目的基因克隆之欧阳育创编.docx
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目的基因克隆之欧阳育创编
一、目的基因克隆的策略有哪些？
其理论依据什么？
如何根据具体条件，如目的性状的特点，已知控制目的性状的基因的信息合理选择基因克隆的方法？
时间：
2021.02.04
创作：
欧阳育
1、主要有以下几个克隆的策略：
（1）PCR法分离目的基因：
从蛋白质的一级序列分析得到核酸序列的相关信息，设计简并引物，通过对mRNA进行反转录得到cDNA，以cDNA为模板，然后将目的基因通过PCR方法扩增，或者直接从基因组DNA扩增的方法。
（2）核酸杂交的方法：
通过对蛋白质的氨基酸序列分析，设计简并引物，通过核酸杂交的方法从基因文库中筛选得到目的基因。
（3）免疫学筛选法分离目的基因：
利用免疫学原理，通过目的蛋白的特异抗体与目的蛋白的专一结合，从表达文库中分离目的蛋白基因。
2、若控制该性状的目的蛋白质不容易分离纯化，这PCR方法比较适宜，若蛋白质分离纯化容易，且有现成的基因文库，则后两种方法较为简单。
二、蛋白组学方法克隆目的基因的理论依据是什么？
有哪些技术环节？
要用到哪些技术？
1、理论依据：
以分离纯化的目的蛋白为研究起点，通过对目的蛋白的一级结构分析，获得起码的氨基酸序列信息后，反推可能的DNA序列，然后设计引物，从cDNA中将目的基因扩增出来，或者设计核酸探针，通过杂交技术将目的基因从基因文库中筛选出来。
或通过抗体抗原免疫反应从表达文库中将该基因分离出来。
2、技术环节是确定并制备出高纯度的蛋白质。
3、所需要的实验技术有：
蛋白质的双向电泳技术，由第一向的等电聚焦电泳和第二向的SDS-PAGE电泳组成；蛋白质氨基酸序列分析。
三、基因组学方法克隆基因的策略有哪些？
各有什么特点？
如何选择恰当的基因组学方法克隆目的基因？
1、基因文库筛选方法
通过对基因文库的筛选将目的基因分离出来，一般有两种方法：
核酸杂交法，原理是分子杂交；PCR筛选法，通过ＰＣＲ方法将目的基因分离出来，对于以混合形式保存的文库，先将文库分成几份，每份为一个“反应池”进行PCR反应，待选出阳性池后，将阳性池的混合克隆稀释，然后等量分置96孔板中，进行横向池及纵向池的ＰＣＲ反应，然后将阳性菌落群进行稀释，重复上述工作，直到筛出阳性单克隆。
2、图位克隆目的基因
利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，利用分子标记技术对目的基因进行精细定位，用获得的与目的基因紧密连锁的分子标记筛选基因文库的方法。
主要有染色体步移法、染色体登陆、跳查和连接法；外显子捕捉和cDNA直选法等。
3、插入突变分离克隆目的基因
由重组DNA技术衍生出的插入突变，可人为地造成某一待研究基因的突变，并可根据由此带来的表型特征的改变分析该基因的功能。
基因插入突变的方法主要有：
插入失活突变；T－DNA标签；转座子标签。
4、相邻片段的体外克隆
（1）PanhandlePCR法
在限制酶消化的DNA3＇端加一个与未知序列上游已知序列互补的单链引物，从而使经变性后产生的单链DNA分子内聚合，导致已知DNA定位于未知相邻DNA侧翼区段。
引物设计是该技术运用的关键所在，所需引物包含一个与已知序列上游互补的单链引物和两对位于该单链引物两侧与已知序列一致的引物。
（2）CassettePCR法
利用Cassette及Cassette引物特异性快速扩增cDNA及基因组DNA未知区域的一种有效方法。
由于Cassette的5＇端没有磷酸基，在目标DNA的3＇端和Cassette的5＇端的连接部位形成缺口，在第一次PCR反应的第一循环时，从引物C1开始的延伸反应在连接部位终止，从而控制了非特异性的扩增。
只有从引物S1开始延伸合成的DNA链，才能成为引物C1的模板，进行DNA的扩增反应。
再用内侧引物（引物C2,引物S2）进一步进行第二次PCR反应时，能高效特异性地扩增目的DNA。
克隆目的基因的方法：
若目的基因的序列未知，则采用相邻片段的体外克隆的方法；若目的基因的序列已知，有现成的基因文库，则采用基因文库筛选方法较好；若有合适的分子标记，则用图位克隆的方法较好；若需研究目的分子的功能，则采用插入突变分离克隆目的基因的方法较好。
四、功能基因组学策略克隆目的基因的方法有哪些？
各有什么特点？
如何解决其中的假阳性克隆问题？
1、RT-PCR扩增
这种方法专一性强，但是操作过程比较麻烦，特别是mRNA很不稳定、生存时间短，所以要求的技术条件较高。
2、mRNA差异显示技术
该方法以RT-PCR和DNA凝胶电泳为基础，实验简便，灵敏度高，耗时短，可同时比较多个样品间基因表达的差异，可同时检测到上调和下调的基因，但这种方法对低丰度的mRNA检出率低，得到的绝大多数差异条带仅含3’UTR短片段信息，这些区域的序列结构相对保守，得不到特异的基因且容易出现假阳性。
假阳性的鉴定：
（1）Northern杂交：
通常是将序列胶中回收的片段再次扩增后作探针进行Northern杂交检测，确定阳性片段后再进行克隆。
（2）Northern杂交并回收特异cDNA片段
（3）DNA部分序列分析法：
先对10个菌落的cDNA插入序列进行部分序列分析，通过比较选出不同菌落，再对其进行序列分析以证实其异质性。
3、PCR法构建减法cDNA文库（SSH）
该法通过2次杂交和2次PCR，使假阳性率可降到6%，且灵敏度高。
用SSH可一次同时分离几十至几百个差异基因，使效率大增。
但由于SSH需mRNA量大（几微克），对mRNA来源困难的材料不利。
因为SSH对不同材料或材料间存在的小片段缺失不能有效检测，所以研究材料的差异不能太大。
4、基因表达的序列分析（SAGE）
目前，高通量地研究基因表达谱的方法主要有两种，即生物芯片和基因表达序列分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）。
基因芯片所能检测的基因必须是已知的基因，放在芯片上几种基因的探针就只能检测这几种基因的表达谱；相比之下，SAGE能以远高于DNA芯片的精确度和重复性来检测在病理条件下基因表达谱的改变，而不必考虑所检测的基因是已知的还是未知的。
因此在检测疾病相关的新基因，特别是无法用基因芯片进行检测的低表达量致病基因时，SAGE是目前的最佳手段，无可取代。
5、cDNA末端快速克隆（RACE）
RACE是基于PCR技术基础上由已知的一段cDNA片段，通过往两端延伸扩增从而获得完整的3'端和5'端的方法。
与筛库法相比较，此方法是通过PCR技术实现的，无须建立cDNA文库，可以在很短的时间内获得有利用价值的信息，节约了实验所花费的经费和时间，且只要引物设计正确，在初级产物的基础上可以获得大量的感兴趣基因的全长。
五、基因芯片技术的基本原理是什么？
有哪些类型？
基因芯片在基因克隆中有哪些应用？
如何利用基因芯片进行基因的功能验证？
1、原理：
采用光导原位合成或显微印刷等方法将大量特定序列的探针分子密集、有序地固定于经过相应处理的硅片、玻片、硝酸纤维素膜等载体上,然后加入标记的待测样品，应用已知核酸序列与互补的靶序列杂交，通过杂交信号的强弱及分布,来分析目的分子的有无、数量及序列,从而获得受检样品的遗传信息。
2、类型：
由于尚未形成主流技术，生物芯片的形式非常多，以基质材料分，有尼龙膜、玻璃片、塑料、硅胶晶片、微型磁珠等；以所检测的生物信号种类分，有核酸、蛋白质、生物组织碎片甚至完整的活细胞；按工作原理分类，有杂交型、合成型、连接型、亲和识别型等。
但可分为三种主要类型：
（1）固定在聚合物基片（尼龙膜，硝酸纤维膜等）表面上的核酸探针或cDNA片段，通常用同位素标记的靶基因与其杂交，通过放射显影技术进行检测。
（2）用点样法固定在玻璃板上的DNA探针阵列，通过与荧光标记的靶基因杂交进行检测。
这种方法点阵密度可有较大的提高，各个探针在表面上的结合量也比较一致，但在标准化和批量化生产方面仍有不易克服的困难。
（3）在玻璃等硬质表面上直接合成的寡核苷酸探针阵列,与荧光标记的靶基因杂交进行检测。
该方法把微电子光刻技术与DNA化学合成技术相结合，可以使基因芯片的探针密度大大提高，减少试剂的用量，实现标准化和批量化大规模生产，有着十分重要的发展潜力。
3、基因芯片在基因克隆上的应用：
（1）研究生物体对逆境的反应
植物抗逆等基因的筛选是从分子水平上揭示植物生理机制的一项基础性研究，发现新基因是培育抗逆新品种的重要前提，如寻找抗病虫、抗旱、耐寒的相关基因，以进行新产品的开发和品种的改良等，利用基因芯片可以高通量、快速检测基因的差异表达。
（2）基因表达水平的检测
基因芯片将已知基因固定于芯片上，将生物体某种生理状态下所表达的mRNA反转录为cDNA并作荧光标记，然后和芯片进行杂交，通过检测杂交信号的强度来分析相关基因的表达丰度。
用基因芯片进行的表达水平检测可自动、快速地检测出成千上万个基因的表达情况。
（3）基因突变和多态性分析
基因突变是顺序上的核苷酸发生了改变，其突变将会引起相应基因的功能丧失或改变，引起遗传病。
芯片用于检测分子突变，可以准确地确定突变位点和突变型，芯片可以同时检测多个基因乃至整个基因组的突变，还可以进行基因多态性分析。
（4）基因组DNA序列分析
基因芯片技术用于序列分析提出最早，原理是依据短的标记寡核苷探针与靶DNA杂交，利用杂交谱重建靶DNA序列。
（5）利用基因芯片技术进行后基因组学研究
基因预报和功能鉴定是测序和对基因组进行注释的结果，基因组测序完成后，研究未知基因的功能是一个十分引人的后基因组研究课题。
（6）转基因农产品检测
广泛收集用于转基因技术的启动子、目的基因（如抗病基因、抗虫基因等）和标记基因的EST序列，制成基因芯片，可以对转基因农产品进行检测。
4、基因功能验证
首先进行序列分析，根据基因序列中特异的片段设计探针，制备出代表该生物所有基因的寡核苷酸或DNA阵列，即DNA芯片。
然后将不同条件下从某生物中转录出来的所有mRNA标记，与DNA芯片杂交，通过分析杂交位点及信号强弱，可得知在不同条件下各组基因是否表达及各自表达的程度。
根据表达图谱进行不同条件下基因表达的对比分析，可找出在环境条件变化时，哪些基因表达发生了变化，从而分析其生理功能，找出与该生理功能相关的功能基因。
六、简述生物信息学技术在基因克隆和基因结构与功能分析中的应用，举例说明。
1、核酸序列的同源性检索
GenBank数据库中收录的EST序列有数百万个之多，由于EST代表着一段表达基因序列，这样就可用其与公共数据库进行同源性检索，检索与其同源的核酸序列。
典型分析是采取NCBI的Blast软件对GenBank中的非冗余数据库（non-redundantdatabase,nr）进行查询。
2、比较基因组分析
达尔文的进化论给比较基因组学提供了理论依据。
动物进化从低等到高等，动物与动物之间存在着亲缘关系。
这种关系可以从基因序列上反映出来。
亲缘关系越近，其基因序列的同源性就越高。
可以根据已经亲缘关系较大的动物的基因序列来扩增目的基因的序列。
3、利用Unigene数据库进行电子克隆
从NCBI的UniGene数据库中进行检索，得到相应的UniGene编号。
获得待分析序列的UniGene编号以后，就可以将与UniGeneCluster的所有核酸序列下载到本地，利用SequencherTM或其他的序列装配软件进行组装。
形成较长的新生序列。
4、cDNA序列的开放阅读框分析
基于遗传密码表，可通过计算机方便分析核酸序列的读码框。
通过NCBI的ORFfinder,输入cDNA序列，计算机将按照六种相位翻译成蛋白质。
5、基于核酸序列的电子基因定位
对核酸序列进行电子基因定位（即基因的染色体定位），通过所定位区带的相邻基因或者基因簇间接提示该基因的功能，是核酸分析的一个重要方面。
6、基于序列同源性分析的蛋白质功能预测
相似的序列很可能具有相似的功能。
因此，蛋白质的功能预测最为可靠的方法是进行数据库相似性检索。
时间：
2021.02.04
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