发酵工程技术制药.ppt

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发酵工程制药发酵工程制药第一节：

微生物细胞工程（发酵工程制药）第一节：

微生物细胞工程（发酵工程制药）生产原理生产原理第二节：

利用微生物进行药物的生产实例第二节：

利用微生物进行药物的生产实例一、一、发酵生产过程发酵生产过程生产用菌种生产用菌种-原始材料原始材料-培养基培养基-程序程序-生产细则生产细则-以青霉素为例讲解以青霉素为例讲解

（1）青霉素（）青霉素（penicillin）所用菌种所用菌种-黄青霉黄青霉菌菌原始材料原始材料-氨基氨基已二酸、半胱氨酸、已二酸、半胱氨酸、缬氨酸。

缬氨酸。

发酵方法发酵方法-加前体加前体物质的深层发酵法。

物质的深层发酵法。

青霉素发现者弗莱明青霉素发现者弗莱明沙土管菌种沙土管菌种转移到固体琼脂斜面培养基上，转移到固体琼脂斜面培养基上，24培养培养5-6天，获得芽孢天，获得芽孢芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养芽孢悬浮于无菌水中，进行摇瓶培养进入移种瓶培养进入移种瓶培养进种子罐，接种量为进种子罐，接种量为5%-10%进繁殖罐，进繁殖罐，28培养培养48-96小时小时进入发酵罐，开始生产。

进入发酵罐，开始生产。

鼓式过滤鼓式过滤第一次萃取器第一次萃取器纯化柱纯化柱第二次萃取器第二次萃取器第三次萃取器第三次萃取器真空结晶釜真空结晶釜瓷过滤器瓷过滤器结晶洗涤釜结晶洗涤釜真空干燥器（结束）真空干燥器（结束）程序程序

（1）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的）使用消沫剂，由于发酵过程中产生大量的CO2，会产，会产生大量泡沫。

可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处生大量泡沫。

可采用植物油、豆油、合成消沫剂进行消沫处理。

理。

（2）温度控制在）温度控制在24-30、PH值控制在值控制在6.8-7.2。

（3）应该注意控制残糖量、还原糖量、）应该注意控制残糖量、还原糖量、PH值、氨、氮、溶值、氨、氮、溶解氧量。

解氧量。

（4）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须是无）发酵过程中要注意通气搅拌，所通入的空气必须是无菌的。

菌的。

（5）发酵罐必须保持正压（）发酵罐必须保持正压（20-30kPa），以防罐外不洁净），以防罐外不洁净的空气流入。

的空气流入。

（6）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到）目前国际上青霉素发酵的水平已经达到8万多单位万多单位/ml，相当于，相当于50g/L。

生产细则生产细则二、二、灭菌技术灭菌技术灭菌操作是为了保证杂菌不进入工业发酵系统。

（一）灭菌项目

（一）灭菌项目

（二）灭菌方法

（二）灭菌方法（三）灭菌的矛盾之处（三）灭菌的矛盾之处（四）具体的灭菌技术（四）具体的灭菌技术

（一）灭菌项目

（一）灭菌项目1、在投入生产之前，必须对设备、管道进行彻底清洗、和严格灭菌。

2、对通入的培养基、通入的空气进行先行灭菌。

（二）灭菌方法

（二）灭菌方法2、化学法1、加热法3、辐射法4、过滤法（三）灭菌的矛盾之处（三）灭菌的矛盾之处对杀灭细菌的同时1、培养基中的营养成份也随之遭到分解和破坏。

2、杀死杂菌的同时也杀死了工程细菌。

（四）具体的灭菌技术（四）具体的灭菌技术可分为6种技术：

1、间歇灭菌法、间歇灭菌法2、加热灭菌法、加热灭菌法3、连续灭菌法、连续灭菌法4、空气加热灭菌法、空气加热灭菌法5、空气过滤灭菌法、空气过滤灭菌法6、营养物质瞬时高温杀菌法、营养物质瞬时高温杀菌法1：

间歇灭菌法：

间歇灭菌法又称为分批灭菌，是指将培养基放在发酵罐内，然后连罐加热到规定的灭菌温度。

（1）灭菌方法）灭菌方法

（2）注意事项）注意事项（3）间歇灭菌法的优点）间歇灭菌法的优点

（1）灭菌方法）灭菌方法间歇灭菌的操作过程分为3个过程：

加热-保温维持-冷却。

这些不同的阶段，均能够起到灭菌的作用。

然而，在灭菌过程中，保温杀菌的作用是主要的，冷却杀菌的作用最小。

（2）注意事项）注意事项应当避免过长的加热时间，否则常常会破坏培养基中的营养物质。

系统经过灭菌操作之后，必须达到不留1个杂菌，否则，只要经过1昼夜的增殖，1个杂菌就会增加到272个杂菌，最后会导致整批发酵液的失败。

（3）间歇灭菌法的优点）间歇灭菌法的优点设备造价低廉。

便于进行手动操作。

2：

加热灭菌法：

加热灭菌法隧道灭菌箱设备3：

连续灭菌法：

连续灭菌法

（1）定义）定义

（2）技术分类）技术分类（3）连续灭菌法的优点）连续灭菌法的优点（4）连续灭菌法的不足）连续灭菌法的不足

（1）定义）定义连续灭菌法是指灭菌的操作的加热、保温维持、冷却这三个过程，在同一时间内进行。

因此，在连续灭菌系统中，需要分别设置加热设备、保温维持设备、冷却设备。

（2）技术分类）技术分类连续灭菌法可以分为2种：

（1）加热、冷却缓慢交替进行方法。

（2）迅速升温+闪急冷却方法-这种方法称为HTST方法，这对于保证营养物质极为有利。

（3）连续灭菌法的优点）连续灭菌法的优点

（1）可减少培养剂中营养物质的损失、提高产物收率。

（2）由于操作条件恒定，可以获得稳定的灭菌质量。

（3）容易实现自控操作。

（4）能够避免系统的反复加热和冷却，可提高热利用率。

是目前很多制药厂经常采用的方法。

（4）连续灭菌法的不足）连续灭菌法的不足

（1）投资较大，

（2）需要同时设置加热、冷却装置。

4：

空气加热灭菌法：

空气加热灭菌法利用空气压缩时产生的高温，使得微生物体内的蛋白质变性，而达到杀菌目的，这种方法称为空气加热灭菌法。

不同温度下的空气细菌存活时间：

200/15.1s，250/5.1s，300/2.1s，350/1.05s。

干热杀菌的流程通常是：

先采用废热，将空气预热到60-70，然后进入压缩机压缩，并在200以上的温度维持一段时间。

以便杀死杂菌，然后再进入发酵罐之中。

5：

空气过滤灭菌法：

空气过滤灭菌法是指让空气通过过滤介质，以阻截空气中所含的微生物，取得无菌空气的目的。

空气过滤分为2种：

（1）绝对过滤）绝对过滤

（2）深层过滤）深层过滤陶瓷过滤机陶瓷过滤机

（1）绝对过滤）绝对过滤如超滤膜过滤就属于绝对过滤是指所用滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。

从而把颗粒截留。

（2）深层过滤）深层过滤是凭借滤层内的曲折通道，而将颗粒截留的方法。

它不要求滤膜的孔径小于空气中的固体颗粒。

这是目前发酵工业常用的过滤除菌方法。

深层过滤所用的过滤介质-棉花、活性碳、玻璃纤维、合成纤维、各种有机或无机的烧结材料（烧结金属、烧结陶瓷、烧结塑料、蒙乃尔合金粉烧结板）、超细玻璃纤维、超细玻璃纤维过滤纸，微孔聚合物（聚乙烯醇PVA过滤板、PVA烧结板等已经在日本的发酵工业中广泛应用）。

6：

营养物质瞬时高温杀菌法：

营养物质瞬时高温杀菌法一般来说，当温度升高时，微生物死亡速率的增加营养物质遭到破坏的速率。

因此，对于瞬时的高温，细菌常常被杀死，而营养物质则破坏得不多。

根据这一原理，可以采用营养物质瞬时高温杀菌法进行杀菌操作。

三、三、分离纯化技术分离纯化技术微生物的发酵产物是一种混合物，里面除了含有主要产物以外，还含有未能转化的基质和底物、残余的原料、大量的水、微生物细胞、各种杂质。

因此，必须对发酵产物进行分离和纯化。

分离和纯化过程被称作“下游加工过程”，需要经过以下这几个阶段：

（一）固体物质的去除，

（一）固体物质的去除，

（二）初步分离，

（二）初步分离，（三）产品提纯，（三）产品提纯，（四）产品的最终分离。

（四）产品的最终分离。

（一）固体物质的去除

（一）固体物质的去除1、目的、目的2、常用的方法有、常用的方法有3、常用的设备、常用的设备4、固体物质的前期预处理技术、固体物质的前期预处理技术1、目的、目的

（1）分离出完整的细胞。

（2）将细胞进行溶菌处理，提取细胞内的生物产品。

（3）除去细胞有残留碎片。

（4）除去没有转化的不溶性基质。

（5）一部分细胞返回到反应器内，进行再循环操作。

2、常用的方法、常用的方法

（1）过滤法-分批过滤、连续真空过滤、错流流动过滤。

错流流动过滤法-使液体平等于过滤膜的表面进行流动，这样能够不断地移去在滤膜表面积累的细胞物质，从而获得近似于恒定的过滤速率。

（2）离心分离法-垂直式离心、水平式离心。

（3）沉降法-与一般的自由沉降不同，工业生产过程的沉降都属于干扰式沉降。

3、常用的设备、常用的设备

（1）过滤设备-板框过滤机、回转真空过滤机

（2）离心设备-转篮式离心过滤机（三足式离心过滤机）、刮刀卸料式离心过滤机、沉降式离心过滤机、喷雾离心过滤机、间断排料式离心过滤机、倾析式离心过滤机。

（3）沉降设备-管式离心沉降机。

4、固体物质的前期预处理技术、固体物质的前期预处理技术由于生物反应液的粘度很大，直接分离往往比较困难，因此，常常对其进行预先的前期处理，来提高分离效果。

常见的预处理技术有：

（1）使细胞老化凝聚成团，

（2）加热，（3）改变PH值，（4）添加化学物质促进凝聚，如加入高分子电解质、氯化钙、胶态粘士。

（二）初步分离

（二）初步分离进一步把已经分离的溶液浓缩，提高目的产物浓度的方法，称为初步分离。

初步分离的具体方法可以分为：

1、蒸发、蒸发2、萃取、萃取3、沉淀、沉淀4、膜分离、膜分离1、蒸发、蒸发蒸发是通过加热，使溶液中的水经过汽化除去要提高溶质浓度、为溶质的析出创造条件的一种操作方法。

各种代谢物，如氨基酸、抗生素、酶都可以进行蒸发操作。

由于生物产品大多数是热敏性物质，所以物料在蒸发器内的停留时间必须尽可能短，同时，还应该昼避免局部液体过热。

LG系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图系列离心式刮板薄膜蒸发器示意图蒸发设备

（1）连续流动膜式蒸发器，

（2）长管膜式蒸发器，（3）强制膜式蒸发器，（4）离心膜蒸发器。

2、萃取、萃取萃取是通过物质在2种溶液之间不同的溶解度，来实现分离的操作方法。

萃取的分类

（1）有机溶剂萃取）有机溶剂萃取

（2）双水相萃取）双水相萃取

（1）有机溶剂萃取）有机溶剂萃取许多抗生素都能够溶解在有机溶剂之中，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、因此，通过萃取，可使得抗生素从水相进入有机相之中，从而实现分离。

由于抗生素在有机溶剂之中极不稳定，因此，在保证萃取效率的前提条件下，必须尽量缩短操作时间。

有机溶剂萃取设备可使用Podbielniak离心萃取机。

SFT-150超临界萃取反应仪超临界萃取反应仪利用萃取法来提取抗生素，具有质量好、收率高、速度快的优点。

双水相萃取法，目前用于进行酶、和蛋白质的提取工艺。

（2）双水相萃取）双水相萃取使用2种互不相溶的高聚物，如聚乙二醇（PEG）、葡聚糖，分别将它们溶于水中形成双水相，利用目的产物在双水相中不同的分配系数而实现分离的方法，称为双水相萃取。

萃取之后的目的产物可以通过超滤法进行提纯。

双水相萃取材料-

（1）PEG-葡聚糖萃取系统，

（2）PEG磷酸钾萃取系统。

3、沉淀、沉淀蛋白质在溶液中具有“等电点”的特性，而且其等电点与溶液PH值有关，PH值大，蛋白质呈负电，PH值小，蛋白质呈正电，当PH=pI（等电点）时，蛋白质不带电荷。

蛋白质在PI时的溶解度最小。

这是因为蛋白质在水中有均匀分布是由于同性电荷相斥的缘故，当PH=pI时，由于蛋白质分子不带电荷，于是开始相互凝聚、产生沉淀。

NSG-630浓缩分离机浓缩分离机ZHN系列真空浓缩罐系列真空浓缩罐沉淀和盐折的结合沉淀和盐折的结合由于沉淀常常导致蛋白质变性而失效。

而利用盐溶液就能避免蛋白质的变性，这种方法就称为-盐析法。

在不同的盐溶液之中，蛋白质有盐析效应有所不同。

按下列顺序递减：

（1）阴离子-柠檬酸盐-3、酒石酸盐-2、SO4-2、F-、IO3-、H2PO4-、醋酸盐-、B2O3-、Cl-、ClO3-、Br-、NO3-、ClO4-、CNS-。

（2）阳离子-Th+4、Al+3、H+、Ba+2、Sr+2、Ca+2、Mg+2、Rb+、NH4+、K+、Na+、Li+。

从离子物性来看，硫酸铵并不是盐析效应最强的盐类，但是由于它在水中的溶解度极大，对盐析十分有利，因此硫酸铵是目前最常用的盐析剂。

4、膜分离、膜分离膜分离技术是基于一种半透性薄膜，它能够使得溶液中的某些组分通过，而阻止和截留其它组分的分离方法。

膜分离的优点

（1）由于膜分离是纯粹物质粒度大小这一几何特性来进行分离，它不必象萃取、沉淀法那样需加入其它化学物质、也不必象蒸发那样进行加热。

因此，产物的生物学特性能够得到完好的保存，

（2）产物的损失量很少，有利于提高得率。

膜