观察DNA和RNA在细胞中的分布 实验方案.docx
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观察DNA和RNA在细胞中的分布实验方案
《观察DNA和RNA在细胞中的分布》
实验方案
第二组
一、实验前的思考2
二、背景资料2
1.核酸是什么?
2
2.DNA是什么?
3
3.RNA是什么?
3
4.DNA的种类和分布3
5.RNA的种类和分布3
6.染色剂成分4
7.染色原理5
三、实验原理5
四、实验目的6
五、实验用具及试剂6
六、实验方法及步骤分析6
1.实验材料6
2.实验方法6
七、注意事项8
八、附录9
1.试剂配制方法9
2.重要仪器的使用方法9
观察DNA和RNA在细胞中的分布
1、实验前的思考
实验前已经知道的知识
通过实验想知道的知识
实验之后获得了的知识
1.显微镜的使用方法；
2.临时装片的制作方法；
3.细胞中含有DNA和RNA两种核酸，DNA主要分布在细胞核中，RNA大部分存在于细胞质中；
4.细胞的基本结构。
1.Unna试剂如何将DNA和RNA染上不同颜色；
2.材料的选择、用不用盐酸水解、染色时间等对染色效果分别有什么影响，如何获得最佳的实验效果。
1.对Unna试剂与核酸结合的染色原理有了更深刻的认识；
2.比较分析不同实验步骤所获得的实验效果，学会优化实验；
3.验证了DNA和RNA在细胞中分布，对理论知识有了深刻感知。
2、背景资料
1.核酸是什么?
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。
DNA和RNA都是由一个一个核苷酸（nucleotide）头尾相连而形成的。
单个核苷酸是由含氮有机碱（称碱基）、戊糖（即五碳糖）和磷酸三部分构成的。
根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸（简称RNA）和脱氧核糖核酸（简称DNA）。
核酸是相邻二个核苷酸之间的连接键即：
3’，5’－磷酸二酯键。
这种连接可理解为核糖核酸基上的3'位羟基与相邻5'核苷酸的磷酸残基之间，以及核苷酸糖基上的5'位羟基与相邻3'核苷酸的磷酸残基之间形成的两个酯键。
2.DNA是什么?
DNA是由数量庞大的四种脱氧核苷酸按一定碱基顺序彼此用3’，5’-磷酸二酯键相连构成的长链。
3.RNA是什么?
RNA由核糖核苷酸经磷酯键缩合而成长链状分子。
一个核糖核苷酸分子由磷酸，核糖和碱基构成。
RNA的碱基主要有4种，即A腺嘌呤，G鸟嘌呤，C胞嘧啶，U尿嘧啶。
其中，U尿嘧啶取代了DNA中的T胸腺嘧啶而成为RNA的特征碱基。
4.DNA的种类和分布
原核细胞的遗传物质是一个长DNA分子，但是原核细胞没有真正的细胞核。
真核细胞核中有不止一个染色体，每个染色体也只含一个DNA分子。
不过它们一般都比原核细胞中的DNA分子大而且和蛋白质结合在一起。
DNA分子的功能是贮存决定物种的所有蛋白质和RNA结构的全部遗传信息；策划生物有次序地合成细胞和组织组分的时间和空间；确定生物生命周期自始至终的活性和确定生物的个性。
除染色体DNA外，有极少量结构不同的DNA存在于真核细胞的线粒体和叶绿体中。
DNA病毒的遗传物质也是DNA。
5.RNA的种类和分布
信使RNA。
mRNA的功能就是把DNA上的遗传信息精确无误地转录下来，然后再由mRNA的碱基顺序决定蛋白质的氨基酸顺序，完成基因表过程中的遗传信息传递过程。
在真核生物中，转录形成的前体RNA中含有大量非编码序列，大约只有25%序列经加工成为mRNA，最后翻译为蛋白质。
转运RNA。
如果说mRNA是合成蛋白质的蓝图，则核糖体是合成蛋白质的工厂。
但是，合成蛋白质的原材料——20种氨基酸与mRNA的碱基之间缺乏特殊的亲和力。
因此，必须用一种特殊的RNA——转移RNA（transferRNA，tRNA）把氨基酸搬运到核糖体上，tRNA能根据mRNA的遗传密码依次准确地将它携带的氨基酸连结起来形成多肽链。
每种氨基酸可与1-4种tRNA相结合，已知的tRNA的种类在40种以上。
核糖体RNA（ribosomalRNA），rRNA是组成核糖体的主要成分。
核糖体是合成蛋白质的工厂。
在大肠杆菌中，rRNA量占细胞总RNA量的75%-85%，而tRNA占15%，mRNA仅占3-5%。
rRNA一般与核糖体蛋白质结合在一起，形成核糖体（ribosome），如果把rRNA从核糖体上除掉，核糖体的结构就会发生塌陷。
原核生物的核糖体所含的rRNA有5S、16S及23S三种。
MicroRNAs（miRNAs）是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，其大小长约20~25个核苷酸。
成熟的miRNAs是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶的剪切加工而产生的，随后组装进RNA诱导的沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译。
最近的研究表明miRNA参与各种各样的调节途径，包括发育、病毒防御、造血过程、器官形成、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢等等。
小分子RNA存在于真核生物细胞核和细胞质中，它们的长度为100到300个碱基（酵母中最长的约1000个碱基）。
多的每个细胞中可含有105～106个这种RNA分子，少的则不可直接检测到,它们由RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ所合成,其中某些象mRNA一样可被加帽。
主要有两种类型的小分子RNA:
一类是snRNA（smallnuclearRNA）,存在于细胞核中；另一类是scRNA（smallcytoplasmicRNA），存在于细胞质中。
小分子RNA通常与蛋白质组成复合物,在细胞的生命活动中起重要的作用。
端体酶RNA（telomeraseRNA），它与染色体末端的复制有关。
反义RNA（antisenseRNA），它参与基因表达的调控。
6.染色剂成分
染色剂的主要成分为甲基绿和吡罗红，甲基绿和吡罗红在水中电离后，都产生带正电荷的阳离子。
甲基绿电离后产生两个正电荷，碱性较强。
吡罗红电离后产生一个正电荷，碱性较甲基绿弱。
甲基绿吡罗红
7.染色原理
甲基绿与派洛宁作为混合染料时，甲基绿与染色质中DNA选择性结合显示绿色或蓝色；派洛宁与核仁、细胞质中的RNA选择性结合显示红色。
其原因可能是两种染料的混合染液中有竞争作用。
DNA和RNA两种核酸分子都是多聚体，但是它们的聚合程度有所不同。
DNA聚合程度高，易于甲基绿结合[6]?
；RNA聚合程度低易于吡罗红结合。
所以当吡罗红与甲基绿混在一起作为染料时吡罗红与核仁、细胞质中的RNA选择性结合，从而显示红色；甲基绿与染色质中的DNA选择性结合，从而显示绿色。
综上所述，RNA对吡罗红的亲和力大，被染成红色；DNA对甲基绿的亲和力大，被染成绿色。
3、实验原理
细胞核内含有DNA以及核仁RNA等。
大部分的RNA存在于细胞质中。
此外，线粒体、叶绿体也含有DNA。
DNA和RNA核酸分子上磷酸基团带有负电荷密度差异，与甲基绿和吡咯红染料的亲和力不同，形成盐键，在原位沉淀显色，从而显示出不同类型的核酸在完整细胞中的分布。
其中，甲基绿与空间构型完整的DNA亲和力强，甲基绿分子中的两个含N基团带正电荷，正好与聚合程度高的DNA分子的带负电的磷酸基团相结合，这样DNA能被甲基绿染成蓝绿色。
RNA是单链，聚合程度较低，负电荷密度小，吡咯红与其磷酸基团结合在原位呈红色。
所以，甲基绿和吡咯红（Unna试剂）就是很好的选择性染色的混合碱性染液。
4、实验目的
1.巩固临时装片制备和显微镜操作的方法；
2.结合DNA和RNA的物理特性，阐述染色原理，掌握染色技术；
3.观察DNA和RNA在细胞中的分布，指出DNA和RNA在细胞中的具体位置。
5、实验用具及试剂
材料
人的口腔上皮细胞
用具
消毒牙签、载玻片、盖玻片、镊子、滤纸、烧杯、滴管、容量瓶、显微镜、试剂瓶、棕色试剂瓶
试剂
Unna试剂、0.9%Nacl溶液、8%盐酸
6、实验方法及步骤分析
1.实验材料
材料
理由
口腔上皮细胞
取材简单经济，易于得到单个细胞，细胞透明，便于观察。
2.实验方法
步骤
操作方法
作用
改进
1）制片
✍在洁净的载玻片上，滴一滴质量分数为0.9%的NaCL
✍用消毒牙签在自己漱净的口腔内壁上刮几下，把牙
签上附有碎屑的一端，放在上述载玻片的液滴中涂抹几下
✍点燃酒精灯，将涂有口腔上皮细胞的载玻片烘干
✍0.9%的NaCL溶液：
维持口腔上皮细胞的正常形态
✍烘干：
固定细胞，防止冲洗时将其冲掉
烘干杀死细胞，补充做一组烘干改为自然晾干的装片
2）水解
✍在小烧杯中加入30ml质量分数为8％的盐酸，将烘干的载玻片放入小烧杯中
✍在大烧杯中加入30℃温水
✍将盛有盐酸和载玻片的小烧杯放在大烧杯中保温5min
✍盐酸：
改变细胞膜的通透性，加速染色剂的跨膜运输。
同时，使染色体中的DNA与蛋白质分离，便于DNA与染色剂的结合。
✍30℃温水：
保持温度，利于反应更充分
✍盐酸会破坏DNA的结构，补充一组不用盐酸浸泡
✍盐酸会改变实验材料的pH值，补充一组在蒸馏水冲洗前用NaHCO3冲洗10秒
3）冲洗涂片
用蒸馏水的缓水流冲洗载玻片10秒，用吸水纸吸去载玻片上的水分
缓水流冲洗：
避免细胞被水冲掉
4）染色
✍将吡咯红甲基绿染色剂1-2滴在载玻片上，染色5分钟
✍吸去多余的染色剂，清水漂洗后，盖上盖玻片
漂洗：
去除染液浮色
染色时间影响染色效果，补充两组染色时间为2分钟、3.5分钟
5）观察
✍低倍镜观察：
选择染色均匀，色泽浅的区域，移至视野中央，将物象
调节清晰
✍高倍镜观察：
调节细准焦螺旋，观察细胞核和细胞质的染色情况
实验流程
滴加0.9%的NaCL的载玻片
涂抹口腔上皮细胞
酒精灯烘干
侵泡盐酸（9张）不侵泡盐酸（3张）
缓水冲洗NaHCO3冲洗不冲洗
（3张）（3张）（3张）
Unna试剂染色（同组装片的染色时间
依次为2、3.5、5min）
洗去染液浮色
显微镜镜检
（小组4名成员每人完成一组实验）
纪录实验结果
浸泡盐酸
NaHCO3冲洗
缓水冲洗
结果
是
是
是
2min
3.5min
5min
是
否
是
2min
3.5min
5min
是
否
否
2min
3.5min
5min
否
否
否
2min
3.5min
5min
7、注意事项
1.甲基绿吡咯红染液要现用现配，否则，染料会被氧化，影响染色效果。
同
时，为避免变质，需要使用棕色瓶盛放。
2.保证取到实验材料，即人的口腔上皮细胞的外部形态。
用消毒牙签的钝端刮
取，实验时要强调两点：
取材部位，是口腔侧壁，不是齿眼和齿缝；刮取的
力度为轻刮且有微痛感，过轻，则取不到口腔上皮细胞。
3.在制作人的口腔上皮细胞临时装片时，要用消毒牙签尽量把细胞抹开，避免
细胞重叠。
4.该实验需要观察染色情况，所选择的材料应为白色或无色，例如教材中选用
的植物材料为洋葱鳞片叶内表皮，而不能使用紫色外表皮。
5.实验中需要许多干净载玻片和盖玻片，应提前准备好；观察完的载玻片和盖
玻片应放入清水中浸泡，实验完成后应立即清洗干净烘干，并放入稀盐酸中
浸泡24小时，之后清洗干净烘干完后可放入95%酒精中保存。
6.显微镜的使用要注意：
持镜时必须是右手握臂、左手托座的姿势，不可单手
提取，以免零件脱落或碰撞到其它地方。
轻拿轻放，不可把显微镜放置在实
验台的边缘，以免碰翻落地。
7.使用完毕后，必须复原才能放回镜箱内，其步骤是：
取下标本片，转动旋转
器使镜头离开通光孔，下降镜台，平放反光镜，下降集光器（但不要接触反
光镜）、关闭光圈，推片器回位，盖上绸布和外罩，放回实验台柜内。
最后
填写使用登记表。
8、附录
1.试剂配制方法
✍Unna试剂：
A液：
吡罗红甲基绿粉1g加入蒸馏水溶解至100ml，置于棕色瓶中备用B液：
乙酸钠16.4g加入蒸馏水溶解至1000ml。
取乙酸12ml加入蒸馏水稀释至1000ml。
取稀释的乙酸钠溶液30ml和乙酸20ml，加蒸馏水50ml，配成pH为4.8的溶液。
取A液20ml、B液80ml,混合配成，现配现用。
✍8%盐酸：
取18.8ml的浓盐酸（36%~38%）加到蒸馏水中，蒸馏水定容到
100ml。
✍0.9%的氯化钠溶液：
用电子天平称量0.9g氯化钠，加少量蒸馏水溶解，蒸馏水定容到100ml。
2.重要仪器的使用方法
普通光学显微镜使用
✍用前的准备工作
a）打开镜箱，右手握住镜臂，左手托住镜座，小心地把显微镜从镜箱内取
出，轻轻地放在实验桌上。
b）检查显微镜的各部件是否完整和正常，如发现有部件损坏或出现故障，
应立即停止使用，待排除故障或修复后，才能继续操作。
✍低倍镜的使用
a）准备：
将显微镜放于前方略偏左侧，必要时使镜简倾斜（有的显微镜本
身已经倾斜）以便观察。
转动粗准焦螺旋，将镜筒略升高（或将载物台
下降）使物镜与载物台距离拉开。
以免物镜与载物台相碰。
然后旋转物
镜转换器，将低倍镜对准载物台中央的通光孔（可听到“咔嗒”声）。
b）对光：
打开光圈，上升聚光器，双眼同时睁开，双眼向目镜内观察，双
手并用，左手调焦，右手移片或绘图记录，同时调节反光镜的方向，使
视野内的光线均匀，亮度适中。
c）放标本片：
标本片的盖片朝上，将标本片放到载物台前方，然后推到物
镜下面，用压片夹压住，如有标本移动器，可用上面的弹簧夹夹住标本
片，然后把要观察的部分移到通光孔的正中央。
d）调节焦距：
从显微镜侧面注视物镜镜头，同时旋转粗准焦螺旋，使镜筒
缓慢下降（或载物台上升），低倍镜的镜头端与玻片问的距离约5mm
时，再用双眼从目镜里观察视野，左手慢慢转动粗准焦螺旋，使镜筒缓
缓上升（或载物台缓缓下降），直至视野中出现物像。
如物像不太清晰，
可转动细调节器．使物像达到最清晰为止。
✍高倍镜的使用
a）依照上述操作步骤，先用低倍镜找到清晰物像。
b）将需要观察的部分移到视野的中央。
c）眼睛从侧面注视物镜，用手移动转换器，换高倍镜。
d）眼睛向目镜内观察，同时微微上下转动细准焦螺旋，直至视野内看到清
晰的物像为止。
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