抗血清制备及抗体效价测定.docx
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抗血清制备及抗体效价测定
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NDV抗血清制备及抗体效价测定
摘要:
抗血清,新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病毒分类学中的位置属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属(Paramyxovirus)中的一个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡,在被侵袭的鸡群中迅速传播,强毒株可使鸡群全群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗(Ulster2C株)灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠,制备新城疫病毒抗血清。
也叫免疫血清,是指含有免疫蛋白的血清。
抗体效价指抗体的物理状态及其在体内滞留时间,以其与抗原反应的多少来表示其免疫效果。
此次实验主要是进行家兔与小鼠的新城疫病毒抗血清的制备过程,并通过酶免疫吸附试验、兔疫印迹实验对其进行抗体效价检测。
关键字:
NDV抗血清抗体效价免疫
【实验过程】
本次实验一共分为四个大步骤:
PartⅠ.NDV抗血清制备
一、实验原理
将具有免疫原性的物质注入健康动物体内后,抗原可刺激机体相应B细胞增殖、分化形成浆细胞并分泌特异性抗体。
待动物血清中存在大量抗体时,采集动物血液,分离析出血清,便得到所需的抗血清(免疫血清或抗体)。
由于抗原性物质通常具有多个抗原决定簇,可以刺激机体产生多种抗体形成细胞克隆,合成和分泌各种抗原决定簇的抗体,免疫血清中
实际上是含有多种抗体的混合物,所以这种免疫法获得的免疫血清又称为多克隆抗体(Polyclonalantibody,PcAb)。
多克隆抗体的制备是一个复杂的过程,为了获得特异性强,
效价高的抗血清,除了抗原的因素外,还需注意动物品系的选择、抗原注射的浓度、剂量、
次数、间隔时间及注射途径等。
对于免疫原性较弱的可溶性抗原(如蛋白质类抗原)要加入佐
剂,以增强免疫性。
本实验介绍新城疫病毒(Newcastlediseasevirus,NDV)抗血清的制备过程。
新城疫病
毒(Newcastlediseasevirus,NDV)又称亚洲鸡瘟病毒、伪鸡瘟病毒或禽肺脑炎病毒。
在病
毒分类学中的位置属于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、副黏病毒属(Paramyxovirus)中的
一个种。
该病毒主要危害鸡、珠鸡和火鸡,在被侵袭的鸡群中迅速传播,强毒株可使鸡群全
群毁灭。
以新城疫病毒灭活疫苗(Ulster2C株)灭活油剂苗多种途径免疫兔和小白鼠,制
备新城疫病毒抗血清。
二、实验仪器、材料和试剂
1.仪器
5mL无菌冻存管,2.5mL和1mL注射器,塑料静脉插管,碘酒,75%酒精棉球,剪刀,止血钳,250mL无菌三角瓶,50mL无菌尖底离心管,家兔固定槽,家兔解剖台,棉线,5mL吸头和移液器,温箱,离心机。
2.材料
家兔:
1-2kg清洁级雄性或未孕雌免;小鼠:
SPF级6-8周龄昆明鼠。
3.试剂
鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗(南京梅里亚动物保健公司),0.01MPBS(pH7.2)
(8gNaCl,0.2gKCl,2.9gNa2HPO4.12H2O,0.2gKH2PO4,以NaOH调节pH至7.2,加双蒸水至1000mL),麻醉剂:
普鲁卡因溶液,硫柳汞。
三、方法和步骤
(一)NDV兔抗血清制备
1.家兔捉拿方法
动物的捉拿和固定是进行动物实验的基本操作之一,正确的抓取固定动物是为了不损害
动物健康,不影响观察指标,并防止被动物咬伤,保证实验顺利进行。
家兔习性温顺,除脚
爪锐利应避免被其抓伤外,较易捕捉。
拿时切忌以手提抓兔耳、拖拉四肢或提拿腰背部。
正
确的方法是用右手抓住其颈背部皮毛,轻提动物,再以左手托住其臀部,使兔的体重主要落
在左手掌心(如图1)。
图1.家兔的捉拿方法
2.家兔固定方法
家兔的固定,依不同的实验需要,常用兔固定箱或兔手术台固定。
兔固定箱通常由木头、铁皮或者树脂材料制成,便于拆卸清洗消毒,一般用于固定兔子狐狸貉子等。
使用时时可将家兔置于兔固定箱内,在不需要帮手的情况下单人即可对兔子等动物打耳号,灌药、耳缘静脉注射、取血、或观察耳部血管的变化等,常用于生理、药理和免疫等作动物整体实验时限制实验物的活动。
(如图2)
图2.家兔固定箱固定方法
在需要观察血压、呼吸和进行颈、胸、腹部手术时,应将家兔以仰卧位固定于兔手术台
上。
固定方法是:
先以四条1cm宽的布带作成活的圈套,分别套在家兔的四肢腕或踝关节
上方,抽紧布带的长头,将兔仰卧位放在兔手术台上,再将头部用兔头固定器固定,然后将
两前肢放平直,把两前肢的系带从背部交叉穿过,使对侧的布带压住本侧的前肢,将四肢分
别系在兔手术台的木柱上。
(如图3)
图3.家兔手术台固定方法
3.初次免疫
在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位,选择6~10处免疫接种
点,采用皮下、皮内或肌肉注射,每点注射上述鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗0.1~
0.2mL。
如果使用没有加佐剂的灭活新城疫病毒Ulster2C株,也可以采用耳缘静脉注射的方法进行免疫。
(如图4)
图4.家兔耳缘静脉注射方法
4.二次免疫
第一次免疫后间隔2周再以鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗采用与初次免疫相同的方法在家兔足掌、腋窝淋巴结周围、背部两侧、颌下、耳后等部位,选择6~10处免疫接种点,采用皮下、皮内或肌肉注射加强免疫。
5.终末免疫
第二次免疫后间隔2周再按上述二次免疫方法进行第三次免疫。
6.试血
终末免疫免疫7天后经兔耳缘静脉采血2mL,分离血清,用琼脂双向扩散实验测定抗
体效价达1:
16以上(稀释抗体)以上时,即可放血,如效价不高,则加强免疫l次后,再
行检测。
7.颈动脉放血
将免疫家兔仰面固定于家兔手术台上,头部放低,暴露颈部。
沿气管钝性分离皮下组织,暴露气管前的胸锁乳突肌;分离胸锁乳突肌与气管间的颈三角区疏松组织,在肌束下面靠近气管两侧,可见淡红色搏动的颈动脉。
(如图5)
图5.兔颈部血管神经分布图
将双侧动脉仔细分离,于每侧动脉分别套入两根棉线,一根在远心端,一根在近心端,
(图6)。
图6.兔颈部动脉血管
先将一侧动脉远心端丝线结扎紧,然后在近心端用止血钳夹住(止血钳头部用细塑料管包裹,避免损伤动脉)。
用小的尖头眼科剪在两侧丝线中间的动脉壁上剪开一个小口,以便插入塑料静脉插管(或大号钢针头),再用近心端棉线固定静脉插管,避免其从动脉内滑出;轻轻松开止血钳,血液很快沿导管流入三角瓶,直至血流缓慢点滴而出时,以同法在对侧动脉内插管放血,并将动物固定架后端抬高,增加放血量,一般一只家兔可放血80-100mL。
8.血清分离
将血液置室温中凝固约1hr,然后置4℃过夜,使血块收缩;用5mL无菌移液管吸取上层血清,转移至50mL无菌尖底离心管中。
然后将血块自容器壁分离,将血清全部倾入另一50mL无菌尖底离心管,在4℃下2,500g离心10分钟,取上清液即血清部分与前述血清混合,将混合血清4℃1,500g离心10分钟,弃沉淀收集血清。
9.抗血清保存
(1)4℃保存:
将抗血清除菌后,加入0.0l%硫柳汞或0.1%叠氮钠,液体状态保存于
普通冰箱,可以存放3个月到半年,效价高时,一年之内不会影响使用。
(2)低温保存:
将抗血清除菌后,加入等量甘油,放在-20℃或-40℃,一般保存5年
抗体效价不会有明显下降。
抗体切忌反复冻融,反复冻融会使抗体效价显著降低。
(二)NDV鼠抗血清制备
1.小白鼠的捉拿和固定
小白鼠较大白鼠温和,虽也要提防被其咬伤手指,但毋需戴手套捕捉。
可先用右手抓住
鼠尾提起,置于鼠笼或实验台上,用左手的拇指和食指抓住小鼠两耳后颈背部皮肤,将鼠体
置于左手心中,拉直后肢,以无名指及小指按住鼠尾部即可。
有经验者可直接用左手小指钩
起鼠尾,迅速以拇指利食指、中指捏住其耳后项背部皮肤亦可。
如操作时间较长,也可固定
于小白鼠固定板上。
(如图7)
图7.小白鼠的捉拿和固定
2.初次免疫
分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗
0.2mL,或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗0.2mL。
(1)腹腔注射法:
小鼠固定后,使腹部朝上,颈部拉直,右手持注射器(5~6号针头),
从耻骨联合上一侧向头端以30度角刺入腹腔(应避开膀胱)。
可先刺入皮下2~3mm,再刺入腹腔,以防药液外漏。
针头刺入部位不宜太高太深,以免刺破内脏。
注射量一般为0.1~0.25mL/10g鼠重。
图8.小鼠腹腔注射法
(2)皮下注射法:
一般两人合作。
一人左手抓住小鼠头部皮肤,右手拉住鼠尾;另一
人左手提高背部皮肤,右手持住注射器(针头号同上),将针头刺入提起的皮下。
若一人操
作,左手小指和手掌夹住鼠尾,拇指和食指提起背部皮肤,右手持注射器给药。
一般用量为
0.05~0.25mL/10g鼠重。
图9.小鼠皮下注射法
(3)肌肉注射法:
两人合作时,一人抓鼠方法同上,另一人左手拉直一侧后肢,右手持注射器,注射部位多选后腿上部外侧(针头号同上)。
如一人操作,抓鼠方法类似腹腔注射,只是药液注射在肌肉内,每腿的注射量不宜超过0.1mL。
(4)尾静脉注射法:
将小鼠置于待置的固定筒内,使鼠尾外露,并用酒精或二甲苯棉球涂擦,或插入40℃~50℃温水中浸泡片刻,使尾部血管扩张。
左手拉尾,选择扩张最明显的血管;右手持注射器(4~5号针头),将针头刺入血管,缓慢给药。
如推注有阻力而且局部变白,说明针头不在血管内,应重新插入。
穿刺时宜从近为尖部1/3处静脉开始,以便重复向上移位注射。
一般用药量为0.1~0.2ml/10g,不宜超过0.5ml/10g。
图10.鼠尾皮下注射法
3.二次免疫
第一次免疫后间隔2周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒
Ulster2C株灭活疫苗0.2mL,或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗0.2mL。
4.终末免疫
第二次免疫后间隔2周分别在昆明鼠背部采用肌内、皮下或皮内注射鸡新城疫病毒
Ulster2C株灭活疫苗0.2mL,或者腹腔注射鸡新城疫病毒Ulster2C株灭活疫苗0.2mL。
5.试血
末次注射7天后鼠眼球采血0.2mL,分离血清,用琼脂双向扩散实验测定抗体效价达
1:
16以上(稀释抗体),即可放血,如效价不高,继续加大剂量,加强l-2次后,常可使效
价增高。
鼠眼球采血可采用以下两种方法:
(1)眼眶后静脉丛采血:
用7~10cm长的玻璃取血管,其一端内径为1—1.5mm,另
一端逐渐扩大,细端长约1cm即可,将其尖端折断,使其锋利。
将取血管浸入1%肝素或其它抗凝剂溶液处理,干燥后使用。
采血时,右手提免疫后昆明鼠鼠尾,鼠头朝下将鼠旋转离心甩动1min,左手拇指和食指抓住鼠两耳之间的皮肤使鼠固定,并用中指配合,轻轻压迫颈部两侧,阻碍静脉回流,使眼球充分外突,提示眼眶后静脉丛充血。
取用肝素过的医用毛细采血管,右手拇指、食指和中指握住毛细管,将其尖端插入内眼角与眼球之间,轻轻向眼底方向刺入约2~3mm,手指旋转捻动毛细管以刺破