淋巴细胞转化试验MTT.docx

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淋巴细胞转化试验MTT

一、淋巴细胞转化试验（MTT）

（一）原理：

四甲基偶氯唑盐（MTT）可作为线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。

当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成紫兰色的甲臢，将结晶的甲臢溶解释放后，可根据所测的OD值反映活细胞的数量和活性，从而推知待测样品的水平。

（二）材料：

MTT、电子天平、PBS液、二甲基亚砜、无菌针头过滤器、细胞计数板、台盼兰、无菌操作台，CO2培养箱，酶标仪，－20℃冰箱。

用称取50mg的MTT，溶于10ml后，终浓度为5mg/ml，过滤除菌，无菌EP管分装，－20℃避光保存。

丝裂原：

PHA、ConA、PWM或其他丝裂原

（三）方法：

1、脾细胞制备：

（1）小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡3分钟，取出小鼠置于无菌纸上，左腹侧朝上；

（2）在小鼠左腹侧中部剪开小口，撕开皮肤，暴露腹壁，可见红色长条状脾脏；

（3）在脾脏下侧提起腹膜，剪开后上翻，暴露脾脏，用镊子提起脾脏，眼科剪分离脾脏下面的结缔组织，取出脾脏。

放入盛有5mlHanks液的培养皿中；

（4）制备脾细胞悬液

钢网研磨法：

无菌取脾，将脾脏放置不锈钢网（100或200目）上，置于盛有适量无菌Hanks液的小平皿中，用镊子轻轻将脾撕碎，用注射器针芯轻轻研压脾脏，制成单细胞悬液；经200目筛网过滤，用Hanks液洗3次，每次离心1000r/min5-10min，（或1500rpm，4-7min）。

取出100ul，稀释后在细胞计数板上进行细胞计数，并用台盼兰染色（0.1ml0.6%台盼兰+0.1ml1.7%Nacl液+0.2ml细胞悬液，混匀），计算细胞存活率（应在95％以上）。

调整细胞浓度为5⨯105/ml。

梳刮法：

脾脏可用镊子轻轻梳刮，避免将脾脏弄成碎片，将细胞悬液吸入离心管中，自然沉降5分钟，将悬液移至另一离心管中，弃去较大的组织块，离心沉淀细胞；

酶消化法：

将脾脏用镊子夹碎，加入400u/ml胶原酶（III型）5ml/只脾脏，37度消化20分钟，用尼龙网过滤，得到单细胞悬液。

注：

一般6～8周龄小鼠，根据品系不同，可得5～20×107细胞/只小鼠；

手术器械灭菌：

术前高压灭菌外，也可将手术器械泡在95%酒精的小容器中，使用前取出器械，在酒精灯上烧灼去除酒精，即可保证无菌，此法较为简便。

2、淋巴细胞增殖反应：

将5⨯105/ml脾细胞悬液加入到96孔培养板中，200ul/孔，每一份脾细胞悬液分装3n个孔，3（n-1）孔加ConA（5ug/mL），另3个孔不加ConA作为对照。

置5％CO2，37℃培养48-72h，在培养结束前4-6小时，于培养板各孔内加入5mg/ml MTT液，10ul/孔。

37℃培养4-6小时。

4.1000g离心10分钟弃上清，各孔内加入150μlDMSO，溶解10min，30分钟内（或加2%SDS 100ul/孔，过夜。

，或干燥后，各孔内加入0.01M盐酸—异丙醇100ul）用酶标测定仪测OD值，测定波长570nm。

 实验结果

将实验组和对照组三个复孔的OD值平均。

转化值=实验组的平均OD值-对照组的平均OD值。

注意事项

（1）由于本实验需要培养3天，才能观察结果。

因此，在操作时应注意无菌操作，避免细菌污染，导致实验的失败。

（2）细胞操作要轻柔、迅速，以免细胞损伤影响实验结果。

二、LAK/TIL细胞的制备与活性测定：

淋巴因子激活的细胞毒性细胞（lymphokineactivatedkiller，LAK）和肿瘤浸润性淋巴细胞（tumorinfiltratinglymphocyte，TIL）在机体的免疫防御中起着十分重要的作用，特别是在肿瘤免疫过继疗法中具有重要的应用前景，其制备及活性的检测对于评价机体的免疫状态具有重要的意义。

以下主要介绍LAK/TIL制备的常规方法。

（一）主要试剂材料

1.试剂①IL-2；

RPMI-1640；

Ⅰ、Ⅳ型胶原酶，DNA酶；④四甲基偶氮盐；⑤酸化异丙醇：

含0.04mo1/LHC1的异丙醇；⑥96孔细胞培养板。

2.肿瘤细胞系Raji细胞、Daudi细胞为B细胞性白血病细胞株；Molt-4为T细胞性白血病细胞，对LAK细胞敏感，而对NK细胞毒作用不敏感；K562为红白血病细胞株，对NK细胞毒作用敏感。

所有细胞株均培养在含10%~20%NCS的RPMI-1640完全培养液中，取对数生长期细胞经不完全培养液洗涤，台盼蓝染色计数，以含20%NCS的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×106/ml备用。

（二）外周血单个核细胞（PBMC）的制备及其LAK细胞的诱导

（1）肝素抗凝健康人静脉血通过Ficoll-泛影葡胺密度梯度离心法分离PBMC，用含20%NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml。

（2）将上述细胞加人24孔培养板孔中，同时加人60ugPHA，rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2条件下培养，2~3d换液一次。

吸弃1/2上清，加入含100U/ml的重组人IIr220%NCS-RPMI-1640培养液，继续培养3d，收集细胞，即为LAK。

（三）脾细胞的制备及其LAK细胞的体外诱导

将通过灌注去除红细胞后的正常人外伤摘除的脾脏，按常规方法制备成单个脾细胞悬液，经离心洗涤后，用含20%NCS的RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度至1×106/ml，加人rhIL-2，终浓度为500U/ml，将细胞置37℃，5%CO2条件下培养，2~3d换液一次。

（四）TIL细胞的分离制备及其诱导

（1）无菌切取肿瘤组织，置于含抗生素的RPMI-1640培养液中。

（2）将瘤体机械法剪碎，用RPMI-1640调整体积为10~20m1，同时加人0.05%的Ⅰ、Ⅳ型胶原酶、0.001%的透明质酸酶和DNA酶，室温搅拌4~6h。

（3）依次用80目和200目不锈钢网过滤。

（4）经过滤后的细胞悬液以无血清的RPMI-1640洗2次，1500r/min离心5~l0min。

（5）用含5%NCS的RPMI-1640完全培养液重悬细胞，将5ml比重为1.077的100%淋巴细胞分层液加人试管底层，其上缓慢加人75%的淋巴细胞分层液（用RPMI-1640配制），然后缓慢加人上述肿瘤细胞悬液3~5ml。

（6）经1500~1800r/min离心20min后，分别收集75%和100%淋巴细胞分层液界面层的TIL细胞和其上层的瘤细胞。

（7）用RPMI-1640洗涤2次，每次1500r/min离心5~10min。

肿瘤细胞加人冻存液后液氮冻存备用。

TIL则用含20%NCS的RPMI-1640调整细胞浓度为0.5×106/ml。

（8）将上述细胞悬液接种于24孔培养板（1m1/孔），同时分别加人IL-21000U/或IL-2和CD3McAblug/m1，置37℃，5%CO2温箱培养3~4周，其间3~5d更换新鲜配制的含IL-2的RPMI-1640完全培养液。

（五）LAK细胞和TIL活性的测定

LAK细胞和TIL活性的测定基本同NK活性测定方法。

但所用靶细胞为对NK不敏感的肿瘤细胞，如Rajf，Dandi或自体肿瘤细胞。

常采用同位素法如51Cr释放试验、发光免疫测定法及MTT，比色法等。

本节介绍MTT比色法。

（1）用含IL-2的20%NCS-RPMI-1640调整LAK细胞或TIL浓度至1.5×106/ml。

（2）LAK细胞或TIL与不同的白血病细胞株按效靶为1：

1~20的比例分别取100ul接种于96孔平底培养板内共同培养，每个试验做三个复孔。

设不同浓度效应细胞200ul/孔单独培养，测定效应细胞的吸光度。

同时将不同的白血病细胞株分别用20%NCS-RPMI-1640培养液调整至3×104一1×105/ml，取100ul细胞悬液和100ul培养液接种于96孔培养板中，每个浓度接种3复孔，以测定不同浓度肿瘤细胞的吸光度。

（3）将上述接种好的细胞培养板置37℃，CO2温箱孵育20h，其余步骤同IL-2生物活性测定。

（4）细胞毒性百分率（%）按下列公式计算

ODE+T=效应细胞孔OD值+靶细胞孔OD值

ODE=相应浓度单独效应细胞的OD值

ODT=相应浓度单独靶细胞的OD

三、小鼠造血干细胞/祖细胞免疫磁性分离操作步骤：

1）取小鼠骨髓用BD染色液制成约2×108单细胞悬液

2）阻断：

加入MsFcBlockTM置冰上15min,0.25mg/106细胞

3）加入LineagePanel中biotin-mAb,每种2ml/106细胞,冰上15min

4）IMagbuffer洗涤,加Streptavidin磁珠,5ml/106细胞,6-12℃30min

5）放入磁场中8min,将上清小心吸出、收集

6）试管移出磁场,加buffer重悬阳性片断,反复吹吸后放入磁场8min

7）小心吸出上清，一并收集

8）重复上两步操作

   收集的上清中即为通过阴性分离法得到的造血干/祖细胞

四、IL-2生物学活性检测（MTT）

（一）原理

白细胞介素-2（IL-2）是由活化的辅助性T细胞分泌的一种细胞增殖因子，具有促T细胞增殖和维持T细胞体外长期生长的作用。

CTLL-2为IL-2依赖细胞株可用作IL-2生物学活性定量检测。

本实验采用MTT分析法，通过测定CTLL-2细胞的增殖量，确定IL-2生物学活性单位。

检测IL-2的生物学活性，可以间接了解辅助性T细胞的功能。

（二）材料

（1）1）10%FCS-RPMI-1640培养液，含2mmol/L谷氨酰胺、25mmol/LHEPES、10U/ml青霉素、100ug/ml链霉素。

（2）MTT（4，5-dimethythiazoyl-zyl2,5-diphenylterrajoliumbromiole）用PBSA缓冲液配制成1mg/ml浓度工作液，4℃避光保存。

（3）IL-2标准品。

（4）PHA（200ug/ml）。

（三）方法

（1）人外周血T细胞分泌IL-2的诱生：

①人PBMC分离：

采用常规淋巴细胞分层液浓度梯度离心法分离PBMC，用10%FCS-RPMI-1640培养液调整细胞浓度为1×105/ml

加样：

接种细胞悬液于24孔培养板，每孔0.5lml，每孔再加PHA0.5ml，37度，5%CO2孵育48小时。

③回收上清：

吸出细胞培养上清，12000r/min离心15分钟，收集上清，-20度冻存。

（2）IL-2生物活性测定

①CTLL-2细胞制备：

取传代培养24～48小时对数生长期的CTLL-2细胞，用培养液离心洗涤2次，每次1000r/min离心5分钟，再用10%FCS-RPMI-1640培养液调制细胞浓度为1×105/ml。

②加样：

将细胞接种于96孔培养板，每孔0.1ml。

同时将待测样品和标准品做倍比稀释，每孔加入0.1ml，每个稀释浓度均设3复孔。

另设培养液对照孔（100ul细胞+100ul培养液）。

37℃，5%CO2孵育40小时。

③MTT掺入：

轻轻吸取上清液100ul，加MTT（1mg/ml）100ul，37度，5%CO2孵育2小时。

④测定：

离心培养板，2000r/min，5分钟，吸弃上清液，每孔加100ulDMSO，作用30分钟，用酶标测定仪于波长570nm测吸光值（A）。

⑤计算：

用标准品浓度和对应的净A570nm值（实验孔-阴性对照孔的A570nm值）绘制标准曲线。

根据标准曲线求出待测样品IL-2水平。

（四）关键点

（1）CTLL-2细胞存活率应大于95%。

（2）因标本中含IL-4等，可影响IL-2的测定，最好采用抗IL-4mAb吸附剂除去IL-4。

五、IL-8生物学活性检测

（一）原理

IL-8对中性粒细胞具有激活和趋化作用，通过检测中性粒细胞的迁移距离可以确定IL-8的生物学活性，即对中性粒细胞的趋化活性。

（二）材料

（1）6%右旋糖酐生理盐水溶液。

（2）淋巴细胞分层液比重为1.077+（-）0.001。

（3）2%琼脂糖：

称取2g琼脂糖，加入到100ml蒸馏水中，煮沸溶解。

（4）0.1%白明胶Hank’s液。

（5）DMEM培养液（2×浓缩），内含20%FCS和0.75mg/mlNa2CO3溶液。

（6）甲醇溶液、Wright-Giemsa染液。

（7）洁净载玻片。

（8）打孔器，直径为3mm。

（三）方法

（1）IL-8的诱生

1常规分离PBMC，洗涤后，调细胞浓度为5×106/ml。

2将细胞接种于24孔细胞培养板，每孔0.5ml。

3加诱生剂LPS（20ug/ml），每孔0.5ml，37度，5%CO2孵育48h。

4离心收集细胞培养上清液，用HCl溶液调为酸性（PH4.0），经SephadxG-75柱分离，收集活性组分即为待测的IL-8粗品。

（2）IL-8的生物活性检测

1琼脂板的制备；取溶化后50度左右保温的2%琼脂糖与等体积50度水浴预温的DMEM培养液（2×浓缩），混合，取3ml加到洁净的载玻片上，铺成薄层，室温凝固后，放4度，进一步凝固30～60分钟，红打孔器打孔。

2中性粒细胞制备：

常规分离人外周血中性粒细胞。

3加样：

取10ul中性粒细胞悬液加入琼脂板各组中心孔，分别取10ul待检样品及阳性对照品加入样品孔，取10ulDMEM培养液加入对照孔；将玻片置于湿盒内，37度温育2小时。

4染色：

用甲醇溶液固定30分钟，用瑞氏染液染片并干燥。

5检测：

显微镜下分别测量细胞从中心孔向样品孔游走的距离（趋化游走距离）及向阳性对照孔的游走距离（自发游走距离），趋化活性以趋化指数表示。

趋化指数=趋化游走距离/自发游走距离

（四）关键点为确认待检样品中IL-8的特异性趋化效应，最好同时比较抗IL-8抗体与待测样品作用后的趋化结果

六、调节性T细胞（Treg）及其流式检测方法

Treg细胞概述

高效免疫抑制剂的发现及其联合应用使临床器官移植的急性排斥反应大大降低，移植物的存活时间明显延长；器官移植成为挽救终末期器官功能衰竭患者生命的重要有效途径。

但是免疫抑制剂具有明显的毒副作用（如对重要脏器的损伤、降低抗肿瘤及抗感染免疫力等）及对治疗慢性排斥反应效果较差等问题，均限制了免疫抑制剂的长期应用。

因此，相关生命科学工作者尝试通过诱导移植免疫耐受途径来避免免疫抑制剂的长期应用及克服移植免疫排斥反应。

在上个世纪九十年代中期，由Sakaguchi等首先证实了天然CD4CD25调节性T细胞（regulatoryTcell，Treg）为一类具有免疫抑制作用的T细胞，约占外周CD4+T细胞的5～10%。

该类细胞以“主动”的方式参与免疫应答／免疫耐受的调控，不仅参与自身免疫耐受调节，而且在肿瘤免疫和移植免疫中也具有重要的作用。

2、Treg细胞的来源

研究证实，天然的CD4+CD25+Treg细胞来源于胸腺，小鼠出生后第3天切除胸腺，外周缺乏CD4+CD25+Treg细胞，产生抗自身抗体并出现自身免疫性胃炎等自身免疫性疾病。

而在第0天和第7天切除胸腺，并不表现自身免疫性疾病。

这说明出生3d内是胸腺产生CD4+CD25+Treg细胞的关键时期，这时切除胸腺引起自身反应性CD4+T细胞的过度增殖。

但是，出生第0天胸腺产生的自身反应性CD4+T细胞不足，出生第7天胸腺已经产生了足够的CD4+CD25+Treg细胞，所以这时切除胸腺，小鼠不出现自身免疫性疾病。

Papiernik等证实，CD4+CD25+Treg细胞产生于胸腺，然后迁移到外周发挥作用，CD4+CD25胸腺细胞与外周的CD4+CD25+Treg细胞一样，表现对经由TCR的抗原刺激呈低反应性，并且显示抑制其他T细胞增殖的能力。

CD4+CD25+Treg细胞的产生需要TCR与胸腺皮质上皮细胞的MHCII类分子间的高亲和力作用，MHCII类分子缺陷的小鼠缺乏CD4+CD25+Treg细胞。

CD4+CD25+T细胞除了在胸腺产生以外，还可以在未成熟的树突状细胞、IL-10、IFN-a、TGF-beta或者低剂量抗原诱导下由外周CD4+CD25-细胞转变而来，该类细胞称为诱导的CD4+CD25+Treg细胞。

3、Treg细胞的常用的分子标记

①CD25：

Treg细胞调节机体免疫系统平衡，增加免疫耐受。

研究表明，多种T细胞分子抗原参与Treg细胞的特异性功能效应。

传统鉴定Treg细胞主要是通过CD4和CD25来标记。

但随着研究的进一步深入，发觉只通过CD4+CD25+双阳性来定义的Treg细胞并不完全准确②FOXP3：

FOX（forkheadbox）是脊椎动物叉头样转录因子的总称，是一个具有多种功能的转录因子大家族，通常和细胞生长发育的调控有关。

FOX家族成员都有一个叉头样结构域，能与DNA结合。

FOXP3是叉头样转录因子家族中的成员，2001年由Brunkow等首次报道。

研究发现，它的表达及功能与调节性T细胞（regulatoryTcells，TR细胞）密切相关。

如果FOXP3基因发生突变，将影响TR细胞的发育成熟，导致IPEX综合征（immunedysregulation，polyendocrinop-athy，enteropathy，Xlinkedsyndrome）。

 FOXP3主要表达于胸腺、脾脏和淋巴结等淋巴器官和组织。

在小鼠特异性表达于CD4+CD25+T细胞，而不表达于CD8+T细胞。

在人类FOXP3不仅可表达于CD4+CD25+T细胞，还可表达于CD8+CD28-T细胞。

但在CD4+T细胞中的表达明显高于CD8+T细胞。

目前，Foxp3（forkheadboxP3，Scurfin）是目前公认的Treg细胞的最敏感的标志。

③CD127：

最近发现通过表达CD4，CD25和传导信号FoxP3来定义调节性T细胞时，在一类特殊的细胞群体时会出现问题。

我们发现IL-7受体（CD127）在外周血CD4+T的一个亚群中会下调表达。

我们证实这些细胞FoxP3阳性，且这群细胞包括那些CD25弱阳性或阴性群体。

联合使用CD4，CD25和CD127可得到高纯度的调节性T细胞，比以前的通过其他标志物来区分方法显著提高。

这些细胞在功能抑制实验中可发挥高度抑制功能。

实际上，通过CD4和CD127表达来区分的细胞数量（包括CD25+CD4+和CD25-CD4+）三倍于通过CD4+CD25hi区分的调节性T细胞亚群。

最后，我们使用CD127定量检测I型糖尿病病人调节性T细胞，发现CD127可作为人调节性T细胞的标志物。

4、FOXP3流式检测方法

  美国eBioscience公司是最早拥有FOXP3流式检测抗体的公司之一，公司通过不断改进和优化，建立了一套完美的针对FOXP3流式检测特殊的试剂和方案。

（1）    实验材料

实验设备

1）      流式上样管

2）      混匀振荡器

3）      离心机

4）      移液器、Tips

5）      流式细胞仪

所需试剂

1）      细胞表面染色的荧光标记的单抗试剂（CD4、CD25或CD8等）

2）      FOXP3荧光标记抗体

3）      溶血素：

（eBioscience目录号00-4333）用于裂解红细胞

淋巴细胞分离液：

若样品为人的全血，建议先用分离液分离出单个核细胞后再做后续检测

5）      固定剂和破膜剂：

（eBioscienceFOXP3检测专用试剂，目录号为00-5521或00-5523；在FOXP3染色前，将其中的Fixation/Perme-abilizationConcentrate和Fixation/PermeabilizationDiluent以1：

3的比例混合，配制好的溶液保存时间不要超过一天）

6）      其他试剂：

FlowCytometryStainingBuffer（00-4222）或PBS，Permeabil-izationBuffer（Cat.No00-8333）等

（2）    实验操作步骤

  注：

对于不同的FOXP3克隆号抗体，在操作上可能存在着一些细微的差别。

具体实验时，请参考相应的抗体说明书上的操作步骤。

此操作以人Foxp3（clonePCH101,cat.XX-4776）.为例。

1）      在每个流式上样管中加入100ul准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个。

2）      按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原（如CD4、CD8、CD25等）。

3）      用预冷的FlowCytometryStainingBuffer或预冷的PBS洗涤细胞。

4）      旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization），并再次旋涡混匀。

5）      避光4℃孵育30-60分钟。

6）      加入2mlPermeabilizationBuffer（Cat.No00-8333）工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

7）      重复第5步操作洗涤细胞。

8）      [可选]加入稀释好的2%（2ul）的正常大鼠血清（用PermeabilizationBuffer工作液进行稀释）100ul，在避光4℃孵育15分钟

9）      封闭液无需洗去，直接加入稀释好的荧光标记FOXP3抗体（用PermeabilizationBuffer工作液进行稀释）20ul，避光4℃孵育至少30分钟。

建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。

10）   加入2mlPermeabilizationBuffer（Cat.No00-8333）工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。

11）   重复上一步洗涤细胞。

12）   用适量体积的FlowCytometryStainingBuffer重悬细胞，并上机检测并分析。

注：

由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。