ELISA试剂配制及实验流程BDY.docx

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ELISA试剂配制及实验流程BDY

ELISA试剂配制及实验流程

ELISA是酶联接免疫吸附剂测定（（Enzyme-LinkedImmunosorbnentAssay）的简称。

以双抗体夹心法举例说明。

试剂配制：

（1）　包被缓冲液+碳酸盐缓冲液）：

　　　　　　Na2CO3

　　　　　　NaHCO3　

　　　　　　加蒸馏水至1000ml。

（用时稀释成1x，加%BSA）

（2）　洗涤缓冲液0.15MPBST）：

%Tween-20

加在PBS缓冲液1000ml中。

PBS缓冲液：

　　　　　　KH2PO4　　　　　0.27g

　　　　　　Na2HPO4·12H2O　　3.58g

　　　　　　NaCl　　　　　　　8g

　　　　　　KCl　　　　　　　　

　　　　　　加蒸馏水至1000ml。

（3）　封闭缓冲液：

　　　　　　牛血清白蛋白（BSA）2%2g

　　　　　　（或5%脱脂奶粉）加洗涤缓冲液100ml。

　　（4）　稀释液：

　　　　　　牛血清白蛋白%

　　　　　　加PBS缓冲液100ml。

　　（5）　底物缓冲液：

　　　　Na2HPO4（无水L，带12结晶水L）取

　　　　柠檬酸（无水L，带1结晶水L）取

　　　　加蒸馏水至100ml。

（或Na2HPO4·12H2O1.84g

柠檬酸·H2O0.51g

加蒸馏水至100ml）

　　（6）　TMB（四甲基联苯胺）显色液（显蓝色）：

HRP-

　　　　TMB（2mg/ml水）

　　　　底物缓冲液　　　

　　　　30%H2O2　　　

总体积1ml。

TMB,1mg/ml-DMSO溶解

（7）或配OPD（邻苯二胺）显色液（显黄棕色）（现配避光）：

OPD（干粉）0.004g

底物缓冲液10ml

30%H2O2

总体积10ml。

　　（8）　终止液（2M　H2SO4）：

　　在水中，逐滴加入浓硫酸（18M，约98%），边加边摇。

操作步骤：

1.　包被：

用包被液将抗体（一抗）稀释至蛋白质含量为1~10μg/ml。

在每板的反应孔中加，4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次，中间振荡。

（简称洗涤，下同）。

2.封闭：

加封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。

然后洗涤。

3.　加样：

加待检样品于反应孔中，置37℃温育1~2小时。

然后洗涤。

（同时做空白孔（不加样品），阴性对照孔（野生型）及阳性对照孔）。

4.加一抗：

各反应孔中加入新稀释的抗体。

置37℃温育1~2小时。

然后洗涤。

　　5.　加酶标二抗：

各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。

37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。

　　6.　加底物液显色：

各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。

　　7.　终止反应：

各反应孔中加入2M硫酸。

（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）

　　8.　结果判定：

白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。

测OD值：

在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。

通常大于规定的阴性对照OD值的倍，即为阳性（以空白对照孔调零后计算）。

间接法操作步骤：

1.　包被：

用包被液将样品稀释（梯度稀释，比例自己定），4℃过夜（或37℃温育2~3小时）。

次日，弃去孔内溶液，用洗涤液冲洗3次（5至7次），中间振荡。

（简称洗涤，下同）。

2.封闭：

加封闭液于上述已包被之反应孔中，置37℃温育2小时。

然后洗涤。

3.加一抗：

各反应孔中加入新稀释的抗体。

置37℃温育1~2小时。

然后洗涤。

　　4.　加酶标二抗：

各反应孔中加入新稀释的酶标抗体。

37℃温育45分钟~1小时，洗涤5次。

　　5.　加底物液显色：

各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液（或OPD显色液），37℃暗处温育5~20分钟，或室温暗处10~40分钟充分变色。

　　6.　终止反应：

各反应孔中加入2M硫酸。

（TMB底物蓝色变黄色，OPD底物黄色变棕色）

　　7.　结果判定：

白色背景上肉眼直接观察结果，反应孔内颜色越深，阳性程度越强，阴性反应为无色或极浅，可以依据所呈颜色的深浅，用“+”、“-”号表示。

测OD值：

在ELISA检测仪上，TMB底物法使用450nm测各孔OD值，OPD底物法使用492nm检测。

通常大于规定的阴性对照OD值的倍，即为阳性（以空白对照孔调零后计算）。

------罗凯明师兄----------

包被缓冲液（NaHCO3-Na2CO3缓冲液）量取0.2M?

NaHCO3?

17mL，0.2M?

Na2CO3?

8?

mL溶于75mL双蒸水中

PBS称取NaCl?

8.0g,?

Na2HPO4?

12H2O?

2.9g，KCl?

2.0g，KH2PO4?

0.2g溶于1000?

mL双蒸水中

洗涤液（PBST?

）量取?

Tween-20溶于1000?

mL?

PBS中

酶标抗体稀释液量取4mL新生小牛血清CS溶于96mL?

PBST中

底物液?

?

?

称取OPD?

4mg溶于40?

mL?

3%H2O2的磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液中，临用前配制

磷酸盐-柠檬酸盐缓冲液量取?

mL?

0.1M柠檬酸钠，?

mL?

0.2M?

Na2HPO4，加双蒸水至100?

mL

明胶封闭液称取1g明胶溶于100?

mL?

PBS中

小牛血清封闭液量取10mL小牛血清溶于90mL?

PBS中

酶反应终止液（2M?

H2SO4）量取10mL浓H2SO4溶于80mL双蒸水中

ELISA步骤：

----------根哥给的方法-----------

1）实验材料

目的抗原

BSA或其他对照抗原（15uμg/ml）

PBS

96孔ELISA板；

96孔ELISA封板膜；

移液枪

封闭液：

5%脱脂牛奶（w/v）-PBS

抗血清

%（v/v）Tween20-PBS

HRP-兔抗鼠多克隆抗体

TMB（A，TMB：

称取固体TMB溶于DMSO配成1mg/ml液体，避光保存，最好4度用前要检查其状态，若有凝固，可用手温将其融化；B，底物缓冲液为0.1M醋酸钠-醋酸缓冲液，；使用时用底物缓冲液稀释A液至100μg/ml；50ml缓冲液加入10μl30%H2O2）。

稀硫酸（1M）

酶标仪

2）实验步骤

（1）.用PBS缓冲液将抗原（目的抗原、BSA或其他对照抗原）稀释至μg/ml。

。

（2）.每孔加入100μl抗原稀释液，4℃包被过夜。

（3）.以用PBS洗3次（每次每孔200μl，每次洗5min）。

每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h。

（4）.弃封闭液，以%Tween20-PBS洗板3次后（每次每孔200μl，每次洗5min），然后用PBS洗3次（每次每孔200μl，每次洗5min）。

每孔加入100μl已稀释好的抗血清，37℃孵育2h。

（5）.以%Tween20-PBS洗板3次后（每次每孔200μl，每次洗5min），然后用PBS洗3次（每次每孔200μl，每次洗5min）。

6.弃洗涤液，每孔加入100μl按说明书比例稀释的HRP-兔抗鼠多克隆抗体，37℃孵育h。

7.以%Tween20-PBS洗板3次后（每次每孔200μl，每次洗5min），然后用PBS洗3次（每次每孔200μl，每次洗5min）。

8.弃洗涤液，每孔加入100μl底物液，室温孵育10min（视情况而定）。

孔内的液体将显示为蓝色。

9.每孔加入50μl稀硫酸（1M）终止反应。

10.测定OD450和OD650，并以OD450的值减去OD650的值，作为最后的检测结果。

ELISA。