荧光测定黄酮.docx
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荧光测定黄酮
基于荧光光谱法对银杏黄酮糖苷的检测研究1
温宗壮
中国矿业大学化工学院生物工程11-2
摘要：
银杏黄酮糖苷因具有多种生物活性而被制药、食品、日用品等诸多领域广
泛应用。
针对目前银杏黄酮糖苷检测操作繁琐、成本高、耗时长的不足，建立了一种高精确性、低成本的快速测定方法。
根据黄酮类化合物能与ai3+反应形成荧
光螯合物的原理，以芦丁为标样探索测试条件，结果表明在激发波长入ex=4OOnm发射波长入em=520nm,pH为3.6的Al（NG）3-（HAc-NaAC反应体系中反应1500s，螯合物荧光强度趋于稳定且达到最大值。
求得芦丁浓度与荧光值的线性回归方程为y=29.92x+36.49（氏=0.986），线性范围为1.8X10-6〜3.2X10-5
mol/L。
用这种方法检测了银杏悬浮培养细胞中黄酮糖苷的含量，并进行加标回收实验，平均回收率为101.3%。
该方法灵敏度高，重现性好，操作简单，具有良好的应用前景。
关键词：
荧光光谱法银杏黄酮糖苷
引言
银杏黄酮具有抗菌、抗氧化和抗肿瘤等诸多作用，是生物制药、保健食品、功能性产品、化妆品和动物饲料添加剂等诸多行业产品开发的主要原料⑴。
紫外
可见分光光度法（ultravioletandvisiblespectrophotometry,UV）、高效液相色谱法
（highperformaneeliquidchromatography,HPLC）等方法是常用于检测植物中黄酮类化合物的手段。
其中UV法是最传统、应用最广泛的方法。
Zhu等利用紫外可见分光光度法对5种提取马齿苋黄酮方法的结果进行了检测⑵。
Wang等也在刺五加上用同样的方法做过类似的研究［3］。
但是该种方法用于测定植物中未经纯化的黄酮粗提物，结果会很大程度上受到杂质的干扰，这已经成为不争的事实。
其原因在于许多提取物中常见的杂质如咖啡酸和鞣质也具有邻苯二羟基结构，也
能参与Al3+的显色反应，使得测定结果会比实际值偏高。
HPLC法测定结果相对
准确，但设备昂贵、仪器维护成本高、使用费时且测定各成分时需要标准品对照，
使用成本也高，实力一般的科研机构难以接受，通常为了得到更为精确的组分信息，经常与质谱（massspectrum,MS）、核磁共振（nuclearmagneticresonance,NMR）等手段连用，进行定性定量检测。
Qing等利用HPLC-MS结合13CNMR
法从月季中鉴定了4个黄酮糖苷⑷。
Anja[5]、Zhao⑹、Chang[7]等都从不同的生物样本中分离鉴定了多种黄酮类化合物。
毛细管电泳法在分析植物次生代谢物方面也有许多报道。
在检测银杏黄酮组分中也已经有了应用。
Zhang等用毛细管电
泳法检测了菊花黄酮，建立了浓度与电流响应的线性关系⑹oChi等利用毛细管
区带电泳分离检测了中国凉茶中几种黄酮物质，这种方法能高效分离、省时、所
需样品少、重现性好⑶。
但其具有HPLC法一样的缺点。
此外气相色谱法在黄酮类化合物的分析中应用很少，这主要是由于黄酮类化合物不耐受高温，检测前需
利用衍生化试剂将其衍生化，增加了实验成本，操作复杂，不被广泛采用。
根据黄酮类化合物能与Al3+反应形成荧光螯合物的原理，本文建立了以芦丁为标品的银杏黄酮糖苷荧光光谱法（Fluoro-spectrophotometrymethodFSM）的检测手段。
Serbia等曾研究了荧光分光光度法对人血清桑色素的检测，以液相色谱法的检测结果为对照，表明两种方法的相对标准误差在可接受范围内，荧光分
光光度法是可靠的[10]o本试验中以银杏悬浮培养细胞为样品提取黄酮糖苷并测定其含量，为植物药的开发利用提供了有力保障。
1实验部分
1.1试验材料与试剂
银杏细胞为本实验室培养所得，烘干并碾成粉末，贮存于干燥器中暗处保存备用。
氢氧化钠、硝酸铝、亚硝酸钠、无水乙醇、芦丁均为分析纯及色谱级甲醇产自国药集团化学试剂有限公司。
槲皮素、山萘素和异鼠李素标准品（纯度》98%购于成都曼斯特生物科技有限公司，配制成0.05mg/mL备用。
去离子水。
1.2仪器设备
荧光分光光度计为日本Hitachi公司生产的FL-2700型号；高效液相色谱仪为戴安中国有限公司生产的DionexP680型，反相08柱250M.6mm。
1.3标样及样品的制备
精确称取芦丁标样0.01g,色谱级甲醇溶解，定容至100mL,得到0.1mg/mL的标准溶液。
取标准溶液1、2、3、4和5mL，各加入10%的Al（NO3）3及2.5mL的乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用纯甲醇定容至25mL。
精确称取烘干的银杏愈伤组
织和样品1g,按固液比1:
9加入甲醇，500W超声波辅助萃取50min后滤纸过滤，取试样加10%的AI（NO3）3溶液及2.5mL乙酸-乙酸钠缓冲溶液，用甲醇定容。
1.4测试条件
荧光分光光度法测定中激发光谱通带和发射光谱通带均设定为5nm，激发
电压700V,此条件下，扫描最佳激发波长和发射波长，考察铝离子添加量、缓冲液pH、甲醇浓度、反应时间对荧光强度的影响。
并在所得的最佳色谱条件下测定各浓度标准溶液的荧光强度，建立回归方程。
在相同条件下测定悬浮培养细胞黄酮提取液的荧光强度，根据回归方程计算含量。
黄酮糖苷水解及HPLC法测试条件参照Chen等的方法：
11：
0
1.5数据处理
所有实验数据利用软件Originpro8.0处理。
2结果与讨论
2.1最佳激发波长与发射波长的确定
对芦丁标准品进行激发波长和发射波长扫描，如图1所示当荧光强度最大时，激发波长抵=400nm，发射波长?
em=520nm,所以选择激发波长2ex=400nm，发射波长尼m=520nm检测黄酮。
图片1激发波长和发射波长下的扫描
2.2Al（NO3）3的添加量
考察了10%Al（NO3）3添加量分别为0、1、2、3、4、5和6mL与黄酮形
成的螯合物荧光强度的影响。
光谱图如下2所示：
3+
（a）1mLAl
3+
（d）4mLAl
3+
（b）2mLAl
（c）3mLAI
（e）5mLAl3+
图2不同Al3+添加量下芦丁荧光光谱图
结果表明，不添加Al3+的处理中，芦丁未形成螯合物，
稳定。
所有添加Al3+的处理中，在1500s后基本呈稳定趋势，添加量小于4mL
所以荧光强度一直不
的各处理其荧光强度在稳定趋势中还有小幅度波动。
综合荧光强度和络合物稳定
性两方面因素考虑，选择加入硝酸铝的量为4mL较适宜。
2.3甲醇浓度的影响
黄酮类化合物在甲醇中溶解度较好，难溶于水，选择甲醇做为溶剂。
分别以
10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%和100%的甲醇溶解芦丁,
各处理下荧光强度见下图。
Time/s
Time/s
290
280J
270」
y260J
n250;
I1
240:
230
220
210
0100200300400500600700800900100011001200
Time/s
（a）10%甲醇
（b）20%甲醇
（c）30%甲醇
0
-200
-400
-600
8001000-1200-1400'1600-1800
Time/s
430
（d）40%甲醇
（e）
50%甲醇
（f）60%甲醇
520
560
500
420
410
400
360
350
340
330
340
y390
n380
I1370
540
Time/s
（g）70%甲醇
480
520
460
500
440
480
420
460
400
440
380
360
420.
0
200
400
6008001000120014001600
Time/s
400
200
400
600800
Time/s
1000120014001600
80%甲醇
660
640;
620J
600:
y580J
s
n
e560:
I；
540:
520:
500:
480:
04008001200160020002400280032003600
Time/s
（i）90%甲醇
（j）100%甲醇
图片3不同甲醇浓度下的芦丁光谱图
根据各甲醇浓度与对应的芦丁螯合物最大荧光值绘制趋势图，发现甲醇浓度
为100%时，荧光强度最大，且光谱曲线平滑，没有波动，说明此条件下所生成的螯合物荧光强度稳定。
所以选择100%的甲醇作为溶剂。
图片4荧光强度随着甲醇浓度的变化
2.4pH值的影响
溶液的pH值对络合物的形成和荧光强度的大小有一定的影响。
向溶液中加
入不同pH的缓冲液，对荧光强度的的大小进行考察，见图5,结果表明，加入pH=3.4-4.0的乙酸-乙酸钠缓冲溶液时，溶液的荧光强度相对比较大，且荧光值
相对稳定。
pH=3.6时荧光值达到最大583.2
（ck）未加缓冲
图片5不同PH下芦丁的光谱图
根据缓冲液各pH与对应的芦丁螯合物最大荧光值绘制趋势图，随着pH的
加大，荧光强度在不断减小，尤其是pH从4.0降至4.2时荧光值发生了急剧的下降。
4.2-5.8范围内仍然是不断下降趋势，故试验选取pH3.6的乙酸-乙酸钠缓
图片6荧光强度随着PH的变化情况
2.5反应时间的影响
Al3+与黄酮反应时间不同，产生的荧光强度大小不一样。
添加人3+后将溶液
避光，测定溶液的荧光强度，进行时间扫描。
见图7,实验表明，随时间推移，
荧光强度逐渐加强，1500s后趋于稳定，为了检验所产生的荧光化合物是否稳定，将反应时间延长至3500s,但荧光强度没有发生明显变化，说明1500s时反应已经充分完成。
因此，选择反应时间1500s时测定荧光值。
750-
4008001200160020002400280032003600
Time/s
图片7荧光强度光谱图随反应时间的变化
2.6干扰实验
检验了常见的几种金属离子对FMS法测定银杏黄酮的干扰，结果表明Na+、K+、ca+3种金属离子对测定干扰很小，可以忽略。
2.7标准曲线
经过对实验条件的优化，对标品芦丁做标准曲线。
取不同浓度的芦丁，加
pH3.6的HAc-NaAc缓冲液，添加10%硝酸铝4mL反应1500s,测定各浓度下
络合物荧光强度。
用originpro8.0拟合出标准曲线，得出荧光强度与芦丁浓度在
1.8
>10"6-3.2K0"5mol/L内具有良好的线性关系，如图&
0.00.51.01.52.02.53.0
Al3+浓度/X10-5
图8芦丁浓度-荧光强度标准曲线
其回归方程为:
y=29.92x+36.49
其中y为荧光强度，x为芦丁浓度
2.8实际样品测定及加标回收
利用该方法对银杏培养细胞黄酮糖苷含量进行测定，并与HPLC法进行了对
比，各对样品溶液分别进行5次平行测定，结果见表1。
表1荧光分光光度法对银杏悬浮细胞黄酮糖苷的测定
黄酮糖苷含量/%
试验编号
FSMHPLC
1
2.85
3.02
2
2.93
3.08
3
3.02
2.94
4
2.90
2.89
5
2.89
3.12
平均
2.918
3.01
在细胞提取液中加入芦丁标样进行回收实验，计算回收率。
结果见表2
表2银杏细胞黄酮提取物加标回收率
编号
原含量/mg
加入量/mg
测定值/mg
回收率/%
平均回收率/%
1
14.84
1.00
15.86
102.0
2
16.37
1.50
17.88
100.8
101.45
3
13.62
2.00
15.67
102.4
4
18.03
1.50
19.54
100.6
由表2可知，荧光分光光度法测定银杏愈伤组织中黄酮含量的平均回收率为
101.3%,实验结果说明该方法精确度高，可行性强。
3结论
建立了一种准确性高、成本低、快速测定银杏黄酮的方法。
结果表明在合适的pH范围内黄酮在乙醇-水提取体系中与Al3+反应，所形成的复合物在体系稳定、在尼x400nm、血520nm测试条件下，其具有较强的荧光强度。
利用这种方法检测了银杏悬浮细胞中黄酮的含量为2.918%,回收率为101.3%。
FSM的开发
对银杏资源的开发利用有较大的促进作用，对其他药用植物的黄酮测定有一定借鉴意义。
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