抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选.docx

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抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选

抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备及筛选

【摘要】　目的获得稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

方法以CAPHSBSA免疫BALB/c小鼠，用细胞融合技术筛选抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞，体内诱生腹水法大量制备单抗。

捕获ELISA法测定小鼠免疫球蛋白亚型，间接ELISA法测定腹水效价；用两步硫酸铵法和G蛋白亲和层析法来纯化腹水。

结果成功建立了一株分泌抗CAP单克隆抗体（McAb）的杂交瘤细胞4D10。

经检测,其分泌的抗体亚类为IgG1,杂交瘤染色体数目90～110条,间接ELISA检测诱生小鼠腹水的抗体效价达1∶×105，纯度达95%，该细胞连续培养生物学性状稳定。

结论成功制备的抗氯霉素单克隆抗体4D10效价高、纯度高，为利用该单抗研制检测氯霉素残留试剂盒提供原材料。

【关键词】　氯霉素；细胞融合；单克隆抗体；间接ELISA

　　Abstract:

ObjectiveToacquirestableandsecretorymonoclonalantibodiesagainstchloramphenicolhybridomacelllines.MethodsBALB/cmicewereimmunizedwithCAPHSBSAandhybridomalinessecretingmonoclonalantibodyagainstchloramphenicol（CAPMcAb）werescreenedbycellfusion,andtheimmunologicaltitersofCAPMcAbweredetermined.CaptureELISAmethodwasusedtodetermineisotypesofthemousemonoclonalantibodyandtheindirectELISAmethodwasperformedtodeterminethetitersofMcAbs.TwostepammoniumsulfateprecipitationandprotnGaffinitychromatographyprotnpurificationmethodswereusedtopurifyascites.ResultsOnehybridomacelllinesecretingCAPMcAb4D10wasestablished.ThetiterofpurifiedMcAb4D10was1∶×105,andthepuritywas95%.ConclusionTheantichloramphenicolMcAb4D10preparedhadhightiterandhighpurity,anditcouldbeusedtodevelopCAPimmunoassaykitfordetectionofCAPresidues.

　　Keywords:

chloramphenicol；cellfusion；monoclonalantibody；indirectELISA

　　氯霉素﹙chloramphenicol，CAP﹚一种人工合成的广谱抗生素，因其效价高，价格低廉而广泛用于畜牧业，成为畜禽疾病防治的重要药物。

但氯霉素在肉、蛋、奶中即使是微量的残留也会对人类的健康造成直接或潜在的威胁，如能抑制人体骨髓造血功能、引起人再生障碍性贫血、粒状白细胞缺乏症、新生儿和早产儿灰色综合征等疾病［1］。

因此氯霉素残留问题已经引起国际和世界上许多国家和地区的高度重视。

美国最早规定不允许在家禽饲养中使用CAP,出售的家禽必须做CAP残留检测。

在我国，2002年部第235号公告《动物源性食品中兽药最高残留限量》中明确规定氯霉素禁止使用，在动物性食品中不得检出。

所以，建立检测动物源性食品中氯霉素残留的分析方法具有重要意义［2］。

　　到目前为止，国内外用于氯霉素残留检测的方法已近十几种，其中主要有微生物法、仪器分析法和免疫分析法［3］。

免疫分析是以抗原与抗体的特异性、可逆性结合反应为基础的分析技术。

免疫反应具有很高的选择性和灵敏性，因此，免疫分析技术无论作为兽药残留分析的检测手段还是样本净化方法都能使分析过程特别是前处理步骤大大简化。

目前使用最普遍的酶联免疫法（ELISA），具有操作简便、灵敏度高、样品容量大、仪器化程度和分析成本低的优点，是目前最理想的残留筛选性分析方法之一［1］。

本实验拟采用杂交瘤技术制备并筛选出能稳定、高效分泌抗氯霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，为开发氯霉素ELISA试剂盒提供特异性材料。

　　1材料与方法

　　材料

BALB/c小鼠购自广东省实验动物中心，动物合格证号：

SCXK20030002；昆明小鼠购自广州市白云区穗北实验动物养殖厂；免疫抗原CAPHSBSA，检测抗原CAPHSOVA由本实验室合成［4］。

小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒为Sigma公司产品；Sp2/0骨髓瘤细胞株购自中山大学实验动物中心细胞库。

CAP、弗氏佐剂CFA、IFA、细胞培养基RPMI1640、HAT、HT为Gibco公司产品；酶标二抗羊抗鼠IgG为Santa进口分装产品。

其他试剂均为国产、AR级试剂。

　　方法

　　动物免疫

　　取8～10周龄雄性BALB/c小鼠，将CAPHSBSA与等体积的弗氏完全佐剂乳化，皮下注射，剂量为100μg/只，以后每隔2周加强免疫1次，改用弗氏不完全佐剂，腹腔注射。

融合前3天强化免疫1次，不用佐剂，但剂量加倍。

　　细胞融合

　　按常规方法操作，操作流程参考　文献［5］。

　　杂交瘤细胞筛选及克隆化培养

　　当融合后的细胞生长到培养孔面积的1/4时，取细胞培养上清用间接ELISA法进行阳性杂交瘤细胞筛选，选择阳性强、细胞生长旺盛孔的细胞，用有限稀释法进行克隆，而后扩大培养、冻存并进行鉴定。

　　杂交瘤细胞染色体的计数

　　方法参照文献［5］。

　　CAPMcAb的制备及效价测定

　　采用体内诱生腹水法进行。

取8～10周龄雄性BALB/c小鼠，腹腔注射液体石蜡,0.5mL/只,1个星期后腹腔注射杂交瘤细胞1～2×106个/只,10d后视小鼠腹水生长情况，抽取腹水,离心取上清,间接ELISA法测定效价,以A值大于阴性的倍的稀释比例的倒数即为该抗体效价，-20℃冻存腹水。

　　McAb的纯化及亚类鉴定

　　将收集的小鼠腹水用硫酸铵盐析法和G蛋白层析法进行纯化。

按小鼠单克隆抗体亚型鉴定试剂盒说明书操作进行单抗亚类鉴定。

　　　2结果

　　杂交瘤细胞的筛选

细胞融合后5～6d，可见有单克隆细胞集落，用间接ELISA方法测定培养上清的效价，选取一株效价高又能被CAP强抑制的杂交瘤细胞，经4次克隆后，克隆阳性率达100%。

扩大培养，经冻存、复苏后仍能稳定分泌抗体。

将该细胞株命名为4D10。

　　杂交瘤细胞稳定性测定

将冻存的4D10细胞株复苏后，测定其培养上清的效价。

结果显示，经冻存、复苏后该杂交瘤细胞仍能稳定分泌抗体，结果见表1。

表1杂交瘤细胞稳定性测定

　　杂交瘤细胞染色体分析

正常小鼠脾细胞的染色体数目为40条，小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0为62～68条，4D10细胞株染色体条数为90～110，说明4D10为杂交瘤细胞（见1）。

　　单克隆抗体小鼠抗体亚类鉴定

以捕获ELISA法测定杂交瘤细胞的培养上清，结果显示4D10为IgG1亚型

　　。

表2单克隆抗体亚类鉴定

　　单克隆抗体分子量测定

电泳结果如图2所示。

以标准蛋白Maker各条带为标准，利用凝胶成像分析系统对抗体重链与轻链进行了相关分析。

从泳道可看出，单抗的重链位于kD与kD之间，轻链位于kD与kD之间，根据分子量与迁移率的线性关系，求出4D10重链分子量为54kD，轻链分子量为23kD，故单抗4D10的分子量约为154kD。

　　单克隆抗体纯度测定

从图3可看出4D10的纯化效果。

硫酸铵盐析法之后仍残留较多的杂蛋白，经过亲和层析后的4D10基本已无杂蛋白，经过凝胶成像系统扫描分析，4D10纯度可达95%，腹水纯化后蛋白浓度为mg/mL，可用于研制检测氯霉素残留试剂盒。

　　单克隆抗体效价测定　

纯化后抗体效价结果如表3所示。

4D10原腹水效价为1∶×106，经过硫酸铵沉淀以后效价下降了一个滴度为1∶×105，G蛋白亲和层析以后再下降了一个滴度为1∶×105，总体来说抗体的活性还是保持良好的。

表3单克隆抗体效价测定（略）

　　3讨　论

　　免疫分析方法作为一种特殊的分析技术,近几年来在兽药、农药等小分子化合物的残留分析中的越来越广泛。

而抗体是免疫分析技术中的试剂,其质量好坏是影响检测方法标准化的一个重要因素。

McAb由于本身所具备的优势，如特异强、质量易于控制、易于标准化等，所以与普通抗血清相比，在药物残留的免疫分析中有着更广阔的应用前景［6］。

　　在CAP单抗制备过程中，因为CAP是一种半抗原，本身不具备免疫原性，所以需要将其与大分子载体物质相偶联成完全抗原，免疫动物时才能刺激机体产生免疫应答。

本实验用CAPHSBSA免疫小鼠，以刺激机体产生较强的免疫应答。

筛选杂交瘤细胞时，用CAPHSOVA包被酶标板，这样可以在第一步就能排除大量的针对CAPHSBSA中的载体分子BSA抗体的杂交瘤。

　　克隆化的杂交瘤细胞经过冻存后，有可能会出现分泌抗体能力下降甚至丧失的情况出现，因此克隆出来的细胞必须经过连续培养并经多次冻存、复苏后仍能稳定分泌抗体的才能确定为建株成功。

本实验制备的4D10细胞经多次冻存、复苏后，仍保持稳定分泌抗体的能力，说明该株细胞在冻存复苏过程中并没有丢失其分泌抗体的能力，复苏后仍能分泌高效价抗体。

　　本实验使用捕获ELISA法进行4D10抗体亚类的测定，结果示4D10抗体亚类为IgG1。

经采用两步硫酸铵法粗纯及G蛋白亲和层析纯化后，得到纯度高达95%的抗体，比王颖等制备的抗氯霉素单克隆抗体的纯度高［7］。

纯化后效价为1∶×105比原腹水效价降低了2个滴度，但仍保持较高的效价。

本实验成功制备出一株抗氯霉素单克隆抗体杂交瘤细胞株4D10，该细胞株能高效、稳定分泌抗体，下一步将对该抗体的特异性、亲和力等相关性质做进一步研究，为利用该抗体制备氯霉素检测试剂盒做准备。

【参考　文献】

　　［1］张宇.氯霉素在动物体内的残留与检测［J］.　论坛，2007，1：

68．

　　［2］何佳琪，段振娟，张燕，等.氯霉素残留ELISA检测方法［J］.　中国兽医杂志，2008，44

（2）：

88-89．

　　［3］宋巍巍，柴春彦，刘国艳，等．动物性食品中残留氯霉素检测方法的研究进展［J］.畜牧与兽医，2007，39：

54-56．

　　［4］董斌，袁茵，段涛，等.氯霉素全抗原的合成与鉴定［J］.食品科学,2009,30（11）:

163-165.

　　［5］金伯泉，朱勇．细胞和分子免疫学实验技术［M］.西安:

第四军医大学出版社，2002：

13-28.

　　［6］覃雅丽，石德时，王桂枝，等．抗氯霉素单克隆抗体的制备及鉴定［J］.中国兽报，2001，21（6）：

556-558．

　　［7］王颖，任立松，李研东，等．抗氯霉素单克隆抗体的制备纯化及其特异性鉴定［J］.吉林大学学报：

医学版，2008，34：

336-339.