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significantdifference.Result:
PEGtreatmentshavedifferentinfluenceonthegerminationrateandthegrowthoftheseedlingsofScutellariabaicalensisGeorgifromdifferentregions.ClusteringresultsshowedNo.5isdrought-resistant,butNo.1;theactivityofCATinNo.1wassignificantincreaseafterstress.Conclusion:
Thecharacteristicdrought-resistantbetweendifferentregionscouldbedifferent.
Keywords:
ScutellariabaicalensisGeorgi，seed，droughtdress
黄芩ScutellariabaicalensisGeorgi为唇形科多年生草本植物。
以根入药，为常用中药，需要量较大[1]。
黄芩野生资源在我国各地都有分布，近年开始家种生产，河北、陕西、山东等地栽培较多，且多在旱地种植。
黄芩播种时由于缺水易发生出苗不齐的现象。
PEG6000是一种常用模拟干旱条件的化学试剂，Gergeley[2]用PEG诱导水份胁迫与对土壤控水的结果差不多，并认为110g的PEG4000培养液相当于土壤田间持水量为75％下的水份状况。
本研究组以PEG（6000）溶液模拟干旱胁迫条件，研究黄芩种子的萌发和幼苗生长对干旱胁迫的响应。
结果表明，20%PEG处理8hr以上可作为黄芩种子干旱模拟条件[3]。
本研究采用该模拟条件对不同来源黄芩种子的萌发状态、生长状况以及保护酶水平等指标进行测定，比较其抗旱特征，旨在为黄芩抗旱机理研究提供研究材料和研究数据，为抗旱黄芩品种的选育研究打下基础。
1．材料与方法
1.1材料
黄芩种子来源见表1，用0.1%HgCl2消毒5min后，清水冲洗三遍。
用20%的PEG6000处理种子8hr后，进行标准萌发试验，每天浇蒸馏水2ml[3]。
每个处理50粒种子，重复三次。
放置于光照培养箱中，培养温度为25℃，24hr光照，生长10天后取萌发的幼苗备用。
以未进行处理的种子作为对照，对萌发幼苗的形态进行观察，并测量其鲜重、各器官的长度等指标[3]。
计算：
相对初生根长度=PEG处理的初生根长度/对照
相对鲜重=PEG处理的鲜重/对照
根/子叶叶柄=初生根长度/子叶叶柄长度
表1黄芩种子来源
Table1SourcesofS.baicalensisseeds
来源编号
产地
1
陕西渭南
2
陕西陇县
3
北京延庆县
4
河北承德市
5
甘肃陇西
6
山东济南市
7
山东莒县
8
山东蒙阴县
1.2种子萌发率、萌发指数的测定[5,6]
每天记录种子的萌发状态。
计算：
萌发率（%）=萌发的种子数×100/供试种子数
萌发指数（GI）=∑（Gt/Dt）
Gt为不同萌发时间的萌发率；Dt为不同的萌发试验天数。
相对萌发率=PEG处理的萌发率/对照
相对萌发指数=PEG处理的萌发率/对照
1.3保护酶活性的测定
1.3.1蛋白质含量的测定
随机挑选10个刚露芽的种子，重复三次。
用1ml蛋白提取缓冲液（50mmol/L磷酸缓冲液，0.1mmol/LEDTA，0.1mmol/LTris-HCl）研磨后，过夜后12000g离心20min，取上清备用。
以上步骤均在4℃条件下完成。
利用紫外分光光度计测定提取物的OD260和OD280，按公式蛋白质含量（mg/ml）=1.55OD280-0.76OD260[6]。
1.2.2超氧化物歧化酶SOD活性的测定
SOD活性测定用氮蓝四唑（NBT）光还原法[7]。
测定反应体系含13mmol/l的Met、75μmol/l的NBT、10μmol/l的EDTA-Na2、2μmol/l的核黄素和50mmol/lpH7.0的磷酸缓冲液，25℃，4000lx的光照20min后测定560nm处的吸光值（A）。
用缓冲液代替酶液的处理作空白对照，以抑制NBT光化还原50%的酶液量为1个酶活性单位。
SOD活性=2（A560空白-A560处理）×稀释倍数/A560空白。
1.2.3过氧化氢酶CAT活性的测定
CAT活性测定用分光光度法[8]进行。
反应液中加入3ml50mmol/l磷酸缓冲液，1ml0.3%H2O2和0.1ml酶液，在240nm下测定其吸光度值。
以每分钟吸光度值的降低表示活性。
1.2.4过氧化物酶POD活性的测定
POD活性测定用愈伤木酚法[9]。
以愈伤木酚为反应底物，反应体系包括2.8mlpH6.8的磷酸缓冲液，1ml0.1%邻甲氧基苯酚，0.01ml酶液和0.20ml0.3%H2O2溶液（对照用无菌水处理），于60min时在470nm下测OD值。
以每分钟OD470变化0.01为1个酶活性单位。
1.2.5抗坏血酸过氧化物酶ApX-POD活性的测定
ApX-POD活性测定用分光光度法[10]进行。
反应液中加入50mmol/l磷酸缓冲液，0.3mmol/LAsA，0.06mmol/LH2O2和0.1ml酶液，在240nm下测定其吸光度值。
以每分钟吸光度值的降低表示活性。
2．结果与分析
2.1PEG干旱胁迫对不同来源黄芩种子萌发的影响
本研究收集的不同来源黄芩种子活力差异较大，其萌发率最高为70.67%，最低为4.67%；萌发指数最高为11.16，最低为1.98。
PEG处理后的黄芩种子，其萌发率显著均高于对照，但只有2号材料的萌发指数显著高于对照，其它材料均无显著变化。
相对萌发率最高的为5号材料，其它材料差异不大（表1，2）。
表2.PEG干旱胁迫对不同来源黄芩种子萌发率的影响
Table2.TheeffectofPEGdroughtstressonseedgerminationofdifferentregionsofS.baicalensis
萌发率（%）
来源
编号
处理
对照
相对萌发率
平均数
SE
平均数
SE
1
37.64*
0.44
23.33
2.91
1.61
2
73.33*
5.52
40.67
0.67
1.80
3
80.19*
0.19
47.67
11.87
1.68
4
89.49*
3.84
70.67
6.36
1.27
5
20.67*
2.33
4.67
2.67
4.43
6
79.73*
2.16
48.67
7.06
1.64
7
65.56*
6.05
41.33
6.57
1.59
8
73.61*
1.80
42.00
6.11
1.75
注：
*表示处理与对照之间的差异显著（p<0.05,t-test）
Note:
*denotesignificantdifferencesbetweendifferenttreatment（p<0.05,t-test）
表3.PEG干旱胁迫对不同来源黄芩种子萌发指数的影响
萌发指数
来源
编号
处理
对照
相对
萌发指数
平均数
SE
平均数
SE
1
4.63
0.11
3.52
0.63
1.32
2
7.83*
0.13
3.86
0.54
2.03
3
9.07
0.43
8.76
2.27
1.04
4
11.17
0.98
11.16
1.79
1.00
5
2.24
0.96
1.98
0.41
1.13
6
9.72
0.64
10.01
1.18
0.97
7
7.83
0.43
8.72
1.15
0.90
8
8.86
0.26
8.35
1.05
1.06
注：
*表示处理与对照之间的差异显著（p<0.05,t-test）
Note:
*denotesignificantdifferencesbetweendifferenttreatment（p<0.05,t-test）
2.2PEG干旱胁迫对不同来源黄芩幼苗生长的影响
除5号材料外，不同来源黄芩幼苗的初生根生长状况差异不大，且均无茎的生长。
PEG处理的种子所长成的幼苗，其初生根差异不大，但子叶叶柄和茎的生长存在差异，主要表现为1和5号材料的子叶叶柄显著长于其它材料，分别为11.72mm、11.01mm。
且1、3、5号材料均观察有茎的生长，其长度分别为13.25mm、7.73mm、9.11mm（表3）。
与对照相比，所有材料的子叶叶柄长度均高于对照，但只有材料1、5和6的初生根长度显著高于对照。
5号材料的相对初生根长度最高，为2.42；相对鲜重较高的为1、3、5号材料，分别为2.03、2.39、2.45；而根/子叶叶柄较低的为1和5号，分别为2.03和2.40。
表3.PEG干旱胁迫对不同来源黄芩幼苗生长的影响
Table3.TheeffectofPEGdroughtstressonseedlinggrowthofdifferentregionsofS.baicalensis
幼苗器官长
度/mm
来源
编号
处理
对照
相对初生根长度
相对鲜重
根/子叶叶柄
初生根
子叶
叶柄
茎
初生根
子叶
叶柄
茎
1
26.94a*
11.72a*
13.25a
19.64a
4.49a
-
1.37
2.03
2.30
2
26.99a
5.58b*
-
24.54a
3.91b
-
1.10
1.47
4.84
3
28.12a
5.58b*
7.73b
24.53a
3.33b
-
1.15
2.39
5.04
4
26.12a
4.91c*
-
23.00a
4.16a
-
1.14
1.43
5.32
5
26.44a*
11.01a*
9.11b
10.90b
4.43a
-
2.42
2.45
2.40
6
22.82b*
5.41b*
-
27.08a
4.05a
-
0.84
1.36
4.22
7
25.03a
5.27b*
-
26.71a
4.43a
-
0.94
1.39
4.75
8
27.51a
5.49b*
-
25.66a
4.53a
-
1.07
1.29
5.01
注，不同字母表示不同来源之间的差异显著（p<0.05,t-test），*表示不同处理之间的差异显著（p<0.05,t-test）
Note:
Lettersdenotesignificantdifferencesbetweendifferentregion（p<0.05,t-test），*denotesignificantdifferencesbetweendifferenttreatment（p<0.05,t-test）
2.3不同来源黄芩种子抗旱特征的综合评价
本研究选择可代表各来源黄芩种子抗旱性强弱的指标进行分析，以其相对值作为被分析的变量，由此构成聚类分析的原始数据矩阵。
利用SPSS13.0forWindows统计分析软件进行种子抗旱性的分级，聚类分析结果显示，其第2类的类中心有变化，第1、3类的类中心无变化（表4），且5号材料的抗旱性最强，而1号材料的抗旱性最弱（表5）。
表4K均数分类初始及最终类中心输出结果
Table4K-meansinitialandfinalclustercenters
输出结果
指数
初始类中心
最终类中心
1
2
3
1
2
3
相对初生根长度
1.37
1.07
2.42
1.37
1.04
2.42
相对鲜重
2.03
1.29
2.45
2.03
1.56
2.45
根/子叶叶柄
2.30
5.01
2.40
2.30
4.86
2.40
相对萌发率
1.61
1.75
4.43
1.61
1.62
4.43
相对萌发指数
1.32
1.06
1.13
1.32
1.17
1.13
表5K均数分类时分类成员输出结果
Table5K-meansclustermembership
来源编号
分类
Distance
1
1
0.000
2
2
0.888
3
2
0.872
4
2
0.621
5
3
0.000
6
2
0.729
7
2
0.350
8
2
0.347
2.3PEG干旱胁迫对不同来源黄芩种子保护酶水平的影响
不同来源黄芩种子保护酶水平差异较大，选择抗旱性差异较大的1和5号材料进行PEG处理，对其CAT、POD、AsA-POD和SOD活性进行分析，结果表明1号材料CAT活性显著提高，是对照的2.73倍（表4）。
表4PEG干旱胁迫对不同来源黄芩种子保护酶水平的影响
Table2EffectofPEGonActivitiesofProtectiveEnzymesinS.baicalensisSeedsfromdifferentregions
保护酶水平
来源
编号
蛋白质含量/mg·ml-1
CAT活性/Unit·mg-1protein·min-1
POD活性/Unit·mg-1protein·min-1
AsA-POD/μMol·mg-1protein·h-1
SOD活性/Unit·mg-1protein·min-1
处理
1
1.47
6.68*
0.86
15.25
2.40
5
1.57
7.33
0.56
22.90
2.84
对照
1
1.80
2.45
1.42
21.17
1.77
5
1.92
9.59
1.90
11.66
2.08
处理/对照
1
0.82
2.73
0.61
0.72
1.36
5
0.82
0.76
0.29
1.96
1.37
注，*表示处理与未处理间的差异显著（p<0.05,t-test）。
Note:
*denotesignificantdifferencesbetweentreatmentsandcontrol（p<0.05,t-test）.
3．讨论
由于大多数药用植物的种子多为自然采收，其萌发率很难保证一致性，而萌发率在种子抗旱指标中具有重要的地位，因此本实验采用复水法对黄芩种子进行处理，使评价结果较为全面。
评价结果表明，在供试的材料中采集自陕西渭南（1号）的黄芩种子的抗旱性最强，而采集自甘肃陇西（5号）的黄芩种子抗旱性最弱。
干旱是对植物组织的一种重要胁迫因子，它能干扰植物细胞中活性氧产生与清除之间的平衡，导致植物细胞受到氧化胁迫。
正常情况下，植物细胞中产生的活性氧与其清除系统保持平衡，而当环境胁迫长期作用于植株时，产生的活性氧超出了活性氧清除系统的能力时，就会引起活性氧累积产生氧化伤害[11]。
超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶（CAT）是植物体内的重要保护酶，在清除自由基中起重要作用[12]，通过对PEG模拟干旱处理种子中的保护酶水平进行分析，结果表明抗旱性较弱黄芩种子中的CAT活性变化较大，说明这种酶可能对干旱胁迫比较敏感，在干旱条件下被迅速大量诱导表达，来消除干旱胁迫所产生的活性氧对植物细胞的伤害。
而抗旱性教强的黄芩种子CAT活性变化较小，意味着干旱对植物细胞影响较小，这些材料能更好的适应同样的干旱条件，不需要大量合成CAT来清除植物细胞内的活性氧。
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