Keap1-Nrf2通路在防御药物毒性中的防御机制_精品文档.doc

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Keap1-Nrf2通路在防御药物毒性中的

调控机制

摘要

药物副作用是公众健康的重要问题。

在一些情况下，药物代谢过程中能通过生物活化将母体分子转化为化学活性中间体而产生毒性。

为了维持生物活化和解毒之间的良好平衡，哺乳动物细胞演化出可以被诱导的细胞防御系统即抗氧化反应通路。

转录因子Nrf2主要通过调控大量II型解毒和抗氧化代谢酶来激活细胞保护通路。

然而，Nrf2的活性被细胞质中富含半胱氨酸的Nrf2阻抑蛋白Keap1调控，使得Keap1成为化学/氧化压力的感应器。

本文总结了我们现阶段对调控Keap1-Nrf2通路的分子机制，强调Nrf2在防御药物毒性中的重要作用。

关键词：

Nrf2，Keap1，抗氧化反应元件，细胞防御

TheKeap1-Nrf2CellularDefensePathway:

MechanismsofRegulationandRoleinProtectionAgainstDrug-InducedToxicity

Abstract

Adversedrugreactionsposeasignificantpublichealthproblem.Insomecases,theprocessofdrugmetabolismcancontributetotheonsetoftoxicitythroughthebioactivationofaparentmoleculetoachemicallyreactiveintermediate.Inordertomaintainafavorablebalancebetweenbioactivationanddetoxification,mammaliancellshaveevolvedaninduciblecelldefensesystemknownastheantioxidantresponsepathway.TheactivityofthiscytoprotectivepathwayislargelyregulatedbythetranscriptionfactorNrf2,whichgovernstheexpressionofmanyphaseIIdetoxificationandantioxidantenzymes.Inturn,theactivityofNrf2isregulatedbythecysteine-richcytosolicinhibitorKeap1,whichactsasa“sensor”forchemical/oxidativestress.ThisarticlesummarizesourcurrentunderstandingofthemolecularmechanismsthatregulatethefunctionoftheKeap1-Nrf2pathwayandhighlightstheimportanceofNrf2intheprotectionagainstdrug-inducedtoxicity.

Keywords:

Nrf2,Keap1,Antioxidantresponseelement,Celldefense

前言

药物副作用成为病人发病和死亡的主要原因[1]，在英国药物副作用是1974到1994年4%药物被撤销的原因[2]。

因此，药物副作用是公众健康的重要问题。

在一些情况下，药物代谢过程中能通过生物活化作用产生化学活性中间体，这些化学活性中间体能产生氧化压力或通过共价修饰来抑制重要的细胞大分子功能而产生毒性作用[3]。

外源化合物形成活性中间体是外源化合物的化学特性，目前研究的有害外源化合物包括：

环氧衍生物、醌类化合物、羟胺类化合物和呋喃类化合物[1]。

机体抵御外源化合物的毒作用能力通常取决于生物活化和解毒之间的平衡。

为了维持生物活化和解毒之间的良好平衡，哺乳动物细胞演化出多方面的、高度调节的细胞防御系统亦称为抗氧化反应通路。

抗氧化反应通路通过一系列解毒和抗氧化酶的转录上调，提供了对抗内源的和外源的有害活性物质的保护措施[4]。

三个调控抗氧化反应通路的组成部分是：

（1）抗氧化反应元件（ARE），存在于许多细胞保护基因启动子区域的DNA片段；

（2）碱性亮氨酸拉链蛋白家族的转录因子（Nrf2），与ARE结合的敏感的氧化还原转录因子；（3）Kelch-likeECH-associatedprotein1（Keap1），在细胞质内作为Nrf2的负调控蛋白。

Keap1揭示细胞对氧化压力的适应性反应的分子机制，对理解决定药物副作用过程和结果的细胞信号传导通路很重要。

因此，本文目的是揭示抗氧化反应通路的分子机制，强调Nrf2在防御药物毒性中的重要作用。

一转录因子NF-E2相关因子2（Nrf2）和抗氧化反应元件（ARE）

从氯高铁血红素诱导的红白血病细胞株中取得了一个反转录cDNA文库，然后从cDNA文库中筛选转录因子NF-E2调控蛋白时首次发现Nrf2；不同于在早期红细胞中调控球蛋白基因表达的NF-E2，Nrf2在许多组织中表达；尤其是与解毒有关（肝和肾）和暴露于外界环境（皮肤、肺和消化道）的器官[5]。

与其它CNC家族的转录因子一样，Nrf2的命名是因为它具有cap"n"collar（CNC）类似结构域，Nrf2包括一C-末端的碱性亮氨酸拉链（bZiP）结构，bZiP结构能与其它bZip蛋白形成二聚体并与DNA结合。

通过基因修饰[6]和电泳迁移率检测（EMSA）[7]实验，研究证实Nrf2与ARE结合并上调下游目的基因表达。

ARE是位于DNA增强子的顺式反应元件，被定义为包含5＇-gagTcACaGTgAGtCggCAaaatt-3＇的序列[8]。

ARE最初是从酚类抗氧化剂β-萘黄铜诱导的大鼠谷胱甘肽转移酶2（GSTA2）基因的5＇上游侧翼序列识别出的41-bp序列[9]。

Nrf2能与包含bZip结构域的小Maf蛋白：

MafF、MafG或MafK结合形成异源二聚体，这个异源二聚体与ARE有高亲和力[10]。

然而，小Maf蛋白缺少转录活性结构域，因此Nrf2-Maf异源二聚体的转录活性依赖于Nrf2转录活性[11]。

小Maf蛋白的过表达通过小Maf蛋白之间结合形成同源二聚体而缺乏转录活性，抑制了Nrf2介导的细胞防御基因的转录[7,12,13]。

用鸡的Nrf2蛋白同系物（从红系细胞提取的含有类似于CNC结构域的蛋白）[14]的结构与人和小鼠的Nrf2蛋白对比，识别出6个高度保守的区域，称之为环氧氯丙烷（epichlorohydrin，ECH）相关蛋白同源结构域（Neh）。

Neh1结构域包含保守的CNC和bZip序列片段[15]，因此Neh1对于Nrf2与小Maf蛋白结合形成异源二聚体及异源二聚体与DNA结合很重要。

Nrf2的Neh4和Neh5结构域参与招募转录辅因子[16]，特别是与环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（cyclicAMPresponsee1ement-bindingprotein，CREB）结合的蛋白（CREB-bindingprotein，CBP）[17,18]；所以Neh4和Neh5结构域对于Nrf2与ARE模序结合并且调控目的基因转录有重要作用。

被激活的Nrf2通过上调大量细胞保护基因的表达（表2），来解毒或减小化学/氧化压力使细胞得以生存（图2）。

图1Nrf2功能性结构域

注：

小鼠Nrf2蛋白6个（Neh）功能性结构域。

每刻度表示Nrf2蛋白中100氨基酸，共597氨基酸。

表1小鼠Nrf2蛋白功能性结构域

结构域

功能和特征

参考文献

Neh21–96

包含29DLG31和79ETGE82序列片段（与Keap1结合区域）

包含富含赖氨酸的区域（泛素化作用区域）

包含DIDLID元件（内环境稳定状况下调控Nrf2降解）

[15,19,20-22]

Neh4111–141

转录激活区与转录辅因子CBP相互作用

[17]

Neh5172–201

转录激活区

与转录辅因子CBP相互作用

包含核输出信号（NES）

[17,23,24]

Neh6330–380

在压力状态下调控Nrf2降解

[20]

Neh1427–560

包含CNC和bZip区域

ARE结合区

与其它bZip蛋白（小Mafs蛋白）形成异源二聚体

包含核转入和输出信号（NLS、NES）

[15,25,26]

Neh3561–597

转录激活区

与转录辅因子相互作用

[27]

尽管目前为止Nrf2是CNC-bZip家族中激活ARE最有效的转录因子[28,29]，Nrf1[30]也通过调控ARE介导的基因表达在抵御化学/氧化压力表现出有限的作用[6,31,32,33,34]。

甚至，Nrf1对于胚胎发育很重要，Nrf1—/—小鼠中胚胎在怀孕17–18天死亡[35]。

Nrf1敲除致死的结果至少部分被认为是因为胚胎发育期肝细胞存活下降[36]。

值得注意的是尽管Nrf2不是胚胎发育期所必须的，Nrf1—/—∷Nrf2—/—胚胎比Nrf1—/—胚胎死亡更早（怀孕9–10天），这是由于上升的氧化压力[37]。

这项研究表明了Nrf1和Nrf2在提高胚胎存活方面起到协同作用，进一步强调了ARE转录因子在细胞保护过程中的重要作用。

目前，我们对Nrf3在防御细胞压力方面的理解没有Nrf1和Nrf2那么深刻。

尽管Nrf3被认为能与MafK形成二聚体并与ARE结合以激活转录过程[28]，然而Nrf3不在肝脏中表达，而肝脏又是机体内主要的外源化合物代谢和解毒场所[38,39]。

此外，Nrf3的缺失没有表型的改变，至少是没有细胞压力的情况下是如此[38,39]。

因此，Nrf3在抵御细胞压力方面的生理功能仍然不清楚。

然而有证据表明Nrf3除了是包括p65型Nrf1[40]，bric-a-brac/tram-track/broadcomplex（BTB）模序和CNC同系物（Bach1）[41,42,43]；和Bach2[44]等蛋白以外的CNC-bZip家族蛋白，可能部分通过与Nrf2竞争结合到ARE上，表现为ARE基因表达的负调控蛋白。

未来研究方向将集中在更好理解CNC-bZip家族蛋白的相互作用上的功能和意义。

表2Nrf2下游基因及其功能

基因

蛋白功能

参考文献

Aldo-ketoreductases

（AKR）

还原醛和酮类生成伯醇和仲醇

[45,46]

Glutamatecysteineligase,catalyticsubunit（GCLC）

催化半胱氨酸和L-谷氨酸的结合生成γ-谷氨酰半胱氨酸

[47-50]

Glutamatecysteineligase,regulatorysubunit（GCLM）

降低谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化亚基（GCLC）的米氏常数Km（酶促反应的速度为Vmax的一半时的底物浓度）代谢谷氨酸盐，升高代谢谷胱甘肽的反应常数Ki（离解常数，即电离常数又叫电离平衡常数，用Ki表示）

[47,50,51]

Glutathioneperoxidases

（GPX）

以GSH为底物催化H2O2、有机过氧化氢物和脂质过氧化物的还原

[52,53]

Glutathionereductase

（GSR）

催化氧化型谷胱甘肽（GSSG）还原为GSH

[54]

Gl