免疫学检验总结表格_精品文档.doc
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第一部分:
基本理论
抗原抗体反应
抗原
抗原的两种特性:
免疫原性、免疫反应性
共同抗原、交叉反应、异嗜性抗原、超抗原等
抗原的分类依据性能:
完全抗原、不完全抗原
依据抗体产生是否要Tcell刺激:
胸腺依赖性抗原(TD-Ag)、胸腺非依赖性抗原(TI-Ag)
丝裂原
刀豆蛋白A(ConA)
T细胞有丝分裂原
植物凝集素
T细胞有丝分裂原
美洲商陆丝裂原
T细胞和B细胞有丝分裂原
脂多糖(LPS)
B细胞有丝分裂原
葡萄球菌A蛋白(SPA)
B细胞有丝分裂原
抗体
结构与功能:
略
IgG
单体分子、血清和细胞外液中含量最高
IgM
五聚体、分子量最大、不能透过胎盘、宫内感染指标
IgA
有两种类型(血清型和分泌型)、对新生儿早期抗感染十分重要
IgD
单体分子、膜结合型IgD是Bcell分化成熟的标志
IgE
单体分子、含量最少、特异性过敏和寄生虫感染中有意义
抗原抗体反应原理
结合力、亲和力与亲合力
抗原抗体反应特点
①特异性;②比例问题:
等价带、前带、后带;③可逆性
影响因素
反应物
抗原
理化性质、抗原表位等
抗体
来源:
R型血清和H型血清
特异性与亲和力
反应条件
电解质、酸碱度、温度、比例
抗原抗体的制备
免疫原的制备
颗粒性免疫原的制备
较简单、分离或纯培养
可溶性抗原的制备
粗抗原制备:
捣碎组织、破碎细胞、粗提取
分离与纯化、浓缩与保存
人工免疫原的制备
将半抗原与载体结合,常用蛋白质作为载体
合成肽抗原的制备
合成肽属于半抗原的一种,所以·····
基因工程抗原的制备
获得目的抗原的基因编码,然后扩增纯化
抗体的制备
多克隆抗体制备
使用免疫原免疫动物获得抗体、又叫抗血清;
弗氏完全佐剂(CFA,石蜡油+羊毛脂+卡介苗)和弗氏不完全佐剂(IFA,石蜡油+羊毛脂)
大致过程:
获取、鉴定、纯化、保存
单克隆抗体(McAb)制备
原理:
杂交瘤技术等
亲本细胞的选择与融合:
无菌取脾
HAT培养基的选择作用
阳性克隆选择与克隆化
制备单克隆抗体:
在小鼠腹腔诱生出肿瘤并产生含McAb的腹水
鉴定、保存、应用
基因工程抗体的制备
抗原抗体的纯化
离心分离
差速离心
粗分离;会有共沉;分离分子量相差大的物质;动力学方法
密度梯度离心
用于分离密度相近大小不同;常用介质为蔗糖、甘油;离心分离的物质密度一定要大于密度梯度介质的最大密度;有共沉
等密度梯度
分离大小相同密度不同的物质;介质常用铯盐;铯盐对铝有腐蚀,防止溅出;不会有共沉
沉淀分离
盐析法
原理:
盐的存在减弱了蛋白分子周围的水化膜,导致蛋白发生聚集而沉降
有机溶剂沉淀
优:
分辨率高、溶剂易除;缺:
有毒、可能会是蛋白失活
非离子聚合物沉淀
常用聚乙二醇
离子交换层析
凝胶层析
常用凝胶:
葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、Superdex
亲和层析
利用欲分离物质和它们的特异性配体间具有特异性亲和力
电泳
有支持体
纸电泳
醋酸纤维薄膜
薄层电泳(薄膜或薄板)
非凝胶性支持体区带电泳(淀粉、纤维素粉、硅胶等)
凝胶支持体区带电泳(淀粉液、聚丙烯酰胺凝胶)
无支持体
Tiselius移界电泳
显微电泳
等点聚焦电泳
等速电泳
密度梯度电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳与SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳区别
第二部分:
免疫检验技术
1.沉淀反应
①可溶性抗原;②多克隆抗体更适合;③R型血清首选
液相沉淀试验
环状沉淀试验:
定性
絮状沉淀试验
抗体稀释法、棋盘格法(找出Ag、Ab最佳比例)
凝胶沉淀试验
单向扩散试验
定量试验;两个曲线
双向免疫扩散试验(定性)
沉淀线数目:
抗原或抗体不纯;沉淀线弯向分子量大的;沉淀线靠近浓度低的;可以测定效价(半定量)
免疫电泳
对流免疫CIEP
双扩+电泳;Ag向正极泳动、Ab向负极泳动
火箭电泳
单扩+电泳;定量
免疫电泳
先蛋白区带电泳、再双扩
免疫浊度测定(定量)
透射浊度测定、散射浊度测定
免疫速率抑制浊度测定
用一定量的已知半抗原-载体与限量特异性抗体反应,测定生成的半抗原-载体-抗体所造成的散色速率
2.凝集反应
①颗粒性抗原或带有可溶性抗原的载体
②定性试验
直接凝集试验
玻片凝集
定性;多用于红细胞ABO血型
试管凝集
半定量、多用于Ab;外斐试验、肥达试验
间接凝集试验
①将抗原与某一载体结合;②常用载体:
人O型RBC、SRBC、SPA等
间接凝集试验
正向间接凝集试验
用抗原致敏颗粒检测抗体
反向间接凝集试验
用已知抗体检测抗原
间接凝集抑制试验
用已知抗原致敏颗粒和相应抗体,检测样本中是否有与致敏颗粒相同的抗原,有正向和反向
间接血凝试验
载体颗粒为红细胞
其它凝集试验
抗球蛋白试验(Coombs试验)
是抗球蛋白参与的间接血凝试验
直接Coombs
检测已粘附在RBC的不完全抗体;新生儿溶血、自身免疫溶血性贫血
间接Coombs
血清中游离抗体;多用于检测母体Rh(D)
协同凝集试验
载体颗粒为SPA的间接凝集试验
冷凝集试验
检测冷凝集素的方法,0~4℃最明显
自身红细胞凝集试验
主要试剂为抗人O型红细胞MCAb,可以与各型RBC结合却不引起凝集;样本为全血
特点是排除由于红细胞凝集可能引起的假阳性
3.补体试验
系统:
①缓冲液PBS②补体③SRBC④溶血素
补体测定试验
血清总补体活性(CH50)测定
活化经典途径;为么要50%溶血作为终点测定;意义
旁路活化途径(AP-H50)测定
EGTA螯合Ca2+,封闭Cl,阻断经典途径
补体结合试验
分为直接(不溶血为阳性)和间接(溶血为阳性)两类
实验结果要对照众多对照实验观察
4.酶免疫技术(E)
定量或定性
固相载体
最常用聚苯乙烯
酶和底物
最常用辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP);还有β-半乳糖胺酶
分类
双抗体(原)夹心
检测抗原最常用;只适用于二价或二价以上大分子抗原
双位点一步法
双抗夹心时,待测样品和酶标物一起加入
间接法
检测抗体最常用
竞争法
既可测抗原,又可测抗体;参考管和待测管对照观察
5.荧光免疫技术(F)
*阳性细胞数量和荧光强度可以作为定量或半定量指标
常用荧光物质
异硫氰酸荧光素(FITC)
最常用、最广泛;黄色或橙黄色粉末;激发后发出黄绿色
四乙基罗丹明(RB200)
橘红色粉末;激发后为橘红色荧光
四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)
紫红色粉末,激发后有橙红色荧光;猝灭速度慢
藻蛋白类
藻红蛋白PE(此类最常用)、藻青蛋白PC、别藻青蛋白APC;多呈现橙色或红色物质
荧光显微技术
光源
短波光;波长连续或不连续;
滤板
隔热滤板、激发滤板、吸收滤板;
光路
透射光或落射光
分类
直接染色法
荧光标记抗原(抗体)直接检测抗体(抗原)
间接染色法
酶联免疫+荧光标记
补体结合免疫荧光
Ag,Ab结合激活补体;荧光素标记抗补体的抗体;
双标记染色
标记不同抗体检测同一样品
流式荧光免疫技术
定量分析或纯化;流式细胞仪与荧光免疫结合
6.放射免疫技术(R)
*精确测定各种微量物质
放射免疫分析(RIA)
原理:
标记抗原(可以为半抗原)Ab*和非标记抗原Ab对特异性抗体Ag(一定量)的竞争结合反应
计数仪
γ射(131I,125I)线用晶体闪烁计数仪
β射线(57Cr,60Co)用液体闪烁计数仪
免疫放射分析(IMRA)
原理
以过量标记的抗体与待测抗原进行非竞争性免疫结合反应,时间段,灵敏度较RIA高,操作较简单
分类
单位点IRMA
直接用放射标记物质检测另一个
双位点IRMA
同时与待测抗原的两个抗原位点结合;灵敏度高
间接IRMA
双抗夹心结合间接法再结合IRMA
RIA与IRMA的比较P169
7.金免疫技术
快速诊断
胶体金特性
胶体特性
电解质可以使之水化膜破坏而聚集沉淀
呈色性和光吸收
颗粒直径5~20nm:
葡萄酒红色;颗粒直径20~40nm:
深红色;颗粒直径60nm:
蓝紫色等
分类
斑点金免疫渗滤试验(DIGFA)(可以定性)
将特异性抗原或抗体固定在硝酸纤维素膜上,其下面有吸水材料,形成渗滤装置;阳性有红色出现
有间接法和双抗夹心法
斑点金免疫层析试验
双抗夹心法
较大分子抗原;质控线红色且T区显红为阳性
竞争法
小分子抗原或半抗原;质控线红色且T区显红为阴性
8.化学发光免疫分析技术
高灵敏高特异性
发光原理
分子或原子中的电子吸收能量跃迁后回到基态会发出光子,从而发光
化学发光
常温下,伴随化学反应过程所产生的光的发射现象
发光标记物
直接参与发光反应的标记物
标记物本身就是化学发光中的能量转移载体,发光底物;如鲁米诺类、吖啶酯类、苯酚类
以催化反应或能量传递参与发光的酶标记物
即作催化剂,又参与化学发光反应
HRP对鲁米诺和H2O2起催化作用
ALP
以能量传递参与氧化反应的非酶标记物
不直接参与化学发光反应;三联吡啶钌
具体技术
化学发光免疫分析(CLIA)
以化学发光物质(如吖啶酯)直接标记Ag或Ab,发生免疫反应后,直接引发化学发光进行检测
化学发光酶免疫技术(CLEIA)
采用催化某一发光反应的酶标记Ag或Ab,形成酶标记抗原-抗体化合物;加入了催化发光的酶,使发光速度加快
生物发光免疫分析(BLIA)
利用生物发光物质标记Ag或Ab
微粒子化学发光免疫分析
顺磁性微粒子为载体、用ALP标记;以AMPPD作为发光剂
电化学发光免疫分析
三联吡啶钌是电化学发光免疫分析用的发光剂;检测广泛;持续时间长;信号强;灵敏度高等
第三部分:
具体物质的检测
免疫细胞的检测
细胞分离法
外周血WBC的分离
自然沉降法和高分子聚合物沉降法
外周血单个核细胞分离
密度梯度离心法;
淋巴细胞分离
玻璃器皿吸附;媳妇过滤;磁铁吸引
淋巴细胞亚群的分离纯化
E玫瑰花结分离:
T细胞能结合SRBC结合
尼龙分离:
T细胞表面绒毛短少,B则多长、易吸附在在尼龙毛上
亲和板结合法:
单抗与不同亚群的淋巴细胞结合在板上不易被洗掉
流式细胞仪分选法
磁性激活细胞分离器分离法:
用于T细胞亚群分离
T细胞检测
表面标志检测
用间接免疫荧光、酶免疫技术等检测T细胞表面的表面标志,如CD分子和MHC等
T细胞受体检测
E受体检测
人T细胞有SRBC抗体,可形成玫瑰花环
IL-2受体检测
双抗体夹心、ELISA等
T细胞功能检测
T细胞增殖试验
3H-TdR掺入法
MTT比色法
T细胞介导的细胞毒性试验
形态学检查
51Cr释放法
CTL介导的细胞凋亡检测法
抑制性T细胞功能检测
利用ConA诱导Ts细胞,比较诱导与未经诱导的T对B抗体产生的抑制,评价T市功能
B细胞检测
表面抗原检测
检测CD19、CD20、CD22等
B细胞受体检测
SmIg标志的检测
花环形成试验
检测B细胞表面的Fc受体
B细胞功能检测
体内检测
免疫球蛋白测定
血清中血型抗体的测定
体外检测
反向溶血空斑形成实验等
自然杀伤细胞的检测、吞噬细胞检测
细胞因子及其受体的检测(具体细胞因子检测见课本)
生物学测定法
细胞因子调节的细胞增殖和增殖抑制试验
3H-TdR掺入法
MTT法
染料染色法
直接计数法:
直接计数活细胞
集落形成实验
细胞因子介导的细胞毒性试验
4小时51Cr释放法
乳酸脱氢酶释放法
3H-TdR释放法
细胞因子抗病毒活性的检测方法
趋化活性得到测定
免疫学测定