色谱概论.docx

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色谱概论

第二部分色谱分离分析技术

第十三章色谱分离技术概论

13.1色谱法的发展和分类

1、色谱法的发展

1906年：

Tsweet的实验发现和提名。

30~40年代：

薄层色谱与纸色谱。

1952年Martin创立气相色谱法。

1956年：

Golay提出开口柱理论，发展毛细管色谱法。

60年代：

气相色谱质谱联用，定性。

70年代：

高效液相色谱法和薄层扫描法。

80年代以后：

超临界流体色谱法、高效毛细管色谱法等，色谱与计算机联用智能化发展。

90年代后：

联用和应用。

新型固定相和检测器：

如亲和色谱的手性固定相；蒸发光散射检测器和半导体激光荧光检测器等。

2、色谱法的分类

分类方法流动相操作方式

┍→气相色谱法填充柱色谱法│毛细管柱色谱法│┍→柱色谱法经典液相色谱法││高效液相色谱法

││

色谱法╋→液相色谱法╋→平面色谱法薄层色谱法││纸色谱法│└→逆流分配色谱法│└→毛细管电泳法CE

└→超临界流体色谱法1）按固定相与流动相分类

2）操作方式分类：

柱、平面、逆流分配色谱和毛细管电泳法。

3）分离机理分类：

吸附色谱：

用吸附剂作固定相，利用组分在吸附剂上的

吸附能力（吸附系数）不同而分离。

分配色谱：

用液体作固定相，利用组分在固定相与流动相的

溶解度（分配系数）不同而分离。

体积排阻色谱：

以一定尺寸多孔固体为固定相，按

分子大小不同进行分离。

离子交换色谱：

离子交换树脂为固定相，利用样品离子与固定相交换基团交换能力差别而分离。

亲和色谱：

将具生物活性（酶、辅酶、抗体等）的配位基键合到非溶性载体或基体表面形成固定相，利用蛋白质或生物大分子与配位基的亲和力的不同分离。

化学键合相色谱：

将一定性质的化学官能团键合在载体表面形成的固定相的色谱法。

毛细管电色谱：

各组分在固定相和流动相的分配系数与电泳速度不同而分离。

毛细管电泳法：

各组分在流动相的电泳速度不同而分离。

3、色谱分析的全过程

1）样品的采集：

取样点的选择、样品的收集、运输、贮存。

2）样品的制备：

将欲测组分与样品基体和干扰组分分离、富集，并转化成色谱仪器可分析的形态。

3）色谱分析：

色谱分离条件选择与分析方法。

4）数据处理：

灵敏度、线性范围、稳定性、重现性、结果分析。

13.2色谱法的基本理论

13.2.1色谱参数

1、色谱流出曲线与色谱峰

色谱流出曲线：

[投影]

基线：

基线、噪声RN、漂移d[投影]

色谱峰：

1）不对称因子fS=（B+A）/2Ax=h/20[投影]

fS<0.95前延峰

fS=0.95~1.05正常峰

fS>1.05拖尾峰

2）色谱峰参数的应用：

峰位------定性参数：

保留时间、体积、比移值、保留指数

胖瘦------柱效参数：

标准差σ、半峰宽W1/2、峰宽W

峰间重叠----分离参数

峰高、峰面积-----定量参数

总结：

从色谱流出曲线中，可得许多重要信息：

a根据色谱峰的个数，可以判断样品中所含组分的最少个数；

b根据色谱峰的保留值，可以进行定性分析；

c根据色谱峰的面积或峰高，可以进行定量分析；

d色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱柱分离效能的依据；

e色谱峰两峰间的距离是评价固定相（或流动相）选择是否合适的依据。

2、定性参数

1）保留时间：

保留时间tR、死时间t0、调整保留时间t’=tR-t0

保留体积:

保留体积VR、死体积V0、调整保留体积V’=VR-V0

V=F.tF流速

2）相对保留值:

r2,1=tr2/tr1´=Vr2/Vr1=

柱温及固定相性质有关，而与柱径、柱长、填充情况及流动相流速无关，在气相色谱法中，广泛用作定性的依据。

相对保留值往往可作为衡量固定相选择性的指标，又称选择因子

（3）保留指数I：

化合物在一定温度下在某固定液上的相对保留值

公式：

其中：

X为调整保留值（t/或V/；保留温度T）；i被测物；Z；Z+n是具Z个和Z+n个碳原子数的正构烷

要求XZ

特点：

同一物质在同一柱上，I正比于柱温，准确度和重现性都好，误差小于1%。

即不需标准物质，而用文献的数据可以定性。

举例投影在阿皮松柱上，柱温100℃，正庚烷、正辛烷、乙酸正丁酯的调整保留距离分别为174.0mm，373.4mm,310.0mm求乙酸正丁酯的保留指数I。

3、柱效参数-峰宽：

n；σ；W1/2；W

参数间的关系[投影]

（1）标准差σ----0.607h处的峰高，不易测量。

H板高;S柱横截面积;流动相占截面积的分数φ;L指定的柱长

（2）半峰宽W1/2=2.355σ易于测量

（3）峰底宽W=4σ=1.699W1/2

理论塔板数n=

塔板高度H=L/n

4、分离参数RS

若要使A、B组分完全分离，必须满足以下三点：

第一，两组分的分配系数必须有差异；

第二，区域扩宽的速率应小于区域分离的速度；

第三，在保证快速分离的前提下，提供足够长的色谱柱。

分离度R=

>1.5时，分离达99.7%，为完全分离。

影响R的因素及关系式：

R=

柱效、选择项、容量项

改变各因素，R值的变化[投影]

R、k、α之间关系图[投影]

5、相平衡参数---基本原理1

（1）分配系数K=CS/Cm

（2）分配比（容量因子）k=WS/Wm=CSVS/CmVm=KVS/Vm

保留能力的重要参数

实验求算:

k=（tR-t0）/t0

（3）相比率β=Vm/VS=K/k；

气相色谱中：

a填充柱β=5-35

b毛细管柱β=50-200β∝r/df

其中：

r为柱内径；df为液膜厚度。

（4）分配系数与保留值关系式：

tR=t0（1+KVs/Vm）

13.2.2色谱的两个基本理论

1、塔板理论

基本假设：

1）一个塔板内，组分快速达到平衡？

2）流动相脉冲式输入和流动？

3）纵向扩散忽略？

4）各塔板内分配常数K相等。

解决问题：

1）流出曲线的形状：

两项式分布。

2）浓度极大点的位置。

3）柱效的评价方法。

理论塔板数n=

缺陷：

影响理论塔板数的因素是什么？

2、范氏方程---速率理论

关系式H=A+B/u+Cu

在气相色谱中

[投影]流速与流出曲线

（1）A项[投影]：

涡流扩散项A=2λdp

λ---填充不规则因子,与填料颗料大小、分布范围、填充均匀性有关。

dp-----固定相颗粒的直径

问题：

开口（空心）柱A=？

（2）B项：

纵向扩散或分子扩散项B=

：

弯曲因子（≤1）；填充柱0.5~0.7；空心柱

=？

：

组分在气相中的扩散系数Dg∝

（3）C项：

传质阻力项

填充柱

开口毛细管柱

讨论:

中等线速时，Cg项可忽略；

对于低固液固定相柱，高流速下必须考虑Cg项。

结论：

气相色谱的柱效要考虑固定相填充的均匀性、载体粒度大小、载气种类、流速、柱温、固定液膜厚度等。

在液相色谱中

气相与液相的差异：

扩散系数气体是液体的105倍

粘度液体是气体的102倍

表面张力液体是气体的104倍

密度液体是气体的103倍

压缩性液体无压缩性

A项：

A=2λdp降低dp，但太小难填充均匀。

降低λ，要装柱求匀浆法。

B项：

B=

因Dm∝T/η；如实际流速是最佳流速的3~10倍，可忽略B项。

C项：

其中：

df是固定相液膜厚度；dp固定相颗粒直径。

结论：

在高效液相色谱法的柱效要考虑填充均匀性、降低固定相颗粒直径、流动相粘度要小，温度适当提高、流速适当降低

其它因素：

要求和消除：

降低柱前后（死体积）的扩散。

13.3色谱的定性方法

1、保留值对比定性

（1）标准品保留值对照：

保留时间：

tR;

调整保留时间比值α----与温度、固定液有关（GC）

保留温度T（GC）

标准加入增加峰高法（注意用双柱比较）

（2）文献值对照：

保留指数I----与柱温、固定流动相有关，色谱条件无关

精确度达±0.03,首先要知道组分属于那一类,再用该类化合物所用的固定相和柱温色谱条件,常应用于GC

缺点:

标准物为正构烷烃,在极性柱溶解度小,易超载;烷烃沸点低.

解决:

同系物为标准,与正烷烃比较转换:

I2=I1+SU

恒温多环芳烃程序升温

程序升温

（3）保留值规律:

双（多）柱规律

碳数规律

沸点规律

柱温规律

注意:

死时间;载体吸附;进样量,载气纯度对保留值都有影响.

**多个选择检测器联用定性:

2、仪器联用法：

离线或在线联用，

如[GC，HPLC，TLC]------[MS，FTIR，NMR，UV等]。

3、色谱峰纯度检查

二极管阵列可见紫外检测器----------吸收曲线比较

质谱检测器-------------------------------质谱比较法

13.4色谱定量测定方法

1、数据正确记录

W=f.A

A=1.065h.W1/2

W物质质量；A峰面积；h峰高；W1/2半峰宽；f校正因子。

（1）峰的识别:

峰检出灵敏度slope设定；基线漂移

峰的平滑化：

（2）基线的建立和修正

（3）重叠峰的的分割和基线漂移值的设定

（4）峰面积和峰高的测量与选择：

峰高---分离度小；保留时间小半峰宽小

峰面积------分离度好；归一化法；程序升温法；不正常峰

（5）时间程序设定

（6）自动程序参数:

峰宽、斜率、漂移、最小峰面积、变参时间、锁定时间、衰减、样品量、内标量、校准次数等。

（7）基线扣除

（8）时间窗定性;ID表;多图谱重叠比较---注意修正

2、定量分析方法

（1）校正因子

外标法：

W=f.Af为校正因子

内标法：

f/=fi/fsf/相对校正因子

（2）校正因子的测定

配制一系列已知浓度的待测组分和内标物的混合液。

在实测条件下取不定期对上述混合液进样测定目标组分和内标物峰面积，计算f和f/值。

（3）定量分析法

外标法-----标准曲线法

校正因子（f）外标法

内标法-----标准曲线法

相对校正因子（f/）法

归一法和校正归一法。

标准加入法:

注意:

定量参数:

峰面积;必须在线性范围内;不超载进量;正常峰

方法比较:

归一法:

定量要求不高,校正因子已知

外标法:

大含量的分析样品,操作条件重复稳定。

内标法：

低含量的分析样品,

13.5色谱定量测定方法建立

1、检测方法资料搜集

（1）样品的性质和来源

（2）被测组分和杂质的物化性质

（3）常见检测方法和色谱分离条件？

（4）选择检测器

（5）样品液中被测组分浓度、标准溶液浓度的配制

2、色谱条件选择

（1）选择分离柱、一般流动相进行分离，确认目标组分峰位保留值

（2）运用梯度分离和改变色谱分离条件，使目标组分达最好的分离度

空白液在目标组分出现的保留值没有干扰峰

（3）确定流动相组成和温度、流速；检测器灵敏度；样品液浓度。

3、溶液的配制

（1）样品液的制备

（2）空白液的制备

（3）标准液贮备液配制

（4）标准曲线中标准浓度系列溶液配制

4、溶液测定、数据记录、处理

（1）标准曲线绘制

（2）精密度测定

重复性:

同室;同时间/人/设备

中间精密度:

同室;不同时间/人/设备

重现性:

不同室;不同时间/人/设备

（3）样品液中被测组分含量测定

（4）不同批次样品液重现性测定（三批）

（5）样品液稳定性测定

5、方法回收率测定----标准加入法

仪器测定准确性

测定方法准确性

（1）溶液配制:

被测组分在原溶液与加入标准品量比（4:

6）、（5:

5）、（6:

4）

（2）进样测定:

（3×3