂混悬，然后去掉上下盖，将柱插入1.5cm×15cm的试管中，让柱内缓冲液完全流出。
5．上样用微量加样器取血红蛋白溶液100μl，加至微柱内树脂床上，待其完全进入树脂床后，将柱移入另一支1.5cm×15cm的试管中。
6．洗脱取磷酸盐缓冲液（pH6.7）3ml缓缓加至树脂床上，注意勿冲动树脂。
收集洗脱液，此即为HbA1（测定）。
7．对照取上述血红蛋白溶液50μl，加蒸馏水7.5ml，摇匀，此即为总Hb管。
8．比色以蒸馏水作空白，于415nm波长测定各管吸光度。
9．柱的清洗用过的柱先加磷酸盐缓冲液（pH6.4）3ml，使Hb全部洗下、再用磷酸盐缓冲液（pH6.7）洗3次，每次3ml。
最后加磷酸盐缓冲液（pH6.7）3ml，加上下盖，保存备用。
【计算】
【参考范围】HbA1：
6.59%
0.69%。
【临床意义】糖化血红蛋白测定用于评定糖尿病的控制程度，当糖尿病控制不佳时，糖化血红蛋白浓度可高至正常2倍以上。
因为糖化血红蛋白是血红蛋白生成后与糖类经非酶促结合而成的。
它的合成过程是缓慢的，而且是相对不可逆的，持续于红细胞120天生命期中，其合成速率与红细胞所处环境中糖的浓度成正比。
因此，糖化血红蛋白所占比率能反映测定前1～2个月内平均血糖水平，现已成为反映糖尿病较长时间血糖控制水平的良好指标。
【注意事项】
1．层析时一般在28℃较为适宜，冬季应将柱置于28℃温箱中洗脱。
2．HbA1不能和HbF、HbH及HbBart’s分开，有前述异常血红蛋白病者不宜用此方法。
3．标本置室温超过24h可使结果增高，贮4℃冰箱可稳定5天。
4．抗凝剂EDTA和氧化物不影响结果，肝素可使结果增高。
实验43果糖胺法测定糖化血清蛋白
【原理】血清蛋白质分子中的末端氨基能与葡萄糖经非酶促反应生成高分子酮胺结构。
其生成量直接与血糖浓度有关，并且和糖化血红蛋白高度相关。
在碱性溶液中，这种酮胺结构与硝基四氮唑蓝（NBT）发生还原反应，产生紫红色甲臢然后以具有同样氨基-1-脱氧-2-酮糖结构的1-脱氧-1-吗啉果糖（DMF）为标准同时操作，作比色测定。
【试剂】
1．0.1mol/L碳酸盐缓冲液（pH10.8）无水碳酸钠9.54g，碳酸氢钠0.84g，溶于蒸馏水并定容至1000ml。
2．0.11mmol/LNBT试剂称取氯化硝基四氮唑蓝100mg，用上述缓冲液溶解并定容至1000ml。
置冰箱保存，至少可稳定3个月。
3．40g/L牛血清白蛋白溶液。
4．4mmol/LDMF标准液称取DMF99.6mg，溶于40g/L牛血清白蛋白溶液100ml中。
【操作】
1．样本的测定按表8-5操作。
2．
表8-5血清（血浆）DMF测定步骤
加入物（ml）
空白管
待测管
血清（血浆）
－
0.1
蒸馏水
0.1
－
NBT（37℃预温）
4.0
4.0
混匀，置37℃水浴中15min，取出试管在流水中冷却15min（＜25℃），于550nm波长处空白管调零，读取测定管吸光度，从校正曲线上查出DMF浓度。
2．校正曲线制备
取4mmol/LDMF标准液用牛血清白蛋白溶液（40g/L）稀释成1、2、3、4mmol/L，并以40g/L牛血清白蛋白为空白，与测定管同样操作，读得各浓度DMF相应的吸光度。
以DMF浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，制成校正曲线。
糖化血清蛋白浓度在4mmol/L内与吸光度呈线性关系。
【参考范围】1.9
0.25mmol/LDMF。
【临床意义】
1．血清蛋白半寿期较短（血清白蛋白17天，总蛋白30天，Hb为120天），本试验可有效地反映患者过去1～2周内的血糖控制水平。
2．本试验不受临时血糖浓度波动的影响，对糖尿病人的诊断和较长时间血糖控制水平的观察，以及同一患者前后连续检测结果的比较具有一定的价值。
【注意事项】
1．必须严格控制pH值、反应温度及反应时间。
2．37℃加温15min时间需正确掌握并立即冷却，否则颜色将继续加深影响结果。
所以在测定时宜加测已知浓度DMF的质控管，以观察与校正曲线的符合程度。
有人认为改用加入10%乙酸0.1ml，比用物理冷却终止效果更佳，可使pH降至7.0以下而有效地终止反应。
3．DMF的合成方法称取无水D-葡萄糖90g（0.5mol），吗啡啉58g（0.67mol），加蒸馏水1L，溶解后在60～70℃水浴上搅拌，开始为黄色糊状物，后颜色逐渐加深。
20min后，移去水浴，缓慢地加入丙二酸18g（0.17mol）。
整个加入过程需在10min以上。
再置水浴并使温度上升至80℃，不断搅拌，颜色逐渐由黄绿色转变为琥珀色。
10min后，加入无水乙醇70ml，维持75℃30min，再加入丙酮70ml。
此时可见到结晶析出，此即为DMF。
放4℃冰箱过夜，收集结晶，并用无水乙醇重结晶3次，使产物脱色纯化，干燥备用。
熔点146～147℃，
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