IEF使用过程中常见问题及解决方法_精品文档.doc

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IEF使用过程中常见问题及解决方法

以下为IEF在使用过程中可能会碰到的问题，详细情况请阅读说明书。

如果操作错误或系统错误时，相应的错误信息会显示在液晶屏上。

同时系统的电源供应会在错误信息显示时自动切断。

问题

可能原因

解决方法

初始电流低或为零

•IPG胶条与电极接触不好.

•检查IPG胶条与电极的接触情况，确保聚焦槽的盖子正确地合上.

•PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极接触不完全.

•检查聚焦盘的放置位置，确保PROTEANIEF等电聚焦仪与聚焦盘电极正确接触.

•IPG胶条水化不完全

•确保IPG胶条完全并平均地进行水化。

检查水化液体积及水化时间.

在升压过程中电压不上升.

•盐浓度过高

•检查盐浓度并对样品进行除盐处理.

电压未能达到预设电压或达到极限电压过程非常缓慢

•Bio-Lyte浓度过高

•将Bio-Lyte浓度降至0.2%（v/v）.

•对不同尺寸的IPG胶条和pH梯度电压设置过高.

•在聚焦时请用伏小时进行编程，以确保样品的完全聚焦.

•过多的样品在水化过程中未能进入胶条,或IPG胶条因过多的样品导致过度泡涨

•如果使用了超过了推荐的样品体积量，确保所有样品能进入胶条,或在聚焦前除去多余的样品液.

电压及电流波动很大.（同时电阻错误信息会显示）

•IPG胶条中有水化较差的区域,或IPG胶条在运行过程中已经烧干.

•检查水化缓冲液体积及时间.确保在水化期间水化缓冲液平均地分配.

•限流过高.

•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.

问题

可能原因

解决方法

烧胶条（这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示.）

•限流过高.

•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.

•IPG胶条已经烧干.

•确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干

•电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液.

•确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态.

•水化缓冲液成份不合适,盐浓度过高.

•检查水化缓冲液浓度。

必要时重新配制缓冲液.

双向电泳实验中常见问题

一、水平条纹

出现的问题:

胶上出现连续性横纹。

可能的原因:

蛋白质没有完全和稳定溶解。

推荐解决的方法:

·用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。

因此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e.g.CHAPS,ASB-14），两性电解质和还原剂（DTTorTBP）非常重要。

每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。

为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液：

o8–9Murea,4%（w/v）CHAPS,2mMTBPor50mMDTT,40mMTris,0.2%（w/v）Bio-Lyte3/10Ampholyte

o7Murea,2Mthiourea,4%（w/v）CHAPS,2mMTBPor50mMDTT,40mMTris,0.2%（w/v）Bio-Lyte3/10Ampholyte

·样品须有充分的溶解时间和变性时间。

通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1小时左右。

·进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（>10,000rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。

推荐产品:

ReadyPrepproteinextractionkit（totalprotein/全蛋白）

出现的问题:

出现不连续的横纹。

可能的原因:

样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂（SDS）,肽类,核酸类（e.g.DNA,RNA）,脂类,多糖和酚类化合物。

推荐解决的方法:

以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。

更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）.

盐：

为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。

样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。

蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理（Damervaletal.1986）,也可选用ReadyPrep2-Dcleanupkit。

沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。

注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。

阴离子去污剂：

SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。

SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。

但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。

如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。

最终，样品中SDS的含量须低于0.25%（w/v），样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：

1。

如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。

核酸：

处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率。

核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。

同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。

通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。

在样品中加入0.1xsolutioncontaining1mg/mlDNaseI,0.25mg/mlRNaseA,and50mMMgCl2而后冰浴（Blombergetal.1995）.注意：

Mg2+离子是DNase活性所必须的。

多聚糖类：

同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF。

此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。

建议通过TCA/丙酮沉淀（Damervaletal.1986）；或者醋酸铵沉淀后酚抽提（HurkmanandTanaka1986）；或者使用ReadyPrep2-Dcleanupkit处理样品。

脂类：

蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。

在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。

一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前,须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物（WesselandFlugge1984）。

酚类化合物：

植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。

这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。

酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。

1.酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone（PVP）orpolyvinylpolypyrrolidone（PVPP）吸附。

2.样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。

3.氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。

4.裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮（Damervaletal.1986）.，可以抑制酚氧化。

推荐产品:

ReadyPrep2-Dcleanupkit

Bio-Spin/MicroBio-Spin6columns

出现的问题:

出现不连续的横纹。

可能的原因:

样品中含有干扰物质,比如盐类,离子去污剂（SDS）,肽类,核酸类（e.g.DNA,RNA）,脂类,多糖和酚类化合物。

推荐解决的方法:

以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。

更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）.

盐：

为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM。

样品中的盐类物质可以通过透析,凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。

蛋白质沉淀可以选用10%TCA丙酮处理（Damervaletal.1986）,也可选用ReadyPrep2-Dcleanupkit。

沉淀后，可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。

注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。

阴离子去污剂：

SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。

SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。

但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。

如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。

最终，样品中SDS的含量须低于0.25%（w/v），样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：

1。

如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。

核酸：

处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率。

核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。

同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。

通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。

在样品中加入0.1xsolutioncontaining1mg/mlDNaseI,0.25mg/mlRNaseA,and50mMMgCl2而后冰浴（Blombergetal.1995）.注意：

Mg2+离子是DNase活性所必须的。

多聚糖类：

同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF。

此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。

建议通过TCA/丙酮沉淀（Damervaletal.1986）；或者醋酸铵沉淀后酚抽提（HurkmanandTanaka1986）；或者使用ReadyPrep2-Dcleanupkit处理样品。

脂类：

蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。

在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。

一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前,须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物（WesselandFlugge1984）。

酚类化合物：

植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。

这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。

酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。

1.酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone（PVP）orpolyvinylpolypyrrolidone（PVPP）吸附。

2.样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。

3.氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。

4.裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮（Damervaletal.1986）.，可以抑制酚氧化。

推荐产品:

ReadyPrep2-Dcleanupkit

Bio-Spin/MicroBio-Spin6columns

出现的问题:

胶部分出现横纹。

可能的原因:

蛋白上样量过高。

推荐解决的方法：

a）稀释样品，降低样品浓度。

在进行IEF前，须对样品进行定量，以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度。

蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定。

b）使用长IP