水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位.docx

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水稻类病斑突变体lmm4的鉴定及其基因定位

水稻类病斑突变体lmm４的鉴定及其基因定位

邱结华１　马宁１,２　蒋汉伟１,２　圣忠华１　邵高能１　唐绍清１　魏祥进１,∗　胡培松１,∗

（１中国水稻研究所/农业部水稻生物学与遗传育种重点实验室/水稻生物学国家重点实验室,杭州３１０００６;２杭州师范大学生命与环

境科学学院,杭州３１００３６;∗通讯联系人,EＧmail:

weixiangjin＠caas．cn;hupeisong＠caas．cn）

IdentificationandGeneMappingofaLesionMimicMutantlmm４inRice

QIUJieＧhua１,MANing１,２,JIANGHanＧwei１,２,SHENGZhongＧhua１,SHAOGaoＧneng１,TANGShaoＧqing１,

WEIXiangＧjin１,∗,HUPeiＧsong１,∗

（１StateKeyLaboratoryofRiceBiology,KeyLaboratoryofRiceBiologyandBreedingofMinistryofAgriculture,ChinaNational

RiceResearchInstitute,Hangzhou３１０００６,China;２CollegeofLifeandEnvironmentalSciences,HangzhouNormalUniversity,

Hangzhou３１００３６,China;∗Correspondingauthor,EＧmail:

weixiangjin＠caas．cn;hupeisong＠caas．cn）

QIUJiehua,MANing,JIANGHanwei,etal．Identificationandgenemappingofalesionmimicmutantlmm４inrice．

ChinJRiceSci,２０１４,２８（４）:

３６７Ｇ３７６．

Abstract:

Thelesionmimicmutantlmm４wasidentifiedfromanEMSＧinducedNipponbaremutantlibrary．Brown

lesionswerefirstobservedonthetipoflmm４leavesattheinitialtilleringstage,andspreadedgraduallydownwardto

thewholeleafbladeandeventheleafsheath．Comparedwiththewildtype,thechlorophyllandthenetphotosynthetic

rateoflmm４weresignificantlyreduced．Theplantheight,paniclelength,seedsettingrate,grainweightwerealso

decreasedsignificantly．Theshadingassayshowedthatthelesionsonlmm４leaveswereinducedbynaturallight．The

histologicalstainingassayindicatedthatthelesionsonlmm４leaveswerecausedbyprogrammedcelldeathand

hydrogenperoxideaccumulatedinlmm４leaves．Thelmm４displayedhigherresistancetoblastraceC７andG１when

comparedwiththewildtype．Inaddition,pathogenesisＧrelatedgenePOC１,PAL,PBZ１,PR１werefoundtobeupＧ

regulatedinlmm４．Geneticanalysissuggestedthatthephenotypeoflmm４wascontrolledbyasinglerecessivenuclear

locus．BasedamapＧbasedcloningstrategy,thelmm４wasnarroweddowntoa２３５kbregionbetweenIndＧ４andIndＧ６

nearthecentromereofchromosome５．

Keywords:

lesionmimicmutant;blastresistance;genemapping;rice

邱结华,马宁,蒋汉伟,等．水稻类病斑突变体lmm４的鉴定及其基因定位．中国水稻科学,２０１４,２８（４）:

３６７Ｇ３７６．

摘　要:

在EMS诱变的日本晴突变体库中,筛选到一个类病斑突变体.该突变体类病斑出现于分蘖始期,而后慢慢扩散至

叶鞘、茎秆,最后至整个植株,属于扩散型类病斑突变体.相比野生型,突变体的lmm４的株高明显降低,有效穗数减少,穗长

缩短,结实率、每穗实粒数、千粒重均显著降低.遮光处理实验表明,突变体lmm４类病斑的产生受自然光诱导.突变体

lmm４的光合色素含量和净光合速率明显低于野生型.电子显微镜观察发现突变体类病斑部位叶肉细胞中的叶绿体结构发

育异常.台盼蓝染色实验表明突变体类病斑部有大量的死亡细胞.二氨基联苯胺染色实验表明类病斑部位有过氧化氢沉

积.稻瘟病抗性鉴定结果表明,与野生型相比,突变体lmm４对C７和G１等稻瘟病菌生理小种的抗性明显增强.实时PCR

分析证明在突变体lmm４中防卫反应相关基因POC１、PAL、PBZ１、PR１的表达量显著提高.遗传分析表明突变体表型符

合单隐性核基因控制的遗传规律.lmm４定位在第５染色体着丝粒附近IndＧ４和IndＧ６之间大约２３５kb的区域内.

关键词:

类病斑突变体;稻瘟病抗性;基因定位;水稻

中图分类号:

Q３４３．５;Q７５４;S４３５．１１１．３＋９　　　　　文献标识码:

A　　　文章编号:

１００１Ｇ７２１６（２０１４）０４Ｇ０３６７Ｇ１０

　　植物类病变（lesionmimicmutant）突变体是指

在无明显逆境或病原物侵染时,植物叶片或叶鞘上

自发形成大小、形状和颜色各异的斑点的一类突变

体[１].又因为多数类病变突变体形成的斑点与无毒

病原物浸染时产生的病斑类似,并且大多数斑点的

颜色为褐色,也常被称之为类病斑（lesionsimulaＧ

tingdisease）突变体.类病斑突变体的表型多与病

原菌侵染后的超敏反应（hypersensitiveresponse,

HR）症状类似[２],而且许多类病变突变体对某些植

物病原物表现出了一定的抗性[３Ｇ５].因此,对这类突

收稿日期:

２０１４Ｇ０１Ｇ１６;修改稿收到日期:

２０１４Ｇ０３Ｇ０１.

基金项目:

国家自然科学基金资助项目（３１２０１１９３,３１２０１１９５）;国家８６３计划资助项目（２０１１AA１０A１０１,２０１２AA１０１１０１）.

７６３

中国水稻科学（ChinJRiceSci）,２０１４,２８（４）:

３６７－３７６

http:

//www．ricesci．cn

DOI:

１０．３９６９/j．issn．１００１Ｇ７２１６．２０１４．０４．００５

变体的研究可以为水稻抗病防御体系和细胞程序性

死亡机制的研究提供借鉴,同时可以为水稻抗性育

种提供有用的种质资源.

水稻类病斑突变体的研究已有大量报道,到目

前为止,已经发现了５０多个类病斑突变体[３].其

中,绝大部分呈单隐性核基因遗传规律,少部分表现

为双隐性核基因或显性核基因遗传规律[６],但被克

隆的类病斑基因却为数不多.在水稻中第一个被克

隆的类病斑基因是SPL７[７],该基因编码一个热激

转录因子,spl７突变体在该基因非常保守的DNA

结合域发生突变,从而导致其斑点叶表型的发生.

随后不同研究者利用图位克隆、同源基因克隆、TＧ

DNA序列标签等方法克隆与分离了Spl１、Spl１８、

Spl２８、OsLSD、OsPti１a、OsNPR１、OsSSI２、OsＧ

ACDR１、RLIN１、RLS１等多个水稻类病斑性状相

关基因[８Ｇ１７].这些已经克隆基因的突变体表现出不

同类型、不同程度的类病斑表型,部分突变体还表现

出比其野生型更好的稻瘟病、白叶枯病抗性.如水

稻类病斑突变体lsd１对毒性稻瘟病菌小种的抗性

明显增强[９];而水稻突变体npr１和acdr１对白叶枯

病的抗性提高[１０,１１].水稻类病斑突变体spl１１[８]、

spl１８[１２]、ttm１[１３]、spl２８[５]和ssi２[１４]同时对稻瘟病

和白叶枯病产生抗性.同时,类病斑基因大多直接

调控或间接影响水稻的防卫反应与细胞程序性死亡

过程[８].类病斑基因的克隆与功能研究表明类病变

过程非常复杂,涉及到许多生化代谢过程.因此,挖

掘更多的类病斑突变体,克隆更多的相关基因,并开

展详细的功能研究,有助于全面了解类病变发生机

制,同时为研究水稻细胞程序性死亡和抗病机制提

供借鉴.

本研究以粳稻品种日本晴EMS诱变产生的一

个稳定遗传的类病斑突变体lmm４为材料,详细描

述了该突变体的形态学特征、生理学特性,并对该突

变基因进行了精细定位,以期为该基因的克隆、功能

研究及应用提供理论依据.

１　材料与方法

１．１　实验材料

从日本晴EMS诱变突变体库中筛选到一个类

病斑突变体lmm４,经多代自交后类病斑性状在海

南和杭州都能稳定遗传.以lmm４与籼稻品种南京

１１和培矮６４杂交衍生的F１及F２群体对lmm４进

行遗传分析,利用lmm４与南京１１、培矮６４衍生的

F２群体对突变体基因进行分子定位.所有材料均于

正季种植于中国水稻研究所富阳试验基地,田间管

理同大田生产.

１．２　遮光处理

在大田自然条件下,用宽度约２cm的锡箔纸对

突变体lmm４分蘖时期的叶片进行包裹遮光,分别

对未发和已发生类病斑的叶片遮光一周;然后对遮

光处揭掉锡箔纸恢复光照,跟踪观察类病斑变化.

１．３　叶绿素含量的测定

分别取大田自然条件下突变体lmm４及其野生

型分蘖期、抽穗期和成熟期的叶片进行叶绿素含量

测定.将０．２g待测样品剪成２~３mm的小片浸泡

于１０mL９５％乙醇,黑暗条件下放置于４℃的冰箱

中,浸提４８h左右.利用分光光度计测量乙醇溶液

的吸光值,每组取３份样品,每份样品重复测量３

次.按Lichtenthaler等[１５]修正的Arnon法计算叶

片叶绿素含量.

１．４　光合作用相关指标的测定

使用LiＧ６４００型便携式光合测定仪,于始穗期

晴天上午９:

００－１１:

００分别测定突变体lmm４及其

野生型叶片的净光合速率（Pn）、气孔导度（Gs）、蒸

腾速率（Tr）和胞间CO２浓度（Ci）.突变体和野生

型各测定３片具代表性的剑叶,光合测定仪使用红

蓝光源,光量子密度１２００μmol/（m２s）,流速５００

μmol/s.

１．５　叶绿体结构电镜观察

分别取分蘖期野生型正常叶片与突变体lmm４

发生类病斑叶片,置于２．５％戊二醛固定液中,抽真

空使固定液完全渗入叶片中,电镜样品制备参照吕

典华等[１６]的方法,样品制备好后利用HITACHI

７６５０型透射电子显微镜对叶肉细胞中叶绿体的显

微结构进行观察.

１．６　叶片死亡细胞检测

参照Yin等[１７]的方法分别取分蘖期有类病斑

表型的突变叶片以及相应位置的野生型正常叶片用

台盼蓝染色,使用体视镜（LeicaDM１０００）观察突变

体和野生型叶片中染色情况并拍照.

１．７　叶片H２O２沉积检测

参照ThordalＧChristensen等[１８]的方法检测突

变体叶片中是否有H２O２的积累.

８６３中国水稻科学（ChinJRiceSci）　第２８卷第４期（２０１４年７月）

１．８　突变体抗性鉴定

为了了解类病斑突变体lmm４对稻瘟病的抗

性,将lmm４和野生型品种浸种、催芽后,按顺序分

别播种在５０×２５×５的有孔、装有细土的塑料盘中,

每盆播３１个,每１个供试品种播１０粒~１５粒,设１

个重复,接种前３d施氮肥,保持嫩绿;在秧苗３~４

叶期接种;选择A４９、A５７等致病性较强和致病频率

较高２０个菌株对lmm４及其野生型秧苗喷雾接种,

病菌浓度约为２×１０５个孢子/mL.接种量以所有

叶片上布满孢子液为限,覆盖黑色湿布保湿２４h,

然后取出,定时喷雾保湿.７d后当感病对照品种

丽江新团黑谷病级达７级以上时进行调查.

１．９　基因定位

从突变体lmm４与南京１１衍生F２群体中首先

挑选出２２株表型为类病斑的分离单株用于lmm４

的连锁分析.利用本实验室均匀分布于１２条染色

体的５１２对公共引物对亲本进行筛多态分析,所用

引物来自Matsumoto等采用的公共序列[１９].初步

确定目标基因所在的染色体位置.然后在与目标基

因连锁标记附近进一步开发了１０对存在多态的

SSR标记或Indel标记（表１）,以１１８２株表现出类

病斑表型的分离单株对突变体基因lmm４进行进一

步定位.为了更精细定位lmm４突变体基因,同时

利用突变体与培矮６４衍生的F２群体中表现突变体

性状的３９３６个分离个体对突变体基因进一步精细

定位.亲本和定位群体F２的植株基因组的DNA采

用SDS法[２１]提取,１０μL的PCR体系包括DNA１

μL,１０×PCR缓冲液１μL,正反向引物（１０μmol/

L）各０．５μL,dNTPs（１０μmol/L）０．１μL,Taq酶０．

１μL,加ddH２O补足１０μL.PCR程序如下:

９４℃

下预变性３min;９５℃下３０s,５５℃下３０s,７２℃下

４０s,３５个循环;最后在７２℃下延伸３min.PCR产

物在８％非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳,电泳

结束后银染显色并读胶.

１．１０　防卫反应相关标记基因的表达分析

采用Trizol法提取突变体和野生型植株分蘖

期叶片总RNA.以经过DNaseⅠ处理过的总RNA

为模板,采用ReverTraAceFskＧ１００kit（TOYOBO）

反转录合成cDNA第１链.然后利用实时荧光定

量PCR方法分析各基因在突变体和野生型中的表

达量.内参基因为Actin（GenBank登录号为

X１６２８０）.实时荧光定量PCR反应体系（２０μL）包

含cDNA模板１μL,２×SYBRqPCRMix（TOYOＧ

BO）１０μL,前后引物（１０μmol/L）各１μL,ddH２O

７μL.每个样品３个重复.PCR扩增程序如下:

９５℃下３０s;９５℃下５s,６０℃下３０s,７２℃下１５s,

４０个循环.以２－△△CT计算各基因相对表达量.用

于检测防卫反应相关标记基因的表达引物见表２.

２　结果与分析

２．１　突变体lmm４的表型

在大田自然条件下,突变体lmm４苗期叶片与

表１　定位突变体基因lmm４所用的引物序列

Table１．Primersequenceusedforlmm４mapping．

标记

Marker

前引物

Forwardprimer

后引物

Reverseprimer

Q１TTCCATGGCACACAAGCCCTGTGCACGAACTTCCAAAG

Q２TGGCGCAATATCTCTCTCATTCCTGCCACTTGTGTGTTGTTCTGC

Q３CGAGGGGATTCGATCGACATCCCTTCACACTGCTCCAC

Q４GGCGTAAAGGTTTTGCATGTATGATGCCATGAAGGTCAGC

Q５CGTAAACACGAGCACACAAAGGACACACAACAGCTGCTCACTGG

IndＧ２ATGTCCTAATTTTCACCCAGATTTCCATAGCAGACTTATTTCAG

IndＧ３GCCTAGTGGTGGAAGCATTTAAACCGGCAGGTCTGA

IndＧ４TGGTTACAATAGTGCCTCACACATAATTGCTAGTAGTTAGAG

IndＧ６AGTTTCTGGGTTAGGGATGTTATGAGGGTGCTGTTGG

IndＧ１２AAAGTCAAACGTGGACAAGCACTGGCAATTCGCTCA

IndＧ１３CCAAAAGTCAACCTGGAACACAAATTAAATTAGGCATG

IndＧ１４AAATCCGAAGCGCCACTATTGATGCGGCACATCCTA

　　Q１~Q５是SSR标记;Ind２~Ind１４是插入缺失标记.

Q１toQ５areSSRmarkers;Ind２toInd１４areinsertＧdeletemarkers．

９６３邱结华等:

一个水稻类病斑突变体lmm４的鉴定及其基因定位

A－野生型（左）和突变体lmm４（右）分蘖期的植株表型;B－野生型（左）和突变体lmm４（右）的分蘖期叶片;C－野生型（左）和突变体lmm４

（右）成熟期的植株表型;D－野生型（左）和突变体lmm４（右）的成熟期叶片.

A,Phenotypeofwildtype（left）andthelmm４（right）duringthetilleringstage;B,Leafphenotypeofwildtype（left）andthelmm４（right）

duringthetilleringstage;C,Phenotypeofwildtype（left）andthelmm４（right）duringthematuritystage;D,Leafphenotypeofwildtype

（left）andthelmm４（right）duringthematuritystage．

图１　类病斑突变体lmm４的表型

Fig．１．Phenotypesoflmm４mutant．

其野生型一致,并没有类病斑,但是在分蘖期后期

lmm４植株上部叶片从叶尖开始出现红褐色类病斑

（图１ＧA~B）.随着水稻的生长,类病斑的数量逐渐

增加并向整片叶片扩张,同时单个类病斑的面积也

会不断变大（图１ＧC~D）,因此,突变体lmm４属于

扩散型类病斑突变体.另外,相比野生型突变体,

lmm４植株较为矮小,株高明显降低,结实率显著降

低,每穗实粒数、千粒重均减少.相对于野生型,

表２　防卫反应标记基因表达分析引物

Table２．TheprimersforRTＧPCRofpathogenesisＧrelatedmarkergenes．

基因

Gene

前引物

Forwardprimer

后引物

Reverseprimer

登录号

AccessionNo．

PR１GTAAACAGGTCCACGGTCCATACCCCAGTGACAACTGACAAGGCAAAU８９８９５

PBZ１CGGGCACCATCTACACCAGCCATAGTAGCCATCCACD３８１７０

PALGGCATCCAGGGCGGCTTCTTCGGTCTTGCTTCGGCTTCATCAGX８７９４６

POC１TTCAACAACGGCAGCACGGACAATGGAACAAGAAACAGAGCAAGGCAAATCAF２４７７００

POX２２．３AGTGCCAGAACTTCAGGGACAGGATCTACAACAACGAACGCATCCCGTCATACTACTCCAF０１４４６７

ActinCATGCTATCCCTCGTCTCGACCTCGCACTTCATGATGGAGTTGTATX１６２８０

表３　突变体和野生型的主要农艺性状

Table３．Theagronomictraitsoflmm４andwildtype（WT）．

材料

Material

株高

Plantheight/cm

结实率

Seedsettingrate/％

千粒重

１０００Ｇgrainweight/g

每穗实粒数

No．offilledgrainsperpanicle

野生型WT８５．７±２．１６６．７±０．９２４．１５±０．１９６９．５±１．１

突变体lmm４７２．１±２．３∗∗４５．５±１．７∗２２．８０±０．６３∗∗５６．６±１．３∗

　　∗,∗∗分别表示野生型与突变体在０．０５和０．０１水平下差异显著.

∗,∗∗significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantat０．０５and０．０１levels,respectively;Mean±SD（n＝２５）．

０７３中国水稻科学（ChinJRiceSci）　第２８卷第４期（２０１４年７月）

表４　突变体lmm４与野生型始穗期剑叶的光合特性

Table４．Photosyntheticcharactersoflmm４mutantandwildtype（WT）atheadingstage

材料

Material

净光合速率（Pn）

Netphotosyntheticrate

气孔导度（Gs）

Stomatalconductance

蒸腾速率（Tr）

Transpirationrate

胞间CO２浓度（Ci）

IntercellularCO２concentration

野生型WT２４．６３±１．０８０．２９±０．０４８．２９±０．４０２１２．３３±７．０９

突变体lmm４８．３７±１．５０∗∗０．１５±０．０１∗５．００±０．２１∗２８０．３３±１４．５７∗∗

　　∗,∗∗分别表示野生型与突变体在０．０５和０．０１水平下差异显著.

∗,∗∗significantdifferencebetweenwildtypeandthemutantat０．０５and０．０１levels,respectively．Mean±SD（n＝３０）．

A,日本睛;B,遮光前lmm４;C,未发生斑点部位遮光７d后;D,遮

光部位恢复光照７d后;E,已发生斑点部位遮光７d后.

A,Nipponbare;B,Leafoflmm４beforeshading;C,Leafwithout

lesionaftershadingfor７days;D,Leafshadedfor７daysthenunder

normallightfor７days;E,Leafwithlesionaftershadingfor７days．

图２　遮光对突变体lmm４叶片的影响

Fig．２．EffectsofShadingonlmm４leaves．

lmm４表现一定的早衰现象（图１ＧA,表３）.

２．２　突变体lmm４类病斑发生受光照诱导

对突变体lmm４只在叶尖出现少量类病斑的叶

片未产生类病斑部位用锡箔纸遮光一周后发现,整

张叶片其他部位都产生了明显的类病斑,但是遮光

处并没有类病斑产生（图２ＧA~C）;恢复光照一周

后,原本没有类病斑的遮光处产生了明显的类病斑

（图２ＧD）;同时,对已经产生的类病斑的叶片进行遮

光,一周后发现已产生的类病斑并不会消失,但是其

他部位类病斑扩散严重,遮光处没有扩散（图２ＧE）.

该结果表明突变体lmm４的类病斑发生受自然光照

诱导,适当的遮光可以阻止或减轻类病斑的发生或

扩散.

２．３　光合色素含量及光合速率分析

对大田自然环境下分蘖期、抽穗期和成熟期三

个时期野生型和突变体lmm４叶片叶绿素、类胡萝

卜素含量进行测定,结果表明,在分蘖期（类病斑起

始期）,突变体和野生型各色素指标差异不大,但在

抽穗期（类病斑已形成）,lmm４的叶绿素、类胡萝卜

素含量明显低于野生型,到成熟期,突变体的各色素

含量都极显著低于野生型（图３）.表明lmm４的突

变导致了水稻叶绿素、类胡