鲨鱼肉酶解液钙螯合物的抗氧化抗菌活性分析毕业作品.docx
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鲨鱼肉酶解液钙螯合物的抗氧化抗菌活性分析毕业作品
毕-设
业-计
（20__届）
鲨鱼肉酶解液钙螯合物的抗氧化抗菌活性分析
所在学院
专业班级食品质量与安全
学生姓名学号
指导教师职称
完成日期年月
摘要：
以鲨鱼肉酶解液为原料，以CaCl2为钙源进行螯合，利用无水乙醇分级沉淀螯合物，同时测定各级螯合物的抗氧化与抗菌活性。
结果显示：
1）水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物得率分别为：
0.85%、0.86%、1.03%。
2）80%乙醇不溶物的抗氧化性效果最好，其清除DPPH·、O2-自由基、OH·自由基的IC50值分别为7.318mg.mL-1、23.22mg.mL-1、5.60mg.mL-1，TBA实验显示其抗氧化效果与α-生育酚接近；水不溶物与50%乙醇不溶物均具有一定的抗氧化性效果，但弱于80%乙醇不溶物。
3）80%乙醇不溶物的抗菌效果稍强于50%乙醇不溶物，随着螯合物浓度的提高，抗菌效果增强。
关键词：
鲨鱼肉；酶解液；钙螯合物；抗氧化；抗菌
Abstract:
Thechelatewasprecipitatedfractionallybyalcohol,whichismadefromSharkmeathydrolyzateandCalciumchloride.Simultaneously,antimicrobialandantioxidantactivitywereanalysedatalllevelsofchelationproducts.Theresultswereasfollows:
1）Theyeildofwaterinsoluble,50%alcoholinsolubleand80%alcoholinsolubleproductswere0.85%,0.86%,1.03%,respectively,whichisrelativetowetmeat.2）80%alcoholinsolubleshowedthebestantioxidantactivity,it’sIC50ofDPPH•scavenging,O2-freeradicalscavengingability,OH•freeradicalscavengingwere7.318mg•mL-1,23.22mg•mL-1,5.60mg•mL-1respectively.Inaddition,TBAexperimentsshowedthatthewaterinsolubleand50%alcoholinsolublealsohavesomeantioxidanteffects,butlowerthanthe80%alcoholinsoluble,whichwasclosetotheeffectofVE.3）Thehighertheconcentrationof50%or80%alcoholinsoluble,thebettertheirantibacterialeffect.Andtheantibacterialeffectofthe80%alcoholinsolublewasslightlystrongerthanthe50%alcoholinsoluble
Keywords:
sharkmeat;hydrolyzate;calciumchelate;antibacterial;antioxidan
1引言
“海中霸王”鲨鱼广泛分布于印度洋、太平洋和大西洋，为全球性鱼类，在我国南海、东海和黄渤海均有分布。
我国鲨鱼捕捞量较大，年产量近2万吨，渔获产量以东海区南部最高，约占全国产量的44%。
而目前对鲨鱼的利用主要局限于价值较高、占鲨鱼总重15%的鱼鳍上，其加工下脚料尤其是产量巨大的鲨鱼肉并未得到很好的利用。
研究表明，鲨鱼肉营养丰富，含丰富的不饱和脂肪酸和多种矿物质，其蛋白质的氨基酸比值与人体肌肉蛋白成分非常接近，其吸收利用率高，但鲨鱼肉质粗，加上含有较多的尿素，感官上并不令人满意，直接食用往往受到限制。
对鲨鱼肉的研究，国内主要集中在对其产品加工工艺方面，对其深度加工及其生理活性的研究较少。
如农绍庄[1]等研究了鲨鱼肉鱼肠的制作工艺；袁秋萍[2]对鲨鱼肉松保健食品进行了研制；谢荣辉[3]以鲨鱼肉为原料制作猫食宠物食品，并对其中添加的抗氧化剂进行筛选。
目前对鲨鱼肉的利用多是将其加工成宠物食品或肉肠、鱼松制品，这大大限制了鲨鱼肉的应用范围。
金属螯合物是由中心离子和多齿配体结合而成的具有环状结构的配合物。
在螯合物的结构中，有一个或多个多齿配体提供多对电子与中心体形成配位键[4]。
金属螯合物的研究始于上世纪70年代，最初由美国Albion实验室进行，以动植物蛋白和铁元素为原料合成了铁蛋白复合物。
一般认为金属离子被氨基酸或多肽鳌合后，能生成具有稳定结构形态的金属螯合物，有机物中的金属离子在配位体氨基酸的保护下，可有效抵御与其它离子生成难溶的无机盐，克服了无机盐的一些缺点，抑制了矿物质之间的相互影响，大大提高生物对于各种金属元素的吸收利用率。
由于金属螯合物具有良好的利用率和适口性，加上低廉的成本，已被广泛的应用在食品和饲料行业，尤其是在保健品中。
国内的蛋白酶解物金属离子螯合研究开始于上世纪90年代，而鱼肉蛋白酶解物的金属离子螯合研究在近几年才逐渐出现。
目前对蛋白降解物金属离子螯合物的生物学功能研究报道较多，如刘安军[5]等研究表明胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）螯合物可显著提高小鼠肝脏内超氧化物歧化酶（SOD）的表达量，证明胶原蛋白多肽-铬（Ⅲ）螯合物可以清除小鼠体内大量的自由基，对肝脏的损伤进行保护；杨燊等[6]以南海低值鱼蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶和风味酶的复合酶水解制备多肽复合物，并进一步研究鱼肉蛋白多肽的钙螯合物，研究表明该钙螯合物具有一定的抗氧化作用。
鱼肉经酶作用水解后，功能和品质可得到提高，再经过金属离子如钙、铁、锌等螯合，不仅能提升其品质与功能性，而且有可能体现出新的有益活性。
目前利用鲨鱼肉酶解液为原料，制备金属螯合物，并进一步研究其生理活性的研究国内外未见报道，本实验室在酶解鲨鱼肉，优化酶解液钙螯合条件的基础上，得到了鲨鱼肉酶解液钙螯合物。
本文利用无水乙醇作为萃取剂，对优化条件下制备的鲨鱼肉酶解液钙螯合物进行分级沉淀，得到水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物三个螯合物组分，以硫代巴比妥酸法（TBA法）、自由基清除率等分别测定螯合物的抗氧化活性，同时以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草杆菌为试验菌，以抑菌圈大小为指标分析其抗菌活性，旨为鲨鱼肉的开发、鲨鱼肉酶解液钙螯合物的进一步利用提供理论依据。
2材料与方法
2.1主要材料
鲨鱼肉：
由温州某水产开发有限公司提供，为鱼翅加工的副产品。
鲨鱼肉酶解液钙螯合物：
由本实验室自制。
试验菌种：
大肠杆菌Esoherichiacoli、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis均由本院微生物实验室提供。
2.2主要仪器
电子分析天平
BP221S
德国Sartorius公司
电热恒温鼓风干燥箱
DHG-9070A
上海精宏实验设备有限公司
电子天平
TD3102
余姚市金诺天平仪器有限公司
电热恒温水浴锅
DK-S24
上海精宏实验设备有限公司
高速冷冻离心机
GL-21MC
湘仪离心机仪器有限公司
双光束紫外可见分光光度计
UV-4802
Unico公司（美国）
pH计
DocuMeter
Sartorius公司（德国）
2.3试剂
名称纯度生产企业
木瓜蛋白酶（酶活1.11105U/g）食品级广西南宁庞博生物公司
邻菲罗啉分析纯天津市博迪化工有限公司
过氧化氢分析纯杭州高晶精细化工有限公司
磷酸二氢钠、磷酸氢二钠分析纯汕头市金砂化工厂
硫酸亚铁分析纯四达表面处理材料厂
三氯化铁分析纯上海展云化工有限公司
铁氰化钾分析纯上海试剂一厂
邻苯三酚分析纯国药集团化学试剂有限公司
Tris（三羟甲基氨基甲烷）分析纯上海生物工程有限公司
EDTANa2分析纯 宁波神化化学品经营有限责任公司
三氯乙酸分析纯国药集团化学试剂有限公司
DPPH•（二苯代苦味酰基自由基）分析纯和光纯药工业株式会社（日本）
盐酸分析纯杭州化学试剂厂
无水乙醇分析纯国药集团化学试剂有限公司
2.4方法
2.4.1鲨鱼肉酶解液钙螯合物的分级沉淀
蛋白酶解液经过钙离子螯合，得到不同的螯合物，根据其极性的不同可采用不同浓度的乙醇浓度将其分离［７］。
酶解液钙螯合物8000rpm离心15min，沉淀即为水不溶组分（A）；上清液中加入等体积无水乙醇，室温静置30min，离心，沉淀即为50％无水乙醇不溶性组分（B）；剩余的上清液中加入无水乙醇，至乙醇浓度达到80％，室温静置30min，离心，沉淀即为80％无水乙醇不溶性组分（C）。
采用真空冷冻干燥法，将各级样品冷冻干燥，冷藏备用。
2.4.2钙螯合物抗氧化活性的测定
2.4.2.1TBA法（硫代巴比妥酸法）
将0.2ml亚油酸的样品加入30ml试管中，然后加入10ml99.5%乙醇和10ml50mol·L-1磷酸盐缓冲液（pH7.0）。
每一种样品（50mg）加入到此混合溶液中，然后用蒸馏水定容至25ml。
将其放入到培养箱中在40℃培养。
TBA溶液根据Ohkawa等[8]方法配制，该溶液含有0.8ml水、0.2ml8.1%SDS和1.5ml20%的醋酸，后用10mol/L的NaOH和1.5ml0.8%TBA调pH至3.5。
将50μl的氧化性亚油酸溶液（分别经40℃培养1天、3天、5天、7天、9天）加入到TBA混合液中，并在5℃培养1h，然后在100℃加热1h，冷却后测定535nm吸光值。
结果被表示为对亚油酸的氧化抑制率，同α-生育酚（VE）的抗氧化性作对照比较。
抑制率的计算公式：
抑制率（%）=（A－B）×100/（A－C）
式中：
A为对照组（50μl去离子水、0.2ml亚油酸）的吸光度；B为样品组（50μl样品液、0.2ml亚油酸）的吸光度；C为α-生育酚液组（50μlα-生育酚液、0.2ml亚油酸）的吸光度。
2.4.2.2DPPH·清除能力的测定[9]
具塞试管中加入样品液2mL及2mL1×10-4mol/LDPPH·溶液（用95%乙醇配制），摇匀，室温下密闭静置30min，于517nm下测定吸光度。
DPPH·清除率（%）=[1－（A1－A2）/A0]×100%
式中：
A1：
酶解液+DPPH·溶液的吸光度；
A2：
酶解液+95%乙醇溶液的吸光度；
A0：
DPPH·溶液+蒸馏水的吸光度。
2.4.2.3O2-·自由基清除能力的测定[10]
取50mmol·L-1，pH8.20Tris-HCl缓冲液4.5mL（其中含有2mmol·L-1EDTANa2），加入0.3mL不同浓度的样液，25℃保温10min，然后加入25℃预温的4.5mmol·L-1的邻苯三酚（用10mmol·L-1HCl配制）0.2mL，混匀后迅速于干燥的比色皿中，在320nm下每隔半分钟测定一次吸光值（A），测到4min。
以等体积10mmol·L-1HCl代替邻苯三酚溶液为空白调零，对照组以等体积去离子水代替样品。
作吸光度随时间变化曲线的回归方程，其斜率为邻苯三酚的自氧化速率V，按下式计算样品对O2-·的清除率。
式中：
V对照-对照组邻苯三酚自氧化速率（△A/min）；V样品-样品组邻苯三酚自氧化速率（△A/min）。
2.4.2.4清除OH·自由基能力测定—邻二氮菲法[11]
取0.75mmol·L-1的邻二氮菲无水乙醇溶液1mL于试管中，依次加入2mL0.2mol·L-1醋酸钠缓冲溶液和1mL蒸馏水，充分混匀后，加入0.75mmol·L-1硫酸亚铁溶液1mL，混匀后加入0.01%双氧水1mL，37℃水浴加热50min，在536nm测其吸光值，所测吸光值为损伤管的吸光值。
未损伤管以1mL蒸馏水代替损伤管中1mL0.01%的双氧水，样品管以1mL样品代替损伤管中的1mL蒸馏水，操作方法同损伤管，以蒸馏水调零，测得536nm未损伤管和样品管的吸光值。
2.4.3钙螯合物抗菌性的测定
2.4.3.1菌种活化和菌悬液的制备
分别将大肠杆菌Esoherichiacoli、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis接种于固体斜面培养基上，37℃培养24h。
取活化培养好的菌株，用无菌生理盐水将菌苔洗下，采用菌落计数法制成菌体悬浮液，将菌悬液的菌数稀释为l×l08CFU/ml。
2.4.3.2抑菌圈的测定
采用管碟法（牛津杯法）测定[12]。
1mL菌悬液与15ml左右的营养琼脂培养基后摇匀，放置冷却后，用无菌镊子摄取已经干热灭菌的牛津杯，轻轻平置于平板表面，每皿等距放入4个牛津杯，每一菌种做2个平皿，用无菌微量注射器按顺序分别加入相应浓度的样品液0.25mL，平皿的中央用无菌生理盐水做对照。
细菌置于37℃培养箱进行培养，15h后测定抑菌圈直径。
2.5数据处理
实验平行次数3~5，取平均值作图。
采用图表法对所得到数据进行分析，并通过添加趋势线的方法分别计算DPPH·清除能力、O2-·自由基清除能力、清除OH·自由基能力的IC50值。
3结果与讨论
3.1鲨鱼肉酶解液钙螯合物各级乙醇沉淀产物的得率与性质
利用乙醇对螯合物进行分级沉淀，共有组分A（水不溶物）、组分B（50%乙醇不溶物）和组分C（80%
乙醇不溶物）三种产物，各级产物的得率如图1所示。
图1各级产物得率
Fig.1:
Theyieldofthreekindsproducts
其中水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物得率分别为：
0.85%、0.86%、1.03%。
三种产物经冷冻干燥后特征性质如下：
组分A：
灰白色粉末状，较细腻，不溶于水。
组分B：
浅褐色晶体状物质，具有一定的水溶性。
组分C：
深褐色晶体状物质，干燥前粘性较强，干燥后呈现颗粒状晶体，水溶性较好，在低浓度的醇溶液中也有良好的溶解性。
3.2酶解液钙螯合物的抗氧化性分析
.3.2.1螯合物的抗亚油酸氧化能力
油脂受到光、热、空气中氧的作用，发生酸败反应，分解出醛、酸之类的化合物，丙二醛即是其中的一种分解产物，它能与TBA（硫代巴比妥酸）作用生成粉红色化合物，在538nm处有吸收峰。
利用TBA法，以培养1、3，5，7，9天的亚油酸为原料，分别对水不溶物、50%乙醇不溶物、80%乙醇不溶物的抗氧化性进行测定，并与α-生育酚进行对比，结果如图2。
图2三种钙螯合物组分抗亚油酸氧化的能力
Fig.2Threekindsofcalciumchelatescomponentsresistancetolinoleicacidoxidationability
由图2可知，组分C（80%乙醇不溶物）的抗亚油酸氧化的效果最好，与α-生育酚抗氧化力比值在90.1%101.2%范围内；其次为组分B（50%乙醇不溶物），与α-生育酚抗氧化力比值在85.1%96.3%范围内；而组分A（水不溶物）抗氧化能力稍弱，与α-生育酚抗氧化能力的比值在79.6%96.9%范围内。
3.2.2螯合物的清除OH·自由基能力
机体在生命活动中会不断产生各种活性氧自由基（Reactiveoxygenspecies，ROS），引起DNA损伤、癌变、细胞衰老等，从而引发各种疾病，包括肿瘤、衰老、心脑系统损伤，并与神经系统及糖尿病并发症等很多疾病的发生密切相关[13]。
各种活性氧自由基中以羟自由基（·OH）作用最强，毒性最大。
·OH是一种氧化还原能力很强的自由基，可使体内蛋白质、核酸和多糖发生氧化而破坏。
因此，·OH的存在和人体的衰老、肿瘤等许多疾病有密切关系。
根据邻二氮菲-Fe2+的溶液呈红色，在536nm下产生吸收峰[14]。
当邻二氮菲-Fe2+被反应体系产生的羟自由基氧化后，红色褪去，536nm吸收值大幅下降。
当加入清除剂后，吸收值的下降速度减缓，以此来衡量样品清除羟自由基的能力。
以010mg·mL-1的浓度梯度分别测定了组分B（50%乙醇不溶物）与组分C（80%乙醇不溶物）清除OH·自由基能力，结果见图3与图4。
图380%乙醇不溶物清除OH·自由基能力
Fig3OH•freeradicalscavengingabilityof80%alcoholinsolubleproducts
由图3可以看出，组分C（80%乙醇不溶物）具有很好的清除O2-·能力，且与其浓度呈现一定的量效关系，在一定的范围内呈线性相关，其线性方程为y=6.4145X+12.173（R2=0.8321），计算得出其IC50值为5.60mg·mL-1。
图4组分B（50%乙醇不溶物）清除OH·自由基能力
Fig4OH•freeradicalscavengingabilityof50%alcoholinsolubleproducts
图4可以看出，组分B（50%乙醇不溶物）具有较好的清除O2-·能力，且与其浓度呈现一定的量效关系，并在一定的范围内呈线性相关，其线性方程为y=4.397X-2.424（R2=0.9664），计算得出其IC50值为11.92mg·mL-1。
由两者的IC50值可知，组分B的抗氧化效果明显较组分C差。
这可能与组分B的复溶性较差有关，也可能与两者形成螯合物的小肽氨基酸种类不同有关。
3.2.3螯合物的DPPH·清除能力
二苯代苦味酰自由基（DPPH·）在有机溶剂中是一种稳定的自由基，含有3个苯环，1个氮原子上有1个孤对电子，呈紫色，在517nm有强吸收[15]。
在有自由基清除剂存在时，DPPH·的单电子被配对而使其颜色变浅，在最大吸收波长处的吸光度变小，而且这种颜色变浅的程度与配对电子数是成化学计量关系的，因此可用于检测自由基的清除情况，该法简单快速，是最早用于测定抗氧化活性的间接方法[16]。
将组分C（80%乙醇不溶物）按010mg·mL-1的浓度梯度，测定其清除二苯代苦味酰自由基（DPPH·）的能力，结果见图5。
图5组分C（80%乙醇不溶物）清除二苯代苦味酰自由基（DPPH•）能力
Fig5DPPH•scavengingabilityof80%alcoholinsolubleproducts
由图5可见，组分C（80%乙醇不溶物）具有显著的清除DPPH·能力，酶解产物清除DPPH·的能力与其浓度呈现一定的量效关系。
当组分C的浓度达到10mg·mL-1时，其对DPPH·的清除能力可以达到80.18%，其线性方程为y=0.7427X2-1.4416X+20.552（R2=0.9955），计算得到其IC50值为7.318mg·mL-1。
3.2.4螯合物清除O2-自由基能力
超氧阴离子自由基（O2-·）可作为多数氧自由基的母体，在生物体内经过一系列反应生成其它自由基。
超氧阴离子自由基本身及其衍生的自由基均具有细胞毒性，会导致细胞DNA损伤及细胞膜损伤。
对超氧阴离子自由基的清除可以有效地减少氧自由基的生成，具有非常重要的意义[17]。
邻苯三酚在弱碱性环境中自身氧化分解产生O2-·和有色中间物（在320nm处有最大吸收峰），有色中间产物的积累在滞后3040s与时间成良好的线性关系，一般维持4min，随后减慢[18]。
O2-·对自氧化又起催化作用，依据有色中间物生成量的多少，可判断O2-·生成量的多少。
当有抑制剂存在时，可以将O2-·歧化分解成H2O和O2，从而抑制了邻苯三酚的自氧化，达到阻止中间产物的积累的目的[19]，根据数值的变化可判断产物清除O2-·的能力。
以024mg·mL-1的浓度梯度测定样品清除超氧阴离子（O2-·）的能力，结果见图6。
图6组分C（80%乙醇不溶物）清除超氧阴离子（O2-·）能力
Fig6TheO2-freeradicalscavengingabilityof80%alcoholinsolubleproducts
由图6可以看出，组分C（80%乙醇不溶物）具有较好的清除O2-·能力，抑制率与其浓度呈现一定的量效关系，在一定范围内呈线性增长，其一次线性方程为:
y=1.6865X+10.834（R2=0.982），计算得出其IC50值为23.22mg·mL-1。
通过以上4个指标的测定，显示组分C（80%乙醇不溶物）有较高的抗氧化性，其DPPH·清除能力、O2-自由基清除能力、OH·自由基清除能力的IC50分别为：
7.318mg·mL-1、23.22mg·mL-1、5.60mg·mL-1，分别以不同程度高于鲨鱼肉酶解液的抗氧化活性（另文报道）。
TBA法显示其抗氧化效果与VE接近。
夏松养[20]等以低值鱼蛋白为原料通过复合酶水解法和钙修饰法获得了蛋白质酶水解物的修饰产物并对其功能活性进行了初步研究，分析了三种螯合组分—水不溶物、50%乙醇不溶物和80%乙醇不溶物的抗氧化活性，结果发现组分水不溶物具有最高的抗氧化活性，且高达未螯合水解物抗氧化活性的1.4倍，a-生育酚的94％。
这与本实验鲨鱼肉酶解液钙螯合物抗氧化性的测定结果不一致，可能与酶解液组成、螯合物结构存在差异所致。
Bou等[21]对星鲨肉用五种不同酶进行酶解，研究其体外抗氧化活性，其中碱性蛋白酶酶解产物抗氧化活性最强，将该酶解产物经SephadexG-25分离后得到3个片段，其中分子量低于3500Da的活性最强，经分析其富含组氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、甘氨酸和精氨酸。
其他研究也表明蛋氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸和亮氨酸对清除自由基有较好的效果[22]。
研究表明鲨鱼肉酶解液中的碱性氨基酸赖氨酸、组氨酸、精氨酸在螯合金属离子时起了重要的作用[23]，而本实验利用的鲨鱼肉酶解物中上述氨基酸占总水解氨基酸量的49.71%（另文报道），使鲨鱼肉酶解液的钙螯合物具有较好的抗氧化性。
3.3钙螯合物的抗菌性测定
以大肠杆菌Esoherichiacoli、金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus和枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis为指示菌，测定组分B和C的抑菌圈直径，结果如表2。
表150%乙醇不溶物与80%乙醇不溶物对三种菌的抑菌圈
Table1TheBacteriostaticcircleof50%alcoholinsolubleand80%alcoholinsolubleproductsonthreekindsofbacteria
抑菌圈直径（mm）
螯合物浓度
大肠杆菌
金黄色葡萄球菌
枯草杆菌
组分B
组分C
组分B
组分C
组分B
组分C
0.1%
10
10
10
12
10
10
1%
11
13
11
14
11
13
由表1可见，组分B（50%乙醇不溶物）
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