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精选药物遗传毒性研究技术指导原则资料
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药物遗传毒性研究技术指导原则
一、概述
遗传毒性研究（GenotoxicityStudy）是药物非临床安全性评价的重要内容，与其他研究尤其是致癌性、生殖毒性等研究有着密切的联系，是药物进入临床试验及上市的重要环节。
拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行遗传毒性试验。
遗传毒性试验是指用于检测通过不同机制直接或间接诱导遗传学损伤的受试物的体外和体内试验，这些试验能检测出DNA损伤及其损伤的固定。
以基因突变、较大范围染色体损伤或重组形式出现的DNA损伤的固定，通常被认为是可遗传效应的基础，并且是恶性肿瘤多阶段发展过程的重要因素（恶性肿瘤发展变化是一个复杂的过程，遗传学改变可能仅在其中起部分作用）。
染色体数目的改变也与肿瘤发生有关，并可提示生殖细胞出现非整倍体的可能性。
在遗传毒性试验中呈阳性的化合物为潜在的人类致癌剂和/或致突变剂。
由于在人体中已建立了某些致突变/遗传毒性化合物的暴露与致癌性之间的相关性，而对于遗传性疾病尚难以证明有类似的相关性，因此遗传毒性试验主要用于致癌性预测。
但是，因为生殖细胞突变与人类疾病具有明确的相关性，所以也应同样重视化合物引起潜在可遗传性效应的风险。
此外，遗传毒性试验结果可能对致癌性试验的结果分析有重要作用。
因此，在药物开发的过程中，遗传毒性试验的目的是通过一系列试验来预测受试物是否有遗传毒性，在降低临床试验受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。
本指导原则重点阐述遗传毒性试验的基本原则，介绍标准试验组合方案，阐述体内外试验的基本原则，以及对试验结果的分析评价与追加研究策略。
本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物。
二、基本原则
（一）实验管理
药物遗传毒性试验必须执行《药物非临床研究质量管理规范》（GLP）。
（二）具体问题具体分析
遗传毒性试验的设计，应该在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。
应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并试验结果进行全面的分析与评价。
（三）随机、对照、重复
遗传毒性试验应符合毒理学试验随机、对照、重复的基本原则。
三、基本内容
（一）受试物
中药、天然药物：
受试物应采用能充分代表临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。
应采用工艺路线及关键工艺参数确定后的工艺制备，一般应为中试或中试以上规模的样品，否则应有充分的理由。
化学药物：
受试物应采用工艺相对稳定、纯度和杂质含量能反映临床试验拟用样品和/或上市样品质量和安全性的样品。
受试物应注明名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件、有效期及配制方法等，并提供质量检验报告。
试验中所用溶媒和/或辅料应标明名称、标准、批号、有效期、规格和生产单位等，并符合试验要求。
应进行受试物样品分析，并提供样品分析报告。
在药物研发的过程中，若受试物的工艺发生可能影响其安全性的变化，应进行相应的安全性研究。
（二）标准试验组合
对药物而言，需对潜在的遗传毒性进行全面评价。
遗传毒性试验方法有多种，根据试验检测的遗传终点，可将检测方法分为三大类，即基因突变、染色体畸变、DNA损伤；根据试验系统，可分为体内试验和体外试验。
由于没有任何单一试验方法能检测出所有的与肿瘤发生相关的遗传毒性机制，因此，通常采用体外和体内试验组合的方法，以全面评估受试物的遗传毒性风险。
这些试验相互补充，对结果进行判断时应综合考虑。
1.标准试验组合应具备的特征
标准试验组合应反映不同遗传终点，包括体内和体外试验，应包含以下内容：
（1）应包含细菌回复突变试验（又称Ames试验）。
该试验已证明能检出相关的遗传学改变和大部分啮齿类动物和人类的遗传毒性致癌剂。
（2）应包含哺乳动物细胞体外和/或体内试验。
哺乳动物细胞体外试验中，体外中期相染色体畸变试验、体外微核试验、体外小鼠淋巴瘤L5178Y细胞Tk基因突变试验（简称小鼠淋巴瘤细胞试验，MLA）已经过充分验证并广泛应用，且同样适合于检测染色体损伤。
若实验室对这些方法已进行了充分的验证，当用于标准试验组合中时，这几个试验可互相替换。
体内试验具有考虑到如吸收、分布、代谢、排泄等因素的优势，并且可检出体外试验无法检出的某些遗传毒性物质（注释1），因此标准试验组合应至少包含一项体内试验。
可采用啮齿类动物造血细胞染色体损伤试验（包括骨髓或外周血红细胞微核试验、骨髓中期相细胞染色体畸变试验）或其他合适的体内试验。
2.推荐的两种标准试验组合
组合一：
（1）一项细菌回复突变试验；
（2）一项检测染色体损伤的体外细胞遗传学试验（体外中期相染色体畸变试验或体外微核试验），或一项体外小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验；
（3）一项体内遗传毒性试验，通常为啮齿类动物造血细胞染色体损伤试验，用于检测微核或中期相细胞染色体畸变。
组合二：
（1）一项细菌回复突变试验；
（2）采用两种不同组织进行的体内遗传毒性试验，通常为一项啮齿类动物造血细胞微核试验和第二项体内试验。
以上两种试验组合同等适合（注释2），可根据受试物特点自主选择。
体内试验可采用单次给药或重复给药的试验设计。
如果试验设计科学合理，采用重复给药时可将遗传毒性终点指标整合入一般毒性试验中；当在体内评价一项以上的遗传毒性终点指标时，也可将它们整合在一项试验中。
但是，整合的前提条件是试验设计（例如剂量、采样）对于重复给药试验是合适的，并且需要获得充分的支持信息。
完成上述任何一种标准试验组合，若试验结果为阴性，通常可提示受试物不具有遗传毒性。
对于标准试验组合结果为阳性的受试物，根据其治疗用途，可能需要进一步的试验。
标准试验组合不包含为检测非整倍体而设计的特定试验。
但是，检测中期相细胞染色体畸变的体外和体内试验可检测多种类型的染色体完整性方面的改变，微核试验具有检测某些非整倍体诱导剂的能力，小鼠淋巴瘤细胞试验也可检测染色体丢失（可能导致非整倍体）。
建议采用标准试验组合并不意味着其他遗传毒性试验不合适，这些试验可作为标准试验组合以外的供选试验，用于对标准试验组合得到的遗传毒性试验结果的进一步研究。
在某些情况下，标准试验组合中的一项或多项试验对于受试物不适合或因技术原因无法实施时，可采用其他经过验证的试验作为替代试验，但应提供充分的科学合理性及依据。
附录部分简介标准试验组合中常用的几种试验方法，该部分内容只是基本原则，试验时应根据具体情况具体分析，合理设计。
3.标准试验组合的调整
标准试验组合在一些特殊情况下不适合，需要根据情况进行调整。
（1）当受试物对细菌有高毒性时（如某些抗生素），仍应进行细菌回复突变试验，因为致突变性可能出现在较低的、毒性较小的浓度。
同时，还应进行一项体外哺乳动物细胞试验，即采用标准试验组合一。
（2）标准试验组合通常可检出具有遗传毒性作用警示结构的受试物（注释3），因为大部分“警示结构”被定义为与细菌诱变性有关。
但是，对于具有某些特殊警示结构的化合物，需要对标准组合方案进行调整（注释4）。
附加试验的选择或方案的调整取决于这些具有警示结构受试物的化学性质、已知活性和代谢信息。
（3）某些特殊的受试物，如一些放射影像剂、抗酸铝合剂、一些吸入用药、一些皮肤或其他局部用药，毒代或药代动力学研究提示其不被全身吸收，因此在体内遗传毒性试验中无法到达靶组织（注释5）。
对于这些受试物，体内试验（尤其是骨髓、血液、肝脏）难以提供有用的信息。
在改变给药途径也不能提供足够的靶组织暴露，且对暴露量最高的组织无合适的遗传毒性试验的情况下，仅根据体外试验进行评价可能是合适的。
某些情况下，采用接触部位评价遗传毒性作用可能也是合理的，尽管这些试验尚未广泛应用（注释6）。
4.生殖细胞诱变剂的检测
遗传毒性对生殖细胞的影响也极其重要。
标准试验组合中不包含专门检测生殖细胞诱变剂的试验。
但是，比较研究结果显示，从定性的角度，大多数生殖细胞诱变剂能在体细胞试验中检出，因此体内体细胞遗传毒性试验的阴性结果通常可提示受试物对生殖细胞无影响。
体内体细胞试验结果为阳性时，在综合评价及指导用药时应关注受试物对生殖细胞的影响。
（三）体外、体内试验基本要求
遗传毒性的体内外试验方法较多，本指导原则仅讨论常用方法及需要重点关注的问题，试验时需具体情况具体分析。
无论体外、体内试验，方法学均应经过充分验证。
各实验室应建立历史背景对照数据库（包括阴性和阳性对照数据库）。
1.体外试验基本要求
1.1细菌回复突变试验中采用的菌株
细菌回复突变试验至少应采用5种菌株，包括用于检测组氨酸靶基因中鸟嘌呤-胞嘧啶（G-C）位点碱基置换或移码突变的4种组氨酸营养缺陷型鼠伤寒沙门氏菌（TA98；TA100；TA1535；TA1537/TA97/TA97a），以及用于检测组氨酸或色氨酸基因中腺嘌呤-胸腺嘧啶（A-T）位点碱基置换与检测交联剂的鼠伤寒沙门氏菌TA102或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA或埃希氏大肠杆菌WP2uvrA（pKM101）。
1.2体外试验中最高浓度的确定（注释7）
体外试验中受试物的最高浓度主要取决于受试物对细菌/细胞的毒性和溶解度。
1.2.1最高浓度
对不受溶解度或细胞毒性限制的受试物，细菌回复突变试验应达到的最高浓度为5mg/皿（液体受试物为5µl/皿），哺乳动物细胞试验为1mM或0.5mg/ml（选用较低者）。
1.2.2要求达到的细胞毒性水平
在遗传毒性体外试验中，某些遗传毒性致癌剂只有在检测浓度高达可产生一定程度的细胞毒性时才可检出，但毒性过高又会影响对相应的遗传终点进行恰当的评价。
当哺乳动物细胞存活率很低时，一些遗传毒性以外的作用机制如细胞毒性（如与细胞凋亡、溶酶体释放核酸内切酶等有关的结果）会导致遗传毒性假阳性结果，这种情况常发生于受试物浓度达到毒性阈浓度时。
鉴于以上情况，在体外细菌和哺乳动物细胞试验中，目前可接受以下的细胞毒性水平（浓度不应超过1.2.1中的规定）：
（1）细菌回复突变试验中，进行评价的浓度应能显示明显的毒性，如回复突变菌落数目减少、背景菌苔减少或消失。
（2）哺乳动物细胞体外遗传学试验中，最高浓度产生的细胞毒性应约为50%。
（3）对于小鼠淋巴瘤细胞Tk基因突变试验，最高浓度产生的细胞毒性应为80%～90%。
1.2.3难溶受试物的检测
用细菌和哺乳动物细胞遗传毒性试验检测某些受试物时，在不溶解的浓度范围内也能检测出剂量相关性的遗传毒性。
建议采用以下策略检测相对不溶的受试物：
（1）对于细菌回复突变试验，如果沉淀不干扰计数，应对产生沉淀的浓度进行计数，且最高浓度不超过5mg/皿或5µl/皿。
当未观察到细菌毒性时，应以产生沉淀的最低浓度作为计数的最高浓度；当观察到剂量相关的细菌毒性或诱变性时，应按上述细胞毒性的要求来确定最高浓度。
（2）对于哺乳动物细胞试验，若沉淀不干扰计数，最高浓度应是培养液中产生最少可见沉淀的最低浓度。
应通过肉眼观察或镜检等方法来观察记录沉淀在培养过程中持续存在或培养过程中出现（至处理结束时）。
1.3体外试验的重现性
体外试验应关注重现性。
当采用新方法或试验出现非预期结果时，有必要进行重复试验。
但是，当采用标准的、已广泛应用的常规体外试验方法时，若这些试验经过了充分验证且进行了有效的内部质量控制，得到明确的阳性或阴性结果，通常不需要重复试验。
但是，若得到可疑结果，则需要进一步试验。
2.体内试验基本要求
2.1检测染色体损伤的体内试验
采用骨髓细胞分析染色体畸变或检测含微核的嗜多染红细胞的体内试验方法均可用于检测染色体断裂剂。
由于细胞分裂后期的一个或多个染色体相对滞后也能形成微核，因此微核检测方法也能检测一些非整倍体诱导剂（注释8）。
大鼠和小鼠均适用于骨髓微核试验。
微核也可通过小鼠外周血中未成熟红细胞（如嗜多染红细胞）或大鼠血液新生网织红细胞测定（注释9）。
同样，也可使用已证明了对检测断裂剂/非整倍体诱导剂具有足够灵敏度、来源于其他种属动物的骨髓或外周血的未成熟红细胞。
除人工镜检方法外，若方法学经过了充分验证，也可采用自动化分析系统（如图像分析系统和流式细胞术）对微核进行检测。
啮齿类动物给药后，取外周血淋巴细胞进行体外培养，也可用于分析染色体畸变（注释10）。
2.2其他体内遗传毒性试验
第二项体内试验可作为第二种标准试验组合的一部分，并可用作追加试验以在评价体外或体内试验结果时提高证据权重（注释11）。
体内组织和试验的选择应根据多种因素来确定，例如受试物可能的作用机制、体内代谢特征或者被认为是相关的暴露组织等信息。
由于肝脏的暴露和代谢能力，肝脏是代表性的首选组织。
第二种体内试验经常以评价DNA损伤为终点指标作为替代终点。
目前，已有大量应用经验的试验包括：
DNA链断裂试验如单细胞凝胶电泳试验（彗星试验）和碱洗脱试验、转基因小鼠体内突变试验、DNA共价结合试验。
2.3体内试验的给药途径
一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。
若不一致，应说明理由。
但是，为获得全身暴露，在适当时可进行调整，如局部给药的受试物。
2.4体内试验啮齿类动物性别的选用
短期给药（通常是给药1～3次）的体内遗传毒性试验一般可单用雄性动物。
若已有的毒性、代谢或暴露资料提示在所用动物种属上存在毒理学意义的性别差异，则应采用两种性别的动物。
当遗传毒性试验整合在重复给药毒性试验中时，应对两种性别动物进行采样，如果毒性、代谢方面没有明显性别差异，可仅对单一性别进行评价。
如果受试物拟专用于单一性别，可选用相应性别的动物进行试验。
2.5体内试验的剂量选择（注释7）
通常应对有代表性的三个剂量水平进行分析检测。
对于短期试验（通常是给药1～3次），推荐的最高剂量是：
限度剂量2000mg/kg（若可耐受），或最大耐受量（为产生毒性的剂量，而基于同样的给药方案，比该剂量稍高即预期会出现死亡）。
剂量选择时还应考虑骨髓红细胞生成的抑制。
最高剂量之下的其他剂量一般剂量间距为约2～3倍。
对于多次给药试验，分为两种情况：
（1）当采用标准试验组合一时，若该试验整合在重复给药毒性试验中，如果该重复给药毒性试验符合支持人体临床试验的一个充分试验的标准，则通常认为对于遗传毒性评价剂量是合适的，该原则适用于体外哺乳动物细胞试验结果为阴性或不相关的阳性时。
（2）当进行追加试验或当采用标准组合二时，应对多种因素进行评价以确定高剂量是否适合用于遗传毒性评价。
毒性试验（尤其是大鼠试验）的高剂量需满足以下任何一条标准，才可用于遗传毒性评价：
①最大给药量，基于受试物在溶剂中的理化性质。
②对于给药14天或更长时间的试验，如果能耐受，限度剂量为1000mg/kg。
③最大可能暴露量，通过达到暴露峰值/稳态或受试物的蓄积来证明。
若受试物的暴露量随给药时间增加而明显减少（如比起始暴露量减少≥50%），则不宜采用多次给药试验。
④高剂量≥急性给药试验所采用高剂量的50%，即接近最小致死量。
仅基于无毒性的暴露范围（高于临床暴露量的若干倍）来选择高剂量，不是充分合理的。
对于具有血液或骨髓毒性的受试物，进行遗传毒性评价的剂量应在具有严重红细胞系毒性（如具有明显的嗜多染红细胞或网织红细胞抑制）的高剂量之下、间距不超过约2倍。
（四）试验的阶段性
细菌回复突变试验可支持单次给药的临床试验；为支持多次给药的临床试验，应采用哺乳动物细胞进行一项评估染色体损伤试验；在Ⅱ期临床试验开始前完成完整的遗传毒性标准试验组合。
但是，为了减少药物开发风险、保护受试者安全，建议在临床试验开始前完成遗传毒性标准试验组合。
四、试验结果评价与追加研究策略
遗传毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一个重要组成部分，其最终目的在于预测受试物潜在的致癌性或其他遗传危害性。
试验结果的分析与评价是试验的必要组成部分，应对研究结果进行科学和全面的分析与评价。
在对遗传毒性试验结果进行评价时，应结合受试物的药学特点、药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果等信息进行综合分析。
试验结果的评价最终应落实到临床试验受试者范围限定、风险效益评估以及必要防治措施的制定和应用上。
遗传毒性试验组合检测的是主要通过直接的遗传损伤机制的致癌物质（如绝大多数已知的人类致癌剂），不适用于检测非遗传毒性致癌剂。
每种试验系统均可能产生假阴性或假阳性结果。
一些试验条件，如有限的体外代谢活化能力，可能导致体外试验出现假阴性结果。
试验组合方法的设计是为了减少具有潜在遗传毒性的受试物产生假阴性结果的风险。
另一方面，任何一项遗传毒性试验中的阳性结果并不一定能说明受试物对人类真正具有遗传毒性或致癌性的危险。
在对体内外试验结果进行评价时，对阳性或阴性的结果均应予以充分考虑，尤其是在有疑问时。
评价受试物的潜在遗传毒性时，应全面考虑各项试验结果、体内和体外试验方法的内在价值及其局限性，进行综合分析与评价。
（一）体外试验结果的评价
1.体外试验阳性结果
1.1体外细菌回复突变试验阳性结果的评价
由于细菌回复突变试验的阳性结果提示DNA反应性，为评估对患者用药的潜在风险，需进行充分的追加试验以评价体内致突变和潜在致癌性，除非通过恰当的风险获益分析证明是合理的。
细菌回复突变试验出现阳性结果，应考虑受试物的纯度，以确定阳性结果是否污染物所致。
氨基酸（组氨酸或色氨酸）污染可能导致菌落数的升高而出现假阳性结果，因此细菌回复突变试验不适合检测可能会降解的肽类。
一些特殊情况下，细菌回复突变试验阳性结果并不提示对人体有遗传毒性潜力，例如当发生细菌特异性代谢时（如通过细菌硝基还原酶活化）。
1.2体外哺乳动物细胞试验阳性结果的评价
对于体外哺乳动物细胞试验阳性结果，应采用下述的证据权重法进行分析，必要时进行追加试验。
例如（包括但不限于）：
①阳性结果是否归因于体内不存在的条件（如pH值、渗透压、沉淀物）；②阳性结果仅发生于产生最高细胞毒性的浓度：
在小鼠淋巴瘤细胞试验中阳性结果发生于相对总细胞生长率（Relativetotalgrowth，RTG）减少≥80%时；在体外细胞遗传学试验中阳性结果发生于细胞生长抑制≥50%时。
对于以上情况，如果应用证据权重法分析提示缺乏潜在遗传毒性，可采用标准试验组合一，即一个体内试验即可。
2.体外试验阴性结果
对于体外试验阴性结果，在一些特殊情况下需考虑进行进一步的试验，例如（包括但不限于）：
受试物的化学结构或已知代谢特征提示标准的体外代谢活化技术（如啮齿类动物肝脏S9）可能不适用；受试物的化学结构或已知活性提示采用其他试验方法或系统更合适。
（二）体内试验结果的评价
与体外试验相比，体内试验方法具有考虑到与人体应用相关的吸收、分布、排泄的优点，而且体内代谢相对于体外试验中的代谢系统更具有相关性。
因此，体内试验在遗传毒性试验中具有更重要的意义。
如果体外与体内试验的结果不一致，对其结果差异应采用具体问题具体分析的原则进行分析与评价，如代谢差异、受试物在体内快速和高效排泄等。
1.体内试验阴性结果
体内试验结果的意义与受试物在靶组织（注释5）中是否有足够的暴露直接相关，尤其是当体外试验为确定的阳性结果而体内试验结果为阴性时，或者是当未进行体外哺乳动物细胞试验时更为重要。
受试物在靶组织中具有足够暴露的证据包括可疑组织的毒性，或下述的毒代动力学资料。
如果受试物在靶组织中无法达到足够的暴露量，则常规的体内遗传毒性试验的意义较小。
对于体外遗传毒性试验结果为阳性（或未进行）而体内试验结果为阴性的受试物，应采用以下任何一种方法来反映受试物在体内/靶组织的暴露水平：
（1）细胞毒性
对于细胞遗传学试验，可通过微核试验中各剂量组和各采样时间点所用组织（骨髓或外周血）中未成熟红细胞数与红细胞总数的比例的显著变化，或通过染色体畸变试验中有丝分裂指数的显著降低，来间接反映受试物的暴露水平。
对其他体内遗传毒性试验，可通过肝脏或组织的毒性（如通过组织病理学检查或血液生化学指标）来间接反映受试物的暴露水平。
（2）暴露
通过测定血液或血浆中的受试物相关物质水平来反映受试物的体内暴露（注释12）；直接测定靶组织中的受试物相关物质；或通过放射自显影检测组织暴露水平。
体内暴露的评估应采用与遗传毒性试验相同的动物种属、品系和给药途径，在最高剂量或其他相关剂量中进行。
如果全身暴露与预期的临床暴露相似或更低，提示可能需要采用替代的方法，如采用不同的给药途径、采用具有更高暴露的不同种属、采用不同的组织或试验。
若体外试验未显示受试物有潜在遗传毒性，可采用上述任何一种方法，也可用啮齿类动物吸收、分布、代谢和排泄试验结果来确定体内暴露水平。
2.体内试验阳性结果
体内遗传毒性试验也可能出现假阳性结果，例如：
未给予任何遗传毒性物质，但由于干扰了红细胞生成而导致微核升高；DNA加合物数据应根据内源性加合物的已知背景水平进行解释分析；与毒性相关的间接作用可能影响DNA链断裂试验（如彗星试验和碱洗脱试验）的结果。
因此评价遗传毒性数据时应考虑所有的毒理学和血液学发现（注释13）。
与毒理学改变相关的间接作用可能有一个安全范围，且可能不具有临床相关性。
（三）阳性结果追加研究策略
1.对体外哺乳动物细胞试验阳性结果的追加
以下讨论基于细菌回复突变试验结果为阴性。
1.1追加机制/体内试验
体外哺乳动物细胞试验为阳性结果且无充分证据以排除生物学相关性时，建议进行追加试验以提供试验证据。
可进行附加的体外试验或进行两种合适的体内试验，具体如下：
（1）进行附加的体外试验。
体外试验可为阳性结果缺乏生物学相关性提供机制信息，如小鼠淋巴瘤细胞试验中诱导染色体畸变或突变的受试物不是DNA损伤性物质的证据（如：
除细菌回复突变试验外的其他突变/DNA损伤试验结果为阴性；化学结构上的考虑），或者体内可能不相关或可能具有阈值的间接机制的证据（如抑制DNA合成、仅在高浓度时产生活性氧簇等）。
体外微核试验阳性结果的追加试验也可采用类似的试验，或者证据还可包含提示染色体丢失/非整倍体的已知机制、着丝点染色试验（注释14）提示染色体丢失。
多倍体是体外染色体畸变试验中的一种常见现象。
虽然非整倍体剂可诱导多倍体产生，但仅多倍体产生并不能提示受试物具有诱导非整倍体的潜力，而可能仅提示细胞周期紊乱；多倍体也常常与细胞毒性的升高有关。
如果在体外试验中仅见多倍体，而未见结构上的染色体断裂，一个确保具有合适暴露的体内微核试验的阴性结果，通常可提供不具有潜在非整倍体诱导作用的充分证据。
如果上述机制信息和证据权重分析支持受试物不具有相关的遗传毒性，仅需要一个具有合适暴露证据的体内试验，以确定受试物不具有遗传毒性作用。
通常采用体内细胞遗传学试验，而且，当对潜在染色体丢失进行追加研究时要求进行体内微核试验。
（2）进行两项合适的体内试验，通常采用不同的组织，并有支持暴露的证据。
如果无充分的证据或机制信息以排除相关的潜在遗传毒性，通常要求进行两项体内试验，需要采用合适的终点指标和合适的组织（通常是两种不同组织），且应在体内获得充分的暴露。
终点指标充分合理并且证明有暴露的合适的体内试验的阴性结果，足以证明受试物不具有遗传毒性风险。
1.2依赖于S9的体外试验阳性结果的追加
当阳性结果仅见于S9代谢活化条件下，首先应确认是否是代谢活化的原因而非其他一些不同条件（如，与非代谢活化培养条件下的≥10%血清浓度相比，S9混合物中血清浓度低或无血清）。
因此追加策略的目的是确定体外结果与体内条件的相关性，通常采用肝脏体内试验（注释15）。
2.对体内微核试验阳性结果的追加
若体内微核升高，应对所有的毒理学资料进行评价，以确定是否是由于非遗传毒性作用所致或非遗传毒性作用是其中的一个作用因素。
如果怀疑存在干扰红细胞生成作用或生理学的非特异性因素（如体温偏低或过高），进行一项体内染色体畸变试验更为合适。
如果怀疑一个升高的结果，应进行研究以证明该升高是否是由于染色体丢失或染色体断
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