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青蒿素的研究进展

青蒿素的研究现状

1前言

青蒿素是一种倍半萜内脂类化合物［1］，分子式为C15H22O5，有抗疟、抗孕、抗纤维化、抗血吸虫、抗弓形虫、抗心律失常和抑制肿瘤细胞毒性等作用［2］。

目前，青蒿素用于疟疾防治的价值已被人类认识和接受，世界卫生组织已把青蒿素的复方制剂列为国际上防治疟疾的首选药物。

青蒿素因其在丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯及冰醋酸中易溶，在乙醇和甲醇、乙醚及石油醚中可溶解，传统提取方法一般采用有机溶剂法，后来又出现了超临界CO2萃取技术、超声提取技术、大孔吸附树脂提取技术、微波辅助萃取技术、快速溶剂萃取技术以及联用技术。

青蒿分布地域狭窄,青蒿素含量低（0.01%~0.5%）.化学合成青蒿素产率不理想,成本高.随着全球疟疾发病率（3.8亿人/年）和死亡率（4600万人/年）逐年升高[3],青蒿素类抗疟药需求量迅猛增长,导致青蒿素原料药供不应求,市场价格飙升[4]。

近10年来,为了从根本上解决青蒿素的供需矛盾,国内外争相开展了青蒿素合成生物学及代谢工程研究,一方面尝试在微生物体内重建青蒿素生物合成途径[5],另一方面对青蒿中原有的青蒿素生物合成途径进行遗传改良[6]。

我国在“九五”期间开展青蒿素的开发研究将具有可观的经济效益和社会效益。

本文将对目前国际上青蒿素研究的现状从以下几个方面进行论述。

2青蒿素的发现及历史

青蒿入药,最早见之于马王堆三号汉墓出土（公元前168年左右）的帛书《五十二病方》,其后在《神农本草经》,《大观本草》及《本草纲目》等均有收录。

从历代本草及方书医籍的记载,青蒿入药治疗疟疾是经过长期的临床实践经验所肯定的。

在现代临床上用于对恶性疟疾、发热、血吸虫病、腔黏膜扁平苔藓、红斑狼疮、心律失常的治疗［7］，并且对类风湿性关节炎的免疫有显著疗效［8］。

1971年以来,中医研究院青蒿素研究小组通过整理有关防治疾病的古代文献和民间单验方,结合实践经验,发现中药青蒿乙醚提取的中性部分具有显著的抗疟作用。

在此基础上,于1972年从青蒿中分离出活性物质——青蒿素,在青蒿素药理实验的基础上,人们又进行了大量的药理和临床疗效研究。

1973年9月,青蒿素首次用于临床,到目前为止,已有十几种衍生物的抗疟效果比青蒿素活性高出多倍。

自我国开展有关青蒿素的研究后,世界各国相继开展此方面的重复性研究,获得的结果显示了抗疟的特效性。

3青蒿素的来源

青蒿素来源主要是从青蒿中直接提取得到；或提取青蒿中含量较高的青蒿酸，然后半合成得到。

目前除青蒿外，尚未发现含有青蒿素的其它天然植物资源。

青蒿虽然系世界广布品种，但青蒿素含量随产地不同差异极大。

据迄今的研究结果，除中国重庆东部、福建、广西、海南部分地区外，世界绝大多数地区生产的青蒿中的青蒿素含量都很低，无利用价值。

青蒿广泛分布在中国的各省市,不同产地青蒿素含量差异显著,最高可达干重的1%—2%。

为获得最大的青蒿素产量,对不同生长期的青蒿素含量变化进行考察,认为青蒿的采集期在生长盛期至花蕾期之前,此时的青蒿素含量最高,营养体重量大,在青蒿植株和枝条上的叶片中,青蒿素含量均呈下部、中部、上部依次递增的规律。

因此,青蒿植物的上部和枝条上部的叶片应首选入药,其次为中部,最后才是下部。

不同的干燥方法对青蒿素的产量也有一定的影响,比较晒干、阴干和60℃烘干三种方法,以自然晒干的效果最好,比阴干的样品含量高23.76%。

在人工栽培中稍加肥料,青蒿植株高大,青蒿素的含量较野生的略高,且嫩叶比老叶的含量高。

陈福泰[9]在人工控制的环境中栽培青蒿,在青蒿生长的基本条件得到满足的情况下,生长环境中的营养物质的含量与生长基质对青蒿素含量没有影响,而高温和短距离光照可促使青蒿素含量成倍增加。

Elhag等[10]筛选高产的青蒿植株时,发现青蒿的含量高的植株具有长的节间,茁壮的茎杆,伸展开的枝条和茂密的叶。

Liersch等[11]对筛选的青蒿品种811喷洒植物激素chlormequat,结果植株的青蒿素含量比对照高30%。

4青蒿素的提取工艺

4.1传统溶剂提取法

溶剂提取法是植物天然化学成分提取中采用的最普遍的方法。

青蒿素是从黄花蒿中提取到的一种无色针状结晶，易溶于丙酮、醋酸乙酯、氯仿、苯及冰醋酸，可溶于甲醇、乙醇、乙醚、石油醚，在水中几乎不溶，因此传统提取青蒿素的方法一般采用有机溶剂法，并采用重结晶和柱层析进行分离，其基本工艺为:

干燥—破碎—浸泡、萃取（反复

进行）—浓缩提取液—粗品—精制。

提取方法主要有室温提取、冷浸提取、回流提取、索氏提取等。

4.1.1温室提取

王轶［12］以青蒿叶干粉为原料，在搅拌速度、溶剂量、温度、时间4个水平进行正交实验，得出青蒿素最佳提取条件为:

搅拌速度800r/min，溶剂量60mL（1g原料），提取温度50℃，提取时间120min，原料粒度0.25mm。

青蒿素提取率最高可达78.19%。

谢莹等［13］称取50g干燥青蒿捣碎，依次次用200、150、100mL石油醚浸泡24h，抽滤并合并滤液，在35～40℃减压浓缩，得到的粗品在上硅胶柱纯化，其纯品收率为0.13%，由此合成蒿甲醚的收率为75.8%。

4.1.2冷浸提取

李自勇等［14］采用工业酒精冷浸法提取青蒿中的青蒿素，以浸渍时固液比、萃取时母液与萃取剂（30～60℃）为最佳溶媒介质，1%活性炭脱色的效果最佳，80%甲醇洗提取液的浓缩浸膏得到进一步分离纯化。

此工艺提取分离所得的青蒿素的结晶经HPLC法测定其含量最高为70.761%。

4.2新型提取工艺

4.2.1超临界CO2萃取技术

超临界CO2萃取（SFE）技术是利用温度和压力均高于临界点的流体进行物质分离的一种方法。

在超临界状态下,将超临界CO2与待分离的物质接触,使其依次选择性地把极性大小、分子量大小、沸点高低不同的成分萃取出来。

超临界CO2的介电常数和密度随密闭体系的压力的增加而增加,升高程序的压力可以将不同极性的成分分离提取出来，当然,在各对应压力范围内所得到的萃取物不可能是单一的,这就需要通过控制条件得到最佳的混合比例,然后借助升温、减压的方法使CO2气体从超临界状态变为普状态。

超临界CO2萃取工艺优点众多［15］，其选择性高、特别适合热敏性物质的萃取，分离工艺简单，可节约能源，所用的溶剂CO2无毒、无味、无污染、无残留，非常安全，但因为对设备压力要求高，CO2极性较小，因此其对大分子物质提取率较低，从而导致在工业上的广泛应用受到限制。

4.2.2超声提取技术

近些年，超声波在植物有效成分提取及中药化学成分提取中应用广泛［16］，已经成为实验室提取青蒿素的常用技术手段。

早在2000年，赵兵等［17］就开展了将超声波用于强化石油醚提取青蒿素的研究。

结果表明:

超声波用于强化石油醚提取青蒿素时采用20kHz、90W超声波，在50℃下，单次作用20r/min后继续搅拌至30r/min时提取率可达83%;而用超声波处理6次，每次处理2min，共计12min，提取相同时间，提取率可达81%，改进了原有青蒿素提取工艺，提高了回收率。

邓启华等［18］采用自制QHSTQ－A1型智能连续逆流提取设备，青蒿干料投料速率为0．5kg/10rnin。

以6号溶剂油为溶剂，料液比为1∶4．5，物料停留时间9h，浸取液用复合溶剂ZY－1和复合沉淀剂ZY－2处理，青蒿素提取率达89%，含量为99．2%以上。

魏增云等［19］以干叶为原料，考察石油醚萃取青蒿素的工艺条件。

如温度、时间、溶剂量及超声功率等因素。

正交法确定了最佳萃取工艺条件为:

温度40℃，超声功率90W，时间20min（2次），液固比120∶1（mL·g）。

用紫外分光光度法直接测定不同产地青蒿中青蒿素的含量。

结果表明:

用超声波强化石油醚萃取青蒿素与常规浸泡法石油醚萃取比较可以大大缩短萃取时间，提高了萃取率。

杨家庆等［20］使用超声提取法，采用正交设计法优化提取工艺，得出当超声数为1次，溶剂量为样品量的60倍，超声时间为70min时提取效果最佳。

超声提取在青蒿素的提取过程中应用广泛，但是也存在一些缺点，比如会造成严重的噪声污染，且对设备的要求高，因此还需要不断改善。

4.3大孔吸附树脂提取技术

韦国峰等［21］探讨大孔吸附树脂提取青蒿素的方法，以青蒿素的吸附量、青蒿素含量、青蒿素收率和提取率为考察指标，确定了大孔吸附树脂提取青蒿素的工艺条件。

ADS－17树脂对青蒿素的吸附量大，解吸容易，可用于提取黄花蒿中青蒿素的工业化生产，其工艺条件为:

青蒿素最大吸附量112.30mg/g，吸附流速为2BV/h，洗脱剂为90%乙醇，解吸流速为2BV/h，青蒿素含量大于99%，收率高达0.3%，提取率高达75%以上。

研究表明:

溶液的pH值、温度等因素在ADS－17大孔树脂对青蒿吸附性方面均有影响［22］，降低温度有利于吸附;pH值在6.2～6.5范围内，树脂对青蒿素具有良好的吸附性能，因此大孔树脂可用于吸附青蒿素。

潘凤等［23］通过比较青蒿水煎液经大孔树脂柱层析后所得粗体物对结肠癌HT－29、Lovo细胞核因子－kB（NF－kB）活性的影响，寻找青蒿中对结肠癌细胞NF－kB活性有作用的洗脱相。

结果表明:

青蒿水煎液采用大孔树脂柱层析分离，30%乙醇洗脱相粗提物（200μg/mL）对结肠癌HT－29细胞、Lovo细胞NF－kB活性具有抑制作用。

4.4微波辅助萃取技术

微波萃取（ME）技术是食品和中药有效成分提取中的一项新技术［24］。

微波萃取的基本工艺流程为:

选料—清洗—粉碎—微波萃取—分离—浓缩—干燥—粉化—产品。

5青蒿素的合成途径

5.1半合成路线

从青蒿酸为原料出发，经过五步反应得到青蒿素，总得率约为35～50%。

①：

青蒿酸在重氮甲烷/碘甲烷/酸催化下与甲醇反应，再在氯化镍存在的条件下，被硼氢化钠选择性还原得到二氢青蒿酸甲酯；②：

二氢青蒿酸甲酯在四氢呋喃或乙醚溶液中用氢化铝锂还原成青蒿醇；③：

青蒿醇在甲醇/二氯甲烷/氯仿/四氯化碳溶液中被臭氧氧化后得到过氧化物，抽干后再在二甲苯中用对甲苯磺酸处理得到环状烯醚；④：

环状烯醚溶解于溶剂中，在光敏剂玫瑰红/亚甲基蓝/竹红菌素等存在下进行光氧化合生成二氧四环中间体，再用酸处理得到脱羧青蒿素；⑤：

脱羧青蒿素在四氧化钌氧化体系或铬酸类氧化剂的作用下氧化得到青蒿素。

5.2全合成路线

可由多种路线对青蒿素进行全合成。

应用关键化合物烯醇醚在低温下的光氧化反应引进过氧基的全合成路线，反应以（-）-2-异薄荷醇为原料，保留原料中的六元环，环上三条侧链烷基化，形成中间体，最后环合成含过氧桥的倍半萜内酯。

5.3植物组织培养合成青蒿素

利用植物组织培养来生产青蒿素是目前青蒿素研究的一大热点,可能成为大规模生产青蒿素的重要手段。

中科院化冶所、植物所等利用发根农杆菌诱导出青蒿素含量较高的黄花蒿发根。

植物组织培养生产青蒿素的研究工作者已经在青蒿愈伤组织,悬浮细胞、芽和毛状根等培养体系中进行了青蒿素合成的探索。

青蒿素等倍半萜类的生物合成在细胞质中进行，途径属于植物类异戊二烯代谢途径，可分为三大步：

由乙酸形成FPP，合成倍半萜，再内酯化形成青蒿素。

：

FPP→4,11-二烯倍半萜→青蒿酸→二氢青蒿酸→二氧青蒿酸过氧化物→青蒿素。

目前在青蒿芽、青蒿毛状根和青蒿发根农杆菌等培养体系中进行的青蒿素合成技术极有可能被应用于工业生产。

6青蒿素的生物合成

6.1青蒿素的生物合成

青蒿素为C15骨架的倍半萜类化合物，其生物合成途径可分为3个阶段，萜类化合物C5活性单位异戊烯焦磷酸（isopentenyldiphosphate，IPP）与其异构体二甲基烯丙基焦磷酸（dimethylallyldiphosphate，DMAPP）经过酶促反应合成紫穗槐二烯（amorpha-4,11-diene，AD）；2）AD到二氢青蒿酸（或青蒿酸）；3）二氢青蒿酸（或青蒿酸）经过不同的氧化反应合成青蒿素[25]。

在整个青蒿素生物合成途径研究中，有3个值得探讨的问题：

1）青蒿素C15骨架来源于植物经典的甲羟戊酸途径（mevanolatepathway，MVA）或是新近发现的MEP途径（methylerythritolphosphatepathway），抑或两者均有贡献；2）青蒿素的直接前体是青蒿酸还是二氢青蒿酸；3）二氢青蒿酸（青蒿酸）通过酶促反应或自动转化为青蒿素。

6.1.1青蒿素C15单元合成主要来源途径

青蒿素属于倍半萜类化合物，其碳骨架来源于共用前体法尼基焦磷酸（farnesyldiphophate，FPP），后者是在FPPS的作用下将IPP和DMAPP以2∶1的比例合成获得。

然而在高等植物中，合成C15活性单位的途径有来源于定位于胞质的MVA途径和定位于质体的MEP途径。

虽然在萜类化合物的合成过程中，上述两条途径存在“Closs-Talk”然而目前证实在某些化合物合成过程中，这两条途径对活性单位的贡献有主次之分，如萝芙木中萜类吲哚生物碱异戊二烯基团主要来源于MEP途径[25]。

6.1.2二氢青蒿酸是青蒿素直接前体

在早期的研究中，青蒿酸（artemisinicacid）一度被认为是青蒿素生物合成的直接前体，通过体内实验与无细胞系统实验发现，用14C标记的青蒿酸能够转化生成青蒿素B及青蒿素，提出青蒿酸可能是青蒿素生物合成的直接前体。

然而，如今更多的实验证据显示二氢青蒿素是青蒿素生物合成的直接前体，青蒿酸也被部分学者认为是青蒿素生物途径中的“DeadEnd”代谢物[26]。

利用同位素标记的青蒿酸饲喂青蒿，发现青蒿素B是青蒿酸的主要代谢产物，而且青蒿酸不能转化为二氢青蒿酸和青蒿素因此，二氢青蒿素作为青蒿素生物合成直接前体的观点已经被广为接受。

由此可见，青蒿植株中二氢青蒿酸的合成是实现青蒿素积累的重要前提。

6.1.3单线氧激发青蒿素前体自发氧化生成青蒿素

青蒿素合成的最后一个阶段即青蒿素直接前体是否通过酶促反应生产青蒿素的研究具有重要的科学意义与实用价值。

由于青蒿素生物合成的最后一步即二氢青蒿酸合成青蒿素的反应机制并不清晰，所以利用微生物工程仅能发酵生产青蒿素的前体二氢青蒿酸及青蒿酸。

目前更多的实验证据推测二氢青蒿酸转化为青蒿素可能为非酶促反应。

Towler等发现二甲基亚砜（DMSO）能够有效刺激青蒿植株中青蒿素的积累，但没有对其机制进行阐述。

进一步的研究发现，DMSO提高青蒿素积累的机制并不是提高了关键基因（如ADS、CYP71AV1）的表达，而DMSO诱导ROS的生成可能是提高青蒿素量的关键因素[27]。

此外，利用外源水杨酸（SA）喷洒青蒿叶片发现青蒿素量提高，其中原因之一为SA刺激植物体细胞产生ROS，后者促进了二氢青蒿酸转化为青蒿素。

在早期的实验中，Wallaart等[28]通过体外感光实验，推测二氢青蒿酸可能起到清除ROS的作用，从而生成青蒿素。

二氢青蒿酸自发氧化生成青蒿素的步骤已通过体外实验得到合理解释。

通过以上研究，二氢青蒿酸可能通过自发氧化的形式而非酶促反应生成青蒿素的机制可以获得前期实验结果的支持，而且二氢青蒿酸转化为青蒿素的步骤可能依赖细胞内ROS的爆发。

7青蒿素的临床应用

①抗疟作用——通过产生自由基．对恶性疟原虫红内期的生物膜产生严重破坏作用。

或与原虫蛋白结合，使之死亡。

②抗卡氏肺孢子虫肺炎作用——青蒿素主要破坏卡氏肺孢子虫膜系结构．引起孢子虫滋养体胞浆及包囊内出现空泡．线粒体肿胀．核膜破裂，内质网肿胀，囊内小体溶解破坏等超微结构的改变[29]。

③抗孕作用——青蒿素类药对胚胎有较高的选择性毒性．较低剂量即町使胚胎死亡而导致流产，有可能被开发为人工流产药物¨）。

④对肿馏的作用——双氧青蒿素对白血病、黑色素瘤、结肠癌、前列腺癌和乳腺癌细胞株高度敏感。

⑤抗血吸虫作用——其抗血吸虫活性基团是过氧桥，其药用机理是影响虫体的糖代谢J。

⑥治疗弓形虫感染作用——青蒿素主要作用于虫体细胞膜、线粒体及细胞核，继而广泛损伤其膜系结构，造成核膜断裂、线粒体肿胀、李泡样变性、内质网扩张甚至出现核碎裂、核溶解现象。

⑦对心血管的作用[30]——青蒿索能明显对抗结扎冠脉引起的心律失常。

町使氯化钙、氰仿引起的心律失常发作时间明显推迟．室颤明显减少。

⑧抗纤维化作用——与其抑制成纤维细胞增殖，降低胶原合成。

抗组胺促胶原分解有关。

⑨对免疫系统的作用——青蒿素能减少原虫感染动物IgG含量。

使脾脏蕈带减轻，血中补体白和血清总补体含量降低，控制血空斑和玫瑰花结形成细胞旧J。

⑩其它作用[31]——双氢青蒿素对杜氏利什曼原虫有显著抑制作用并呈剂量相关性。

青蒿提取物还可杀灭阴道毛滴虫和溶组织阿米巴滋养体。

此外Disbrow等[32]体外实验证实，二氢青蒿素和青蒿琥酯对HeLa细胞具有较强的毒性作用，其作用机制是激活线粒体Caspase途径而诱导细胞凋亡。

邵义如等[33]将不同浓度的二氢青蒿素作用于结肠癌细胞SW480，用免疫细胞化学检测凋亡抑制蛋白Survivin及效应蛋白Caspase-3表达情况，结果发现示二氢青蒿素作用48h后Survivin表达减弱，而Caspase-3表达增强，细胞这些改变最后都激活Caspase蛋白酶家族，导致凋亡的发生。

青蒿素多途径抗肿瘤作用，研究发现，肿瘤细胞膜是青蒿素攻击的主要靶点。

Hou等[34]通过试验证明青蒿琥酯和二氢青蒿素均能使肝癌HepG2细胞和Hep3B细胞阻滞在G0/G1期，同时可下调CyclinD1，CyclinE等周期调控蛋白。

另外，Wu[35]研究亦证实，青蒿素衍生物能将L1210（小鼠白血病细胞）及P388细胞阻滞于细胞周期中的G期，并可导致细胞凋亡，其细胞毒性作用的机制可能不同于传统的抗肿瘤药物。

8小结与展望

随着发展的要求，有关青蒿素的各项研究将逐渐趋于成熟，目前提取分离和合成的研究较广泛，并在此基础上建立青蒿及转基因青蒿中由双氢青蒿酸高效转变为青蒿素的外部条件,争取早日实现高产、优质、多抗等优良农艺性状的转基因青蒿品系的推广应用。

青蒿素类药物的抗疟疾治疗已经应用于临床多年。

近来研究显示，青蒿素类药物对恶性度高、转移能力强的肿瘤是很好的治疗选择，而且，其抗疟疾机制中的过氧化物桥可协同其他抗肿瘤药物一起杀伤肿瘤细胞而没有增加不良反应。

总之，青蒿素类药物真正的潜质及优势仍有待研究、探索与发现。

致谢

经过这几个月的努力,在侯巧芝导师的多次指导和同学们的帮助下，我顺利完成了毕业论文。

首先我非常感谢侯巧芝老师对我的谆谆教导和帮助，侯巧芝对工作及其认真负责，毫不厌烦的一遍遍的帮我查找不足并教我如何修改，大到通篇的布局小到标点符号。

在她的悉心指导下，我不但学到了扎实的专业知识，也学到了做事情要细心认真。

同时她那治学严谨的态度也时时影响着我。

在这里，我向尊敬的侯老师表示衷心的感谢和深深的敬意，同时也向这次帮助毕业设计的各位领导及辅导员表示衷心的感谢！

本次毕业论文使我懂得了做任何事情都要有耐心、持之以恒。

我由最初的不知道如何下手到后来自己查阅文献，做笔记、整理，提高了自己的总结能力和学习能力，对以后的就业及从事相关性研究打下了坚实的基础，具有很大的帮助和指导意义。

最后，我再次感谢老师和同学们对我的帮助和支持。

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