种子种苗快繁分解.docx

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种子种苗快繁分解

绪论（2学时）

重点内容：

一、概念

1、植物组织培养是指在无菌和人工控制的环境条件下，利用适当的培养基，对离体的植物器官、组织、细胞及原生质体进行培养，使其再生细胞或完整植株的技术，由于培养的植物材料已脱离了母体，又叫植物离体培养（plantcultureinvitro）。

2、无菌：

是指使培养皿、器械、培养基和培养材料等处于无真菌、细菌、病毒等微生物的状态，以保证培养材料在培养皿中正常生长和发育。

3、人工控制的环境条件：

是指对光照、温度、湿度、气体等条件进行人工控制，以满足植物培养材料在离体条件下的正常生长发育。

4、外植体（explant）：

由活植物体上切取下来用于组织培养的器官或组织叫外植体。

5、愈伤组织（callus），原是指植物在受伤之后表面形成的一团薄壁细胞，在组织培养中，则是在人工培养基上由外植体（explant）长出来的一团无序生长的薄壁细胞。

愈伤组织培养所以是一种最常见的培养形式，是因为除茎尖分生组织培养和一部分器官培养以外，其他几种培养形式最终也都要经历愈伤组织才能产生再生植株，此外，愈伤组织还常常是悬浮培养的细胞和原生质体的来源。

二、植物组织培养的特点：

植物组织培养的主要特点是采用微生物学的实验手段来操作植物离体的器官、组织和细胞。

这一特点具体表现在以下几个方面：

1、组织培养的整个过程都是在无菌条件下进行的，外植体、培养基、接种环境都须经过无菌处理。

2、组织培养在多数情况下是利用成分完全确定的人工培养基进行的，除少数特殊情况（如进行营养缺陷型突变细胞的筛选）外，培养基中包括了植物生长所需的水分和一切大量元素、微量元素、有机物和植物激素（phytohormone）。

培养基的PH和渗透压也是认为设定的。

因此，在组织培养中的植物材料不需依靠自身的光合作用制造养分，而是处于完全的异养状态。

3、组织培养的起始材料可以是植物的器官、组织，也可以是单个的细胞，它们都处于离体状态下。

细胞全能性不仅表现在二倍体细胞水平，而且也表现在单倍体细胞（如小孢子）和三倍体（如胚乳）水平上，即使是去掉了细胞壁的细胞（原生质体），在组织培养条件下也能再生完整植株。

4、组织培养通过连续继代培养可以不断增殖，形成克隆，或通过改变培养基成分，特别是其中的植物激素的种类和配比，而达到不同的实验目的，如茎芽增殖或生根。

5、组织培养是在封闭的容器中进行的，容器内气体和环境气体可通过瓶塞或其他封口材料进行交换。

容器内内的湿度在通常情况下几乎是100%，因此，组培苗叶表面一般都无角质层或蜡质层，且气孔保卫细胞功能缺乏，气孔始终都是张开的。

6、组织培养的环境温度、光照强度和时间等都是人为设定的，找出这些物理因素的最适参数对组织培养的成功也很重要。

三、植物组织培养的应用与展望

概括地说，组织培养系统在农业上的应用有以下几个方面：

1、植物离体快繁

2、病毒苗木培育

3、培育新品种或创造新物种

4、次生代谢物生产

5、植物种质资源的离体保存

6、人工种子

第一章实验室的基本设备和一般技术

本章重点内容：

灭菌技术、培养基

一、灭菌技术

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：

物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。

这些方法和药剂要根据工作中的不伺材料不同目的适当选用。

1、器具的灭菌

（1）干热灭菌法

利用鼓风干燥箱（烘箱）进行烘烤灭菌的方法。

此法适用于各种玻璃器皿和器械的灭菌消毒。

（2）高压蒸汽灭菌法

利用高压蒸汽灭菌的方法，是目前最常用的一种灭菌方法。

此法适用于培养基、蒸馏水、各种器械、棉塞、包头纸等的灭菌。

2、培养基的灭菌

菌种：

污染的病原分为细菌和真菌两大类。

细菌污染的特点是菌斑呈粘液状，而且在接种2-3天后即可发现。

真菌污染的特点是在接种5-10天才能发现不同颜色的霉菌。

发现污染的材料应及时处理。

污染来源：

培养基的污染有几个可能的来源：

①培养容器；②培养基本身；③外植体；④接种室的环境；⑤在接种和继代时用以操作植物材料的器械；⑥培养室的环境。

灭菌方法：

（1）高压蒸汽灭菌法

（2）过滤除菌法

一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。

3、外植体（植物材料）灭菌

（1）首先，将采来的植物材料除去不用的部分，将需要的部分仔细洗干净，如用适当的刷子等刷洗。

把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放入为宜。

置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，冲洗时间视材料清洁程度而宜。

（2）对材料的表面浸润灭菌。

要在超净台或接种箱内完成，准备好消毒的烧杯、玻璃棒、70％酒精、消毒液、无菌水、手表等。

用70％酒精浸10-30s。

（3）灭菌剂处理。

表面灭菌剂的种类较多，可根据情况选取1-2种使用见表4-2。

表4-2常用灭菌剂使用浓度及效果比较表（简单了解）

灭菌剂

使用浓度

持续时间/min

去除的难易

效果

次氯酸钙

90%~10%

5~30

易

很好

次氯酸钠

2%

5~30

易

很好

氯化汞

0．1%~1%

5~8

较难

最好

抗菌素

4~50mg/L

30~60

中

较好

灭菌时，把沥干的植物材料转放到烧杯或其他器皿中，记好时间，倒入消毒溶液，不时用玻璃棒轻轻搅动，以促进材料各部分与消毒溶液充分接触，驱除气泡，使消毒彻底。

（4）最后一步是用无菌水涮洗，涮洗要每次3min左右，视采用的消毒液种类，涮洗3-10次左右。

无菌水涮洗作用是免除消毒剂杀伤植物细胞的副作用。

外植体消毒的步骤如下所示：

二、培养基

（一）培养基的成分

培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机化合物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。

1、水

2、无机元素：

包括大量元素和微量元素

3、有机化合物

常加入的有机成分主要有以下几类：

（1）碳水化合物最常用的碳源是蔗糖、葡萄糖和果糖。

蔗糖使用浓度在2％～3％，常用3％，即配制1L培养基称取30g蔗糖，有时可用2.5％，但在胚培养时采用4％～15％的高浓度，因蔗糖对胚状体的发育起重要作用。

（2）维生素

（3）肌醇

（4）氨基酸

（5）植物激素

●生长素类：

在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。

●细胞分裂素类：

在培养基中添加细胞分裂素有三个作用：

①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，细胞分裂素与生长素相互作用，当组织内细胞分裂素／生长素的比值高时，诱导愈伤组织或器官分化出不定芽。

②促进细胞分裂与扩大。

③抑制根的分化。

因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。

生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、是长根还是长芽。

如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。

4、天然复合物

5、培养材料的支持物

（二）培养基的类型

1、含盐量较大的培养基

如MS培养基和改良的MS培养基。

该类培养基有利于愈伤组织的诱导、生长和细胞培养，是应用范围最广和适应性最强的培养基。

2、硝酸钾含量较高的培养基

这类培养基盐浓度也很高，尤其是硝酸钾的含量较高，如B5、N6、SH。

在禾谷类植物的花药、花粉和原生质体培养中得到广泛应用。

3、含盐量中等的培养基

这类培养基中大量元素为MS的1/2，微量元素种类减少，但含量增加，维生素种类比MS多，如H培养基。

4、低盐浓度的培养基

这类培养基包括White培养基WS和HE培养基等，其中white培养基由于无机盐的数量比较低，更适合木本植物的组织培养。

第二章植物组织培养的基本原理

本章重点内容：

一、概念：

植物细胞全能性是指植物的细胞具有发育为胚胎和植株的潜能，即植物细胞具有该植株全部遗传可能性，在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。

细胞分化是指导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。

细胞脱分化：

即失去分化细胞的典型特征，或消除了细胞分工，使之恢复到分生组织状态，或胚性细胞状态，即细胞脱分化。

再分化：

即脱分化后的分生细胞（愈伤组织）在特定的条件下（离体培养）下，重新恢复细胞分化能力，并经历器官发生形成单极性的芽或根，或经历胚胎发生形成双极性的胚状体，进一步发育成完整植物体，这一过程称为再分化。

二、离体培养形态发生和植株再生

外植体形态发生形成完整植株的途径

三、愈伤组织

（一）愈伤组织的特性

在不同的实验中由于目的的不同，对愈伤组织状态的要求也不完全相同，但优良的愈伤组织通常必须具备以下4个特性中2~3个特性：

1、高度的胚性或再分化能力，以便从这些愈伤组织得到再生植株。

2、容易散碎，以便用这些愈伤组织建立优良的悬浮系，并且在需要时能从中分离出全能性原生质体。

3、旺盛的自我增殖能力，以便用这些愈伤组织建立大规模的愈伤组织无性系。

4、经过长期继代保存而不丧失胚性，以便有可能对它们进行各种遗传操作。

为了达到以上目的，我们在诱导愈伤组织时通常采取的策略是：

1、选择适当的基因型和适当的外植体。

虽然几乎所有高等植物的器官和组织都可能产生愈伤组织，但同一物种内不同基因型在离体培养中的反应可能不同，同一植株不同部位的细胞在离体培养中的反应也可能不同。

2、选择正确的培养基，特别是正确的植物激素的种类和浓度，以及在需要配合使用生长素和细胞分裂素时，二者之间正确的配比。

（二）愈伤组织的形成：

在脱分化过程中，大多数情况下形成愈伤组织。

愈伤组织的细胞结构往往是异质性的，无明显极性，其形成过程可分为诱导期、细胞分裂期和形成期

愈伤组织的形成特点

（三）愈伤组织的形态建成：

外植体细胞在合适的培养条件下发生脱分化，再分化产生芽和根或形成胚状体，发育成苗或完整植株。

1、形态建成的方式：

离体培养条件下，经过愈伤组织再分化器官一般要经过3个生长阶段。

第一阶段是外植体经过诱导形成愈伤组织。

（愈伤组织的诱导，分裂，形成期）

第二阶段是“生长中心”形成。

第三阶段是器官原基及器官形成。

二、影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素

愈伤组织诱导、增殖及形态建成是一个连续的过程，主要受起始材料、培养基和培养环境等因素的调控。

图影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的因素

1、起始材料

（1）物种、基因型

不同物种外植体诱导的愈伤组织器官分化明显不同。

同属不同种，甚至同一物种不同基因型的愈伤组织器官分化的能力也不一样。

基因型是离体培养过程中影响愈伤组织诱导、增殖和形态建成的一个重要因素。

（2）外植体类型与生理状态

以不同器官作为外植体诱导的愈伤组织，其器官发生能力因植物而异，有的植物差别不大，有的则明显不同；外植体的生理年龄也影响愈伤组织器官发生的能力。

2、培养环境

（1）温度：

一般情况下愈伤组织诱导和增殖的最适温度为（25±2）℃

（2）光：

光对愈伤组织的诱导和增殖及分化既有促进作用，又有抑制作用。

光的作用反映在光照时间、方式、强度及波长上，一般光照强度为1500~2500lx。

3、培养基

（1）生长调节物质

培养基中生长调节物质对愈伤组织诱导及增殖起重要的调节作用。

在愈伤组织诱导、增殖和形态建成过程中，调控幅度最大的是植物生长调节物质，主要调节生长调节物质的种类、浓度和比例，其中生长素和细胞激动素的浓度和配比对外植体愈伤组织的诱导、增殖和形态建成的调控起重要作用。

Skoog和Miller提出“激素平衡”假说，即高浓度的生长素有利于根的形成，而抑制芽的形成，反之，高浓度的激动素促进芽的形成，而抑制根的形成。

（2）抗生素物质

研究把说明，某些抗生素对一些外植体愈伤组织的生长有促进或抑制作用。

（3）有机成分

在愈伤组织的诱导和继代培养基中，一般加入一定量的有机成分以满足愈伤组织生长和分化的要求，如糖、维生素类物质，氨基酸、肌醇、嘌呤和嘧啶类物质，以及酪蛋白质水解物及椰子汁等。

糖的种类和浓度对组织培养物的增殖和器官分化均有明显的影响。

糖的浓度还可以改变愈伤组织的鲜重和质地。

（4）培养基的PH：

一般培养基的PH为5.5~5.8。

（5）活性炭等惰性物质

活性炭有时会对愈伤组织的分化起到很好的作用。

第三章体细胞胚胎发生（4学时）

本章重点内容：

一、概念

体细胞胚胎：

而植物组织培养中经常出现一种起源于体细胞的特殊结构，其发育过程也象受精卵一样顺序通过原胚期、球形期、鱼雷期和子叶期各个阶段。

这种由愈伤组织的薄壁组织细胞不经有性过程而直接产生类似胚的这一结构，我们称之为胚状体。

人工种子：

是指将细胞培养中形成的在形态上和生理上均与合子胚相似的体细胞胚（胚状体）或不定芽包埋在能提供养分（人工胚乳）的胶囊里，再在胶囊外面包上一层具有保护功能和防止机械损伤的外膜（人工种皮），造成一种类似天然种子的结构。

二、植物体细胞胚胎发生的方式

由外植体诱导体细胞胚胎发生的途径有两种，即直接途径和间接途径。

直接途径是指从外植体某些部位的胚性细胞直接诱导分化出体细胞胚胎。

间接途径有两种情况：

是指外植体先脱分化形成愈伤组织，再从愈伤组织的某些细胞分化出体细胞胚胎

在大多数情况下，经过愈伤组织的胚胎发生需要3个培养阶段。

第一阶段是诱导外植体形成愈伤组织，第二阶段是诱导愈伤组织胚性化，第三阶段是体细胞胚形成。

首先，诱导愈伤组织（较高浓度2,4-D的培养基）→诱导愈伤胚性化（将上一步诱导出来的愈伤组织转移到降低2，4-D浓度的培养基中，浓度为初期诱导愈伤组织浓度的1/2，在此培养基中可见少数球形胚出现）→胚胎发育培养（将胚性愈伤组织再转入继续降低生长素浓度的胚胎发育培养基中）→体细胞胚大量产生。

三、体细胞胚胎发生的特点

植物体细胞胚胎建成和诱导器官发生相比具有明显的特点

特点

体细胞胚胎发生途径

器官发生途径

极性

在体细胞胚胎建成早期就具有胚根和胚芽两极性存在，成苗率高

单极性，生成不定根或不定芽。

成活能力弱

生理隔离

一旦形成，与母体靠极少的维管组织联系

不定根和不定芽往往与愈伤组织的维管组织连接

遗传稳定性

单细胞起源，无变异，遗传稳定性好，再生植株与亲本高度一致

多细胞起源，变异多，遗传不稳定，再生植株需要与亲本对照，进行选择

生长周期

短，繁殖系数高

长，繁殖系数低

四、影响体细胞胚胎发生的因素

（一）外植体：

外植体来源及生理状态不同，其体细胞胚发生能力各异。

（二）培养基

1、外源激素与体细胞胚的发生

（1）2,4-D与体细胞胚的发生

2,4-D是诱导多种植物离体培养体细胞转变为胚性细胞的重要激素。

（2）其他生长激素与体细胞胚的发生

在浓度适宜时，ABA能抑制多种异常体细胞胚的发生，而且ABA加入培养基的时间越早其效应约明显。

2、多胺（腐胺、尸胺、亚精胺、高亚精胺、精胺等）和乙烯与体细胞胚发生

3、糖类和金属离子与体细胞胚发生

1、糖的种类和浓度对诱导植物体体细胞胚发生有重要影响，体细胞胚的不同生长发育阶段对糖浓度的要求也不同。

2、金属离子对体细胞胚发生也有影响。

（三）培养环境

光照影响植物体细胞胚的发生，而且不同品种对光的作用反应各异。

五、人工种子

（一）人工种子的特点

与天然种子比较，人工种子具有以下特点：

1、可以用于固定优良基因组合杂种优势，且稳定快。

2、由生物工程产生的转基因植株和植物组织与细胞培养筛选获得的突变体，通过体细胞胚发生制作人工种子，迅速扩大繁殖，不受季节限制，可以大批量生产，提供充足种源，成本低，发芽速度和生长速度比较一致，体积小，运输方便，还可以直接播种和进行机械化操作等。

3、在制作人工种子过程中，加入农药、菌肥、激素等可以提高农作物抗病虫害的能力，加速作物生长和发育。

4、节约粮食

5、保存和快速繁殖脱病毒苗

（二）人工种子研制面临的问题

人工种子研制过程中涉及的问题较多，主要包括

1、要求高频率诱导体细胞胚发生，而且数量多，质量高

2、为使人工种子出苗整齐一致，必须使体细胞胚同步化

3、人工种皮材料必须不损害体细胞胚，同时又有利于发芽和生长，并经得起加工、贮藏和运输。

4、人工胚乳必须保证体细胞胚正常发育和提供充足营养，同时能防腐和防干

5、能够进行机械操作以便大量制种

6、提高体细胞胚产生正常植株的转换率。

7、掌握胚状体遗传变异的抑制技术

8、改进胚状体的包囊材料和包埋方法。

（三）人工种子的制备技术

人工种子制备主要包括体细胞胚的诱导与同步化控制、人工种子的包埋、人工胚乳的制作、人工种皮的研制等内容。

第四章无病毒苗木培育（4学时）

本章重点内容：

一、植物脱病毒的方法

当前脱除植物病毒的方法有4种：

茎尖培养脱毒法；热处理脱毒法；微体嫁接离体培养脱毒法；珠心组织脱毒法。

马铃薯茎尖培养脱毒法

1、茎尖脱毒的程序

同一品种个体之间在产量和病毒感染程度上有很大差异。

在脱毒之前，对准备进行脱毒复壮的马铃薯品种或材料进行田间选株和块茎选择。

田间选株要注意以下几方面的问题：

一是所选的植株必须符合品种的特征，包括株型、叶形、花色等生物学性状及熟期等农艺性状。

二是植株生长健壮，无明显的病害症状，包括病毒病、真菌、细菌性病害。

三是适时早收，挑选单株产量及大薯率高的单株。

选作脱毒的块茎应符合品种特征，包括皮色、肉色、薯形、芽眼等，无病斑、虫蛀和机械创伤的大薯块作脱毒材料。

马铃薯茎尖脱毒程序见图。

2、影响脱毒效果的因素

从培养基、外植体、培养条件等三个方面。

（1）外植体：

品种差异不同马铃薯品种（品系）的茎尖在相同的培养基和培养条件下，其成苗率存在很大差。

有的品种（品系）成苗快并且成苗率高，而有的品种很难获得再生植株。

剥离茎尖的大小剥离茎尖的大小是影响脱毒率和成苗率的重要因素。

离体茎尖愈大，愈易成活，但不易脱除病毒；茎尖愈小，脱毒率越高，但成苗较难。

叶原基是成苗的必要条件，不带叶原基的分生组织，易形成愈伤组织后，分化成不定芽，易发生突变，失去原品种的性状。

因此，茎尖大小应以生长点所带的叶原基数及其邻近组织的大小为标准。

一般以带1～2个叶原基，且尽量少带生长点的邻近组织为好，这样的茎尖既有一定的成苗率，也能脱除大多数病毒。

携带病毒种类病毒的种类不同，茎尖组织培养脱毒的难易程度有很大差别。

（2）培养基正确选择培养基可以显著提高获得完整植株的成功率。

在很多情况下，MS培养基对茎尖培养都是有效的。

一般来说，含有少量（0.1～0.5mg/L）的生长素或细胞分裂或二者兼有常常是有利的。

应避免使用2，4-D，因为它通常能诱导外植体形成愈伤组织，广泛使用的生长素是NAA和IAA。

此外，在培养过程中一般马铃薯茎尖组织有几种生长发育类型，应根据不同的类型，改变生长调节剂（主要是生长素）的浓度及处理时间。

（3）培养条件

在茎尖培养中，光下培养的效果通常比暗培养效果好，如马铃薯茎尖培养时，当茎已长到1cm高时光照强度便增加到4000Lx。

第五章植物的离体繁殖（4学时）

本章的重点内容：

一、离体快繁的程序

利用组织培养技术对园林植物进行快速繁殖，其基本生产环节可用图5—1流程图表示。

1、初代培养：

根据初代培养时发育的方向可分为：

顶芽和腋芽的发育、不定芽的发育、体细胞胚状体的发生和原球茎。

2、继代培养

继代培养中扩繁的方法包括：

切割茎段、分离芽丛、分离胚状体、分离原球茎等。

3、生根培养

当材料增殖到一定数量后，就要使部分培养物分流到生根培养阶段。

若不能及时将培养物转到生根培养基上去，就会使久不转移的苗子发黄老化，或因过分拥挤而使无效苗增多造成抛弃浪费。

根培养是使无根苗生根的过程，这个过程目的是使生出的不定根浓密而粗壮。

生根培养可采用1／2或者1／4MS培养基，全部去掉细胞分裂素，并加入适量的生长素（NAA、IBA等）。

4、试管苗移栽驯化

通常采取的措施有：

对外界要增加湿度、减弱光照；对试管内要通透气体、增施二氧化碳肥料、逐步降低空气湿度等。

（1）移栽用基质和容器

适合于栽种试管苗的基质要具备透气性、保湿性和一定的肥力，容易灭菌处理，并不利于杂菌滋生的特点，一般可选用珍珠岩、蛭石、砂子等。

（2）移栽前的炼苗

移栽前可将培养物不开口移到自然光照下锻炼2-3d，让试管苗接受强光的照射，使其长得壮实起来，然后再开口练苗1-2d，经受较低湿度的处理，以适应将来自然湿度的条件。

（3）移栽和幼苗的管理

从试管中取出发根的小苗，用自来水洗掉根部粘着的培养基，要全部除去，以防残留培养基滋生杂菌。

保持小苗的水分供需平衡

防止菌类滋生

一定的温、光条件适宜的生根温度是18-20℃。

温度过低会使幼苗生长迟缓，或不易成活。

温度过高会使水分蒸发，从而使水分平衡受到破坏，并会促使菌类滋生。

另外在光照管理的初期可用较弱的光照，如在小拱棚上加盖遮阳网或报纸等，以防阳光灼伤小苗和增加水分的蒸发。

当小植株有了新的生长时，逐渐加强光照，后期可直接利用自然光照。

促进光合产物的积累，增强抗性，促其成活。

保持基质适当的通气性要选择适当的颗粒状基质，保证良好的通气作用。

在管理过程中不要浇水过多，过多的水应迅速沥除，以利根系呼吸。

综上所述，试管苗在移栽的过程中，只要把水分平衡、适宜的介质、控制杂菌和适宜的光、温条件控制好，试管苗是很容易移栽的。

二、离体快繁中出现的问题和解决的途径

（一）初代培养外植体的褐变

外植体褐变是指在接种后，其表面开始褐变，有时甚至会使整个培养基褐变的现象。

它的出现是由于植物组织中的多酚氧化酶被激活，而使细胞的代谢发生变化所致。

在褐变过程中，会产生醌类物质，它们多呈棕褐色，当扩散到培养基后，就会抑制其他酶的活性，从而影响所接种外植体的培养。

1、影响褐变的主要原因

（1）植物品种研究表明，在不同品种间的褐变现象是不同的。

由于多酚氧化酶活性上的差异，因此，有些花卉品种的外植体在接种后较容易褐变，而有些花卉品种的外植体在接种后不容易褐变。

因此，在培养过程中应该有所选择，对不同的品种分别进行处理。

（2）生理状态由于外植体的生理状态不同，所以在接种后褐变程度也有所不同。

一般来说，处于幼龄期的植物材料褐变程度较浅，而从已经成年的植株采收的外植体，由于含醌类物质较多，因此褐变较为严重。

一般来说，幼嫩的组织在接种后褐变程度并不明显，而老熟的组织在接种后褐变程度较为严重。

（3）培养基成分浓度过高的无机盐会使某些观赏植物的褐变程度增加，此外，细胞分裂素的水平过高也会刺激某些外植体的多酚氧化酶的活性，从而使褐变现象加深。

（4）培养条件不当如果光照过强、温度过高、培养时间过长等，均可使多酚氧化酶的活性提高，从而加速被培养的外植体的褐变程度。

2、预防褐变的措施

（1）选择合适的外植体最好选择生长处于旺盛的外植体，这样可以使褐变现象明显减轻。

（2）合适的培养条件无机盐成分、植物生长物质水平、适宜温度、及时继代培养均可以减轻材料的褐变现象。

（3）使用抗氧化剂在培养基中，使用半胱氨酸、抗坏血酸等抗氧化剂能够较为有效地避免或减轻很多外植体的褐变现象。

另外使用0.1％-0.5％的活性炭对防止褐变也有较为明显的效果。

（4）连续转移对容易褐变的材料可间隔12-24h的培养后，再转移到新的培养基上，这样经过连续处理7-lOd后，褐变现象便会得到控制或大为减轻。

（二）继代培养时材料的玻