木豆叶总黄酮测定方法的比较研究精.docx
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木豆叶总黄酮测定方法的比较研究精
植物研究2011,
31（4:
499502BulletinofBotanicalResearch
基金项目:
林业公益性行业科研专项经费项目（201004040;科技部农业科技成果转化资金项目（2009GB23600514第一作者简介:
赵恩泽（1988—,男,硕士研究生,从事植物药有效成分提取研究。
*
通讯作者:
E-mail:
fuyujie1967@yahoo．com．cn收稿日期:
2011－03－15
木豆叶总黄酮测定方法的比较研究
赵恩泽
1,2
金时
1,2
魏作富
1,2
魏巍
1,2
付玉杰
1,2*
（1．东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室,哈尔滨150040;2．东北林业大学林业生物制剂教育部工程研究中心,哈尔滨150040
摘要采用比色法测定木豆叶中的总黄酮含量。
对三氯化铝比色法、硼酸—柠檬酸比色法和硝酸铝比色法3种
测定方法进行比较,确定了硝酸铝比色法为木豆叶总黄酮的最佳测定方法,该方法稳定性、精密度和重现性好,其
RSD分别为2．1%、0．9%和2．3%,应用该方法测定木豆叶总黄酮含量为15．65mg·g－1
DW。
本方法适用于木豆
叶或其制剂中总黄酮的质量分析检验,为木豆叶中黄酮的研究开发提供了质控依据。
关键词
木豆叶;总黄酮;比色法
中图分类号:
S567．2
文献标识码:
A
文章编号:
1673－5102（201104－0499－04
ComparisonoftheDeterminationMethodsforTotal
FlavonoidsinPigeonPeaLeaves
ZHAOEn-Ze1,
2
JINShi1,
2
WEIZuo-Fu1,
2
WEIWei1,
2
FUYu-Jie1,
2*
（1．KeyLaboratoryofForestPlantEcologyofNortheastForestryUniversity,MinistryofEducation,Harbin150040;2．EngineeringResearchCenterofForestBio-preparation,
MinistryofEducation,NortheastForestryUniversity,Harbin150040AbstractAlCl－3,boricacid-citricacid-andAl（NO3-basedcolorimetricassayswerecomparedtodeterminethetotalflavonoidsinpigeonpealeaves．TheresultsindicatedthatAl（NO3colorimetricassaywasthemostap-propriateforthedeterminationoftotalflavonoidsinpigeonpealeaves．Thestability,precisionandrepeatability
wereverygood,withRSDbeing2．1%（n=3,
0．9%（n=3and2．3%（n=5,respectively．Thecontentoftotalflavonoidsinpigeonpealeaveswas15．65mg·g－1DW．Themethodisappropriateforthequantitativede-terminationoftotalflavonoidsinpigeonpealeavesandtheirpreparations．Itcanbereferencedforthequalitycontrolofpigeonpealeaves．
Keywordspigeonpealeaves;totalflavonoids;colorimetricassay木豆（Cajanuscajan（L．Millsp．系豆科（Le-guminosae木豆属（Cajanus木本植物,广泛分布于热带和亚热带地区,
其叶具有重要的药用价值,在国内外的民间医药中用于镇痛、肝炎、结石、黄疸、小儿水痘和糖尿病等症
[12]
。
在现代医药中以木豆叶为单味药的通络生骨胶囊具有活血祛瘀,通络
生骨的功效,已在临床应用20多年[3]
。
药理学调查显示木豆叶中有效活性成分主要是黄酮类和芪
类化合物等
[45]
。
其中,木豆叶中黄酮类化合物种类繁多、难于获得全部对照品限制了单一组分含量
的测定,因此总黄酮含量已成为评价木豆叶药用质量的重要标准。
目前分光光度比色测定总黄酮的方法以其操
作简单、结果准确可靠等优点,广泛应用于生产中的质量控制,并已被各国药典收录。
但是,不同药用植物黄酮类组成不同,其适宜的测定方法也有所区别,比如土茯苓中总黄酮适宜采用以芦丁为对照
品的三氯化铝比色法测定[6]
、硼酸—柠檬酸法测
定苦荞中总黄酮的精确度最佳[7]
而卫矛中总黄酮则适宜采用硝酸铝比色法测定[8]
。
对于木豆叶
中总黄酮的研究,
仅刘中秋等[9]
以牡荆苷为对照品采用硝酸铝比色法对生脉成骨片中木豆叶总黄
酮提取工艺进行优化,所得结果适合以碳苷类为主
的总黄酮测定（其含量为0．86mg·g－1
。
我们的
前期研究发现木豆叶中除黄酮碳苷类外,还含有大量的黄酮氧苷和苷元类活性成分,因此,建立一种具有指导意义的木豆中总黄酮测定方法是必要的。
本文通过比较三氯化铝比色法、硼酸—柠檬酸比色法和硝酸铝比色法并对硝酸铝比色法进行改进,以期为测定木豆叶总黄酮含量建立准确、快捷、简便的方法,并为木豆叶质量控制提供依据。
1材料与方法
1．1材料与主要仪器
木豆叶2010年9月采自海南省东方市人工种植基地,当年生,三出复叶,叶片卵状披针形,全缘,阴干后带回室内保存备用。
KQ-250DE型数控超声清洗器（昆山市超声仪器有限公司;紫外/可见分光光度计（2550型,日本Shimadzu公司;RE-52D旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂;SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司。
1．2方法
1．2．1样品溶液的制备
取木豆叶样品,置于60ħ烘干,粉碎,备用。
精确称取木豆叶粉末10．00g,置于250mL锥形瓶中,加入50%乙醇100mL,在超声波功率250W、温度5065ħ条件下超声提取30min3次。
提取液合并,浓缩至一定体积,用等体积的石油醚连续萃取3次,脱脂,萃取后得到的水相浓缩至干,35%甲醇溶出,用0．45μm微孔滤膜过滤,备用。
1．2．23种比色法标准曲线建立及样品测定精确称取芦丁和牡荆苷对照品10．00mg,置于10mL容量瓶中,用无水甲醇溶解,混匀,定容,使之成为浓度为1．00mg·mL－1的溶液作为对照品储备液。
精密吸取对照品溶液0．0、0．1、0．2、0.3、0．4、0．5mL或样品溶液1mL分别置10mL容量瓶中,各加0．1mol·L－1三氯化铝溶液2mL,1mol·L－1醋酸钾溶液3mL,加甲醇至刻度,混匀,静置30min,于420nm波长处测定吸光值。
分别吸取对照品溶液0．0、0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mL或样品溶液2mL,置于25mL容量瓶,加入等体积混合的10%柠檬酸丙酮液－0．8%硼酸显色液5mL,丙酮定容至刻度后,于400nm处测定吸光值。
精密量取对照品溶液0．0、0．1、0．2、0．3、0．4、0．5mL或样品溶液1mL,分别置于10mL量瓶中,加10%亚硝酸钠溶液0．3mL,混匀,静置6min;加10%硝酸铝溶液0．3mL,混匀,静置6min;加1mol·L－1氢氧化钠溶液4mL,加35%乙醇至刻度,混匀,静置15min,于510nm处测定吸光值。
以上述3种方法测定的对照品吸光度为纵坐标,浓度为横坐标,绘制标准曲线。
1．2．3稳定性实验
取已制备样品3份按三氯化铝比色法、硼酸—柠檬酸比色法和硝酸铝比色法操作步骤,显色后过滤,温室放置0、10、20、30min、1h和3h,测定样品溶液的吸光值,并计算RSD。
1．2．4精密度和重现性实验
取已制备样品9份,分成3组,分别按3种比色法操作步骤显色后过滤,测定其吸光度,每个样品测定5次。
1．2．5加样回收率实验
取已制备样品9份,分成3组,各加适量的对照品芦丁,分别按3种比色法操作步骤显色后过滤,测定其吸光度,并计算出加样回收率。
2结果与分析
2．13种比色法标准曲线的建立
以芦丁和牡荆苷对照品配置成不同梯度浓度,每个浓度重复测定三次,取吸光值平均值,以对照品浓度（mg·mL－1为横坐标,吸光值为纵坐标绘制标准曲线,以最小二乘法作线性回归处理,得回归方程分别为（A为吸光度,C为浓度mg·L－1:
三氯化铝比色法芦丁与牡荆苷的标准曲线分别为:
A=20．575C+0．009,R2=0．997;A=13.142C+0．006,R2=0．999。
硼酸—柠檬酸比色法标准曲线:
A=24．670C+0．007,R2=0．999;A=18．277C－0．001,R2=0．997。
硝酸铝比色法标准曲线:
A=15．877C－0．009,R2=0．999;A=12.249C+0．0032,R2=0．994。
3种方法的相关系数R2表明标准曲线在对照品浓度范围内线性良好。
2．2样品前处理对测定结果的影响
3种比色法测定木豆叶中总黄酮含量如图1所示,不同比色法和对照品过滤前后测得的结果不同。
其中,硝酸铝比色法的测量值最大,其次是三氯化铝比色法,最小为硼酸—柠檬酸比色法,因为三氯化铝和硼酸—柠檬酸比色法分别对二氢黄酮醇及其黄酮苷类和含羰基的黄酮具有专一性[1011]。
尽管牡荆苷为木豆叶中的特征性黄酮类化合物,但因其属于碳苷类,不适合作为总黄酮分析的对照品,因此通用的芦丁对照品仍是最适合的。
在测定样品实验过程发现硝酸铝显色后溶液
005植物研究31卷
有浑浊现象,因此将样品显色后过滤再测定吸光值。
过滤后三氯化铝和硼酸—柠檬酸比色法测量值变化不大,都小于3%,而硝酸铝比色法的以芦丁和牡荆苷为对照品测量值分别为15．65和12．7mg·g－1DW,减小17．6%和15．0%。
这是因为木豆叶中包含花色苷类和绿原酸等化合物,在碱性条件下形成沉淀出现浑浊现象
。
2．3
稳定性比较
从表1中60min内各方法测定吸光值中三氯
化铝比色法吸光值较明显变化RSD值为7．1%,
硼酸—柠檬酸和硝酸铝比色法60min吸光值无明显变化RSD值分别为1．9%和2．1%。
表1
3种方法稳定性结果
Table1
Resultsofstabilityexperimentsofthreemethods
方法Method
时间Time（min0
10
30
60
RSD（%三氯化铝比色法AlCl3colorimetry
0．4370．4380．4270．421
7．1硼酸—柠檬酸比色法
Boricacid-citricacidcolorimetry
0．4720．4730．4700．465
1．9硝酸铝比色法Al（NO3colorimetry
0．5380．5390．5370．533
2．1
2．4精密度比较
从精密度实验计算的三氯化铝比色法、硼酸—
柠檬酸比色法和硝酸铝比色法结果分别为:
1．6%、2．0%和0．9%（表2。
说明3种方法结果都在误差范围内,说明测定的数据均可信,但硝酸铝比色法的效果较好,更可靠。
表2
3种方法精密度结果
Table2
Resultsofprecisionexperimentsofthreemethods
样品编号No．三氯化铝法AlCl3
硼酸—柠檬酸法Boricacid-citricacid硝酸铝法Al（NO3吸光值
AbsorbanceRSD（%吸光值
AbsorbanceRSD（%吸光值
AbsorbanceRSD（%10．4360．471
0．53520．4381．6
0．4732．0
0．5350．9
3
0．434
0．468
0．533
2．5
重现性比较
表3数据表明,
3种方法的重现性较好,RSD都小于3%,在误差范围内,
3种方法的测定的吸光值平均值分别为0．435、
0．471和0．536。
表3
3种方法重现性结果
Table3Resultsofrepeatabilityexperimentsofthree
methods
样品
编号No．三氯化铝法AlCl3硼酸—柠檬酸法Boricacid-citricacid硝酸铝法Al（NO3吸光值
AbsorbanceRSD（%吸光值
AbsorbanceRSD（%吸光值
AbsorbanceRSD（%10．4360．4690．53520．4400．4710．5353
0．4312．9
0．4722．4
0．5402．3
40．4360．4680．5365
0．434
0．475
0．533
2．6加样回收率比较
3种比色法加样回收率的结果如表4,由表可
知3种方法中硝酸铝法回收率平均值为100．2%,RSD最小为1．6%,在误差范围内说明其测定总黄酮的准确度高。
表4
3种比色法加样回收率结果
Table4
Resultsofrecoveryexperimentsofthreemethods
加入量Addition（mg三氯化铝法AlCl3硼酸—柠檬酸法Boricacid-citricacid硝酸铝法Al（NO3回收率Recovery（%RSD（%
回收率Recovery（%RSD（%
回收率
Recovery
（%RSD
（%
0．01
97．197．198．50．0299．72．198．73．899．61．6
0．03
102．3
105．7
102．4
从上述比较实验可知经过滤的硝酸铝比色法
为测定木豆叶中总黄酮的最佳方法,本法以芦丁为对照品,紫外检测波长为510nm,标准曲线的相关
1
054期赵恩泽等:
木豆叶总黄酮测定方法的比较研究
系数R2=0．999,在60min内检测稳定,精密度相对标准偏差为0．9%。
重现性实验相对标准偏差为2．3%,平均加样回收率为100．2%,用本法测定木豆叶中总黄酮含量为15．65mg·g－1DW。
3结论
比色法是测定总黄酮的快捷、简便、成本较低的方法。
本研究发现三氯化铝比色法和硼酸—柠檬酸比色法由于具有一定的专属性,在测定木豆叶中总黄酮时测定值偏小,与土茯苓[12]和银雀树叶[13]中总黄酮结果相似。
但实验中发现硝酸铝比色法在加入反应试剂后有浑浊现象,是因为花色苷和绿原酸的影响[14],实验经过滤除去杂质对硝酸铝比色法进行改进,测定木豆叶中总黄酮数据准确、稳定性高、重现性好。
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