脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用.docx

脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用.docx

《脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用.docx（5页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用

脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用

作者：

刘明义，王胜春，赵慧萍

　　【摘要】目的探讨脂多糖诱导小鼠肝损伤介质水平变化及五灵胶囊的作用。

方法小鼠尾静脉注射LPS/kg，酶法检测3，6，12和24h小鼠血清ALT、AST、ALP、TRIG，化学法测定肝组织内MDA、NOS水平，免疫组化检测肝组织内TNF-α，CD14，iNOS，eNOS的阳性表达率。

结果与正常组比较,小鼠iv注射LPS后3h血清ALT，AST水平明显升高并持续至12h，24h下降仍显著高于正常组，ALP水平明显持续下降。

在12hMDA含量显著升高，24h下降但明显高于正常组，而甘油三酯水平各时间点明显升高，TNF-α，CD14，iNOS，eNOS阳性表达率上调。

五灵胶囊能明显降低ALT，AST水平和MDA含量，对ALP和TRIG水平无作用，抑制肝组织内TNF-α，CD14，iNOS，eNOS阳性表达率。

结论MDA，TNF-α，CD14，iNOS，eNOS参与了LPS诱导肝损伤，五灵胶囊抑制LPS诱导肝损伤的作用机制与抑制活性递质生成有关。

　　【关键词】肝损伤一氧化氮合酶活性介质脂多糖

　　Abstract：

ObjectiveToexplorethechangeofmediatorlevelsinhepaticinjuredmiceinducedbyLipoplysaccharide（LPS）andeffectsofWulingwasgiventomicebyinjectionwithadoseofLPS/kgviathetailvein,3,6,12,24hourslater,thelevelsofALT,AST,ALPinserumweredetectedbyenzymemethodandthecontentsofMDA,NOSinhepatictissueofmiceweredeterminedbychemistry,immunohistochemistrymethodwasemployedtodeterminetheexpressionofTNF-α,CD14,iNOSandeNOSinhepatictissue.Results3hoursafterLPSwasgiventomice,comparedwithnormalgroup,thelevelsofALTandASTwereobviouslyelevatedandpersistedfor12hours,andwhichwerereducedin24hoursbutstillhighobviouslyascomparedwithnormalgroup.ThelevelofALPwereevidentlydecreased,andthecontentofMDAwassignificantlyincreasedat6hourandloweredat24hoursbutstillhigherthannormal.TheleveloftriglycerideswasincreasedandtheexpressionofTNF-α,CD14,iNOS,eNOSinliverinjurytissuewasmarkedlymediatorsasMDA,TNF-α,CD14,iNOS,eNOSparticipatedinliverinjuryinducedbyLPS,theprotectivemechanismWulingcapsuleliverinjurymightberelatedwithinhibitingthereleaseofmediators.

　　Keywords：

Liverinjury;Nitricoxidesynthase;Activitymediators;Lipoplysaccharid

　　内毒素血症与肝损害可互为因果，从而对肝病的发生发展及预后产生重要的影响［1］。

脂多糖致肝损伤机制诸多学者认为：

主要是通过激活枯否细胞释放细胞因子而介导肝细胞损害，LPS促进枯否细胞合成释放TNF-α,进而促进NO生成加重肝损伤［2］。

早期研究表明五灵胶囊对LPS诱导枯否细胞释放细胞因子有明显抑制作用［3］，五灵胶囊具有疏肝健脾，扶正活血的作用，对内毒素血症肝损伤及介质TNF-α，CD14，iNOS，eNOS表达有无影响还未经证实，对此进行了观察，以便为临床用药提供依据。

　　1材料

　　动物：

昆明种小鼠，雄性，体质量g，中国人民解放军第四军医大学动物中心提供，动物合格证号：

SCK（军）2002-05；丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酯酶，甘油三酯,胆固醇（Chol）试剂盒；丙二醛,一氧化氮合酶试剂盒；Rabbitanti-CD14，TNF-α，NOSⅡ，NOSⅢ一抗；S-P超敏试剂盒；脂多糖；五灵胶囊，称取五灵胶囊2g，蒸馏水加热溶解至10ml为经口给药供试液。

　　2方法

　　LPS诱导小鼠肝损伤血清酶实验取昆明小鼠96只，随机分成3组：

正常组、LPS组、五灵胶囊组，每组每时间点8只。

正常组和LPS组分别ig蒸馏水10ml/kg，五灵胶囊组ig五灵胶囊g/kg，各组小鼠ig给药1次/d，连续给药5次，小鼠禁食自饮水，末次给药2h后正常组各时间点小鼠尾静脉注射（iv）生理盐水2ml/kg，其余2组各时间点小鼠ivLPSmg/kg，iv后分别于3，6，12，24h眼眶取血，放置30min，离心，分离血清，酶法测定TRIG，ALT，AST，ALP。

　　肝组织内MDA、TRIG、NOS测定和免疫组化实验迅速取上述实验小鼠肝脏剔去胆囊，用冰冷生理盐水洗去血渍，滤纸吸干水分，除肝大叶外的肝组织制成10%肝匀浆，10000r/min离心，取上清按试剂盒说明书测定MDA、TRIG、NOS：

肝大叶用10%甲醛磷酸缓冲液固定48h，石蜡包埋、切片，脱蜡至水洗,分别与抗CD14、抗TNF-α、抗iNOS、抗eNOS进行孵育，按试剂盒操作说明进行免疫组化反应，用二氨基联苯胺-mlH2O2/L系统显色10min。

苏木素衬染、脱水透明后，中性树胶封片。

阴性对照片用PBS替代一抗。

结果评定：

标本无明确阳性反应者为阴性，在40倍镜下以Miaspro图象分析系统程序扫描染色阳性细胞,每只小鼠肝组织扫描5个视野计数阳性细胞，结果以阳性细胞率表示。

　　统计学处理采用版统计软件，所测数据以表示，采用单因素方差分析。

　　3结果

　　LPS诱导小鼠肝损伤不同时间血清酶的变化及五灵胶囊的作用血清酶学测试结果显示，小鼠ivLPS后3h血清ALT值上升最高，随着时间的延长其值逐渐下降，在24hALT值有所降低但仍明显高于正常组，AST水平3h升高，12h达最高，24h下降仍明显高于正常组；ALP3h明显下降，随着时间的延长其值下降更低。

与LPS组比较，五灵胶囊组3h血清ALT和AST值高于LPS组，6h与LPS组一致，12h明显低于LPS组，24h继续下降，五灵胶囊对LPS导致小鼠肝内ALP下降无作用。

见表1。

表1肝损伤小鼠不同时间血清酶的变化及五灵胶囊的作用

　　对LPS诱导肝内MDA，TRIG，NOS含量影响小鼠ivLPS后3h，与正常组比较，肝内MDA含量升高，12h显著升高并达到高峰，24h下降但明显高于正常组（P　4讨论

　　以往研究显示LPS致肝损伤机制主要是通过激活KC释放TNF-α，IL-1，IL-8，PAF等细胞因子和介质诱导肝细胞损害，同时也引起肝细胞各种代谢功能改变。

有研究发现体内注射LPS后肝细胞蛋白合成、糖代谢均受影响，最终可导致动物死亡。

本试验显示小鼠ivLPS后3h，ALT和AST水平明显升高并持续至12，24h下降但仍显著高于正常，ALP值则与前二者相反而明显地降低，随着时间的推移而逐渐降低，肝细胞损伤严重ALP值就愈低。

小鼠ivLPS后3h肝内MDA，NOS和TRIG值升高并不显著，6、12h3指标含量明显增加，24hMDA和TRIG值仍高于正常组，NOS下降至正常。

小鼠ivLPS3h血清酶ALT与AST明显升高，表明肝细胞损伤开始，肝内MDA、NOS和TRIG并未急剧升高，提示在3h内反应肝损伤血清酶水平的上升与三介质无关；在6，12，24h肝内MDA、NOS与TRIG值明显增加，血清ALT与AST水平也显著升高，肝内脂质代谢紊乱，提示在此时三者参与肝损伤。

卞建明等［4］发现TNF-α对肝细胞DNA的代谢呈双相调节，低浓度TNF-α有刺激DNA合成的作用，而高浓度的TNF不但使DNA合成受阻，还造成肝细胞损伤，TNF-α可通过抑制线粒体呼吸链复合物而使肝细胞能量代谢障碍［5］。

CD14是KC表面存在的受体，在LPB存在下CD14与LPS结合并迅速与细胞膜上其他具有信号转导能力的LPS相关受体如TLR2，β2整合素、L-selectin等结合形成复合物，将LPS转递给这些信号转导分子介导KC激活分泌炎性细胞因子。

诱导型NO合酶在生理情况下表达微量，只有在LPS和某些因子诱导下肝实质和非实质细胞才大量生成，从而产生持久的生理效应［6］。

本实验显示组织中TNF-α，CD14，iNOS，eNOS阳性表达率在3～24h持续高表达，与肝功酶水平波动一致，肝组织iNOS、eNOS阳性表达率与肝内总NOS的结果趋向一致。

提示这些因子与介质参与了肝损伤过程。

五灵胶囊对3h肝功酶酶水平无作用，至6h逐渐影响LPS所致小鼠肝损伤，各肝功酶酶水平下降，至12h产生明显的抑制作用，提示五灵胶囊并非直接作用血液内肝功酶而使酶水平下降，而是作用于LPS损伤肝细胞的某些环节而降低ALT和AST水平。

ALP来自细胞器功能酶，五灵胶囊不能阻止ALP下降提示其对LPS所致细胞器损伤无作用。

五灵胶囊在12，24h明显降低MDA和NOS含量，TNF-α、CD14、iNOS、eNOS阳性表达率下降，同时AST、ALT酶水平也相应下降，提示五灵胶囊抑制LPS所致肝损伤与降低炎性因子和介质有关。

实验发现小鼠ivLPS后甘油三酯则急剧上升，TRIG升高可能是LPS导致清道夫受体下调，干扰血清脂蛋白在肝内修饰，甘油三酯在肝内代谢的改变导致血清中TRIG升高，另一种可能是LPS引起胰岛素抵抗造成脂质紊乱，五灵胶囊不能抑制LPS诱导小鼠体内TRIG升高，其原因有待进一步研究。