AIHA患者外周血Th1Th2Tc1Tc2亚群的研究及意义.docx
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AIHA患者外周血Th1Th2Tc1Tc2亚群的研究及意义
AIHA患者外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2亚群的研究及意义
作者:
吴伟全,孙炎华,邱少玲
【关键词】自身免疫性溶血性贫血
[摘要]目的:
研究自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehaemolyticanaemia,AIHA)患者外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2亚群极化状态,分析AIHA的免疫学发病机制,为AIHA的临床治疗提供新的理论依据。
方法:
收集AIHA患者及健康对照组外周抗凝静脉血,分离纯化T细胞。
以Cy5标记的抗CD4、CD8单抗和PE标记的CD30单抗作双色流式细胞术,分析AIHA患者Th/Tc、Th1/Th2、Tc1/Tc2亚群的比例变化。
结果:
与正常对照组相比,AIHA患者外周血CD4+细胞百分率显着降低(P0.05),CD8+细胞百分率无明显变化(P0.05),CD4+/CD8+比例明显降低(P0.05),CD4+CD30-T、CD4+CD30+T细胞百分率明显下降,CD4+CD30-T/CD4+CD30+T和CD8+CD30-T/CD8+CD30+T比例均明显升高(P0.05),而CD8+CD30-T及CD8+CD30+T细胞百分率无明显变化(P0.05)。
结论:
AIHA患者外周血存在细胞免疫功能失调,T细胞亚群极化状态发生改变,呈明显Th1/Tc1型细胞优势;Th1/Tc1型细胞介导的细胞免疫可能与AIHA的免疫学发病机制有关。
[关键词]自身免疫性溶血性贫血;T细胞亚群;研究
StudyonTh1/Th2、Tc1/Tc2SubsetsonPeripheralBloodofthePatientswithAutoimmuneHaemolylicAnaemiaandIt‘sSignificance
Abstract:
ObjectiveToinvestigatethechangeofTh1likeandTh2likecellsbalanceinautoimmunehaemolyticanaemia(AIHA)patients.MethodsTheratiosofTh/Tc,Th1/Th2andTc1/Tc2inperipheralbloodTcellswereanalyzedbyimmunofiuorescencestainingandbicolorflowcytometry(FCM)invitro.ResultsComparedwiththeratiosofTh1/Th2(48.76%±6.17%)andTc1/Tc2(18.90%±4.12%)inhealthypeople,theratiosofTh1/Th2(56.21%±5.95%)andTc1/Tc2(23.09%±3.31%)inAIHApatientsincreasedobviously.FCManalysisshowedthataveragepercentagesofTh,Th1,Th2,Tc,Tc1andTc2are(22.31%±6.51%),(21.92%±6.42%),(0.37%±0.14%),(32.12%±6.15%),(30.95%±5.45%)and(1.34%±0.84%)inAIHApatientsversus(38.24%±5.82%),(38.01%±5.47%),(0.90%±0.16%),(31.25%±5.63%),(29.72%±5.20%)and(1.52%±0.68%)inhealthypeople.TheaveragepercentagesofTh,Th1andTh2decreasedobviously.WhiletheaveragepercentagesofTc,Tc1andTc2didnotchanged.ConclusionTheratiosofTh1/Th2andTc1/Tc2inperipheralbloodTcellswereincreasedobviouslyinAIHApatients.ItsuggestedthatcellularimmunityinAIHApatientsisshiftedtoTh1typeimmunity,whichmayrelatetothemechanismofAIHA.
Keywords:
Autoimmunehaemolyticanaemia;Tcellsubsets;Study
自身免疫性溶血性贫血(autoimmunehaemolyticanaemia,AIHA)是一种器官特异性的自身免疫性疾病,其发病机制尚未完全明了。
研究发现AIHA的发生发展与患者体内T细胞的极化状态有关。
目前研究认为CD30可能是Th2、Tc2特异性表面标志物之一,本研究应用PE标记的抗CD30单抗和Cy5标记的CD4、CD8作双色流式细胞术,检测AIHA患者及健康人群外周血T细胞各亚群的百分率。
分别以CD4+CD30-T、CD4+CD30+T、CD8+CD30-T及CD8+CD30-T细胞代表Th1、Th2、Tc1及Tc2细胞,并进一步探讨Th1类/Th2类细胞极化漂移在AIHA发病机制中的作用。
1材料与方法
1.1研究对象35例AIHA患者取自本院及广东医学院附属医院血液科,男15例,女20例,年龄3岁~69岁,中位年龄45岁,均符合AIHA诊断标准,并于用药前取外周抗凝血;正常对照35例为健康人群,排除AIHA及其他自身免疫性疾病,其中男16例,女19例,年龄5岁~57岁,中位年龄37岁。
1.2主要试剂和仪器AntiCD4Cy5、AntiCD8Cy5(EB公司)、AntiCD30-PE、MslgG1Cy5、MslgG1PE(Miltenyibiotec公司)、小牛血清、溶血素(0.85%NH4Cl溶液)、hCD3+TcellEnrichmentColumn、淋巴细胞分离液(AXISSHIELD公司)、EPICSXL型流式细胞仪(Beckman公司)。
1.3研究方法
1.3.1外周血T细胞的分离无菌采集患者及正常人外周静脉血4ml,肝素抗凝,用淋巴细胞分离液分离得单个核细胞。
无菌玻璃培养皿37℃培养30min,去除黏附于玻璃培养皿的单核细胞,以获取悬浮的淋巴细胞。
加入0.85%NH4Cl溶液溶解红细胞,经T细胞分离富聚柱(hCD3+TCellEnrichmentColumn)采用负筛选法获得纯化的T淋巴细胞。
用20%的小牛血清RPMI1640培养液调整细胞浓度约2×106/ml。
FCM法检测其纯度大于98%,台盼蓝拒染法检测其活性大于97%。
1.3.2Th、Tc、Th1、Th2、Tc1、Tc2亚群的测定取3支试管,各加入100μlT细胞悬液,3管分别加入小鼠抗人单克隆IgG1PE和小鼠抗人单克隆IgG1Cy5(阴性对照管)、抗CD4Cy5和CD30-PE(CD4+管)、抗CD8-Cy5和抗CD30PE(CD8+管),各种标记抗体均15μl,混匀,4℃避光30min,PBS洗涤2次,各管加入0.5ml缓冲液,上流式细胞仪检测。
1.4统计分析所有结果以±s表示,两两比较采用成组t检验,经SAS8.22软件分析,取P0.05有统计学意义。
2结果
2.1Th、Tc、Th/Tc细胞的检测结果AIHA患者外周血Th细胞百分率及Th/Tc比例明显下降,与正常人群比较差别有统计学意义(P0.05);Tc细胞百分率无明显变化,与正常人群比较差别无统计学意义(P0.05)(见表1)。
表1AIHA患者及正常人外周血Th、Tc细胞的检测(略)
注:
与正常对照组比较,*P0.05;**P0.05
2.2Th1、Th2、Tc1、Tc2、Th1/Th2、Tc1/Tc2的检测结果AIHA患者外周血Th1、Th2细胞百分率明显下降,与正常人群比较差别有统计学意义(P0.05):
Tcl、Tc2细胞百分率无明显变化,与正常人比较差别无统计学意义(P0.05);Th1/Th2及Tc1/Tc2比例升高,与正常人比较差别有统计学意义(P0.05),见表2。
表2AIHA患者及正常人群外周血Th1/Th2、Tc1/Tc2细胞的检测(略)
注:
与正常对照组比较,*P0.05;**
3讨论
自身免疫病是临床上常见的一类疾病,然而引起自身免疫病的原因和机制十分复杂,目前尚未完全明了。
可能与自身抗原的出现、免疫调节异常、Fas/FasL表达异常等多种因素有关,根本原因可能是自身成分具有免疫原性和/或自身免疫耐受的破坏,发生持久和过度的自身免疫应答。
目前研究资料表明,Th/Ts(CD4+/CD8+)细胞的平衡在自身免疫病的发生发展过程中起重要作用。
CD4是T辅助/诱导细胞(Th/Ti)的表面标志,CD4+T细胞具有辅助T细胞转变成效应细胞、B细胞转化成浆细胞以及活化巨噬细胞等功能。
起辅助、诱导细胞及体液免疫的作用。
CD8是抑制/杀伤T细胞(Ts/Tc)的表面标志,CD8+T细胞具有细胞毒效应及抑制T细胞活化、抑制B细胞产生抗体,起抑制细胞及体液免疫的作用。
Th/Ts(CD4+/CD8+)比例变化反映了机体的免疫功能状况,比例升高表明免疫功能亢进,比例降低表明免疫功能低下。
本研究发现,AIHA患者CD4T百分率及CD4+/CD8+比例均明显降低,CD8+T百分率无明显变化。
结果提示,AIHA患者Th/Ti数量及比例降低,反应了AIHA患者体内存在细胞免疫调节异常,AIHA患者可能存在T细胞免疫功能低下,但是自身反应性T细胞可能是异常活化的。
人类CD4+T细胞根据其分泌的细胞因子不同至少可分为Th0、Th1、Th2三个亚群。
其中Th1亚群可分泌IL2、IFNγ等细胞因子,促进细胞免疫,激活细胞毒T细胞,巨噬细胞,吞噬杀伤靶细胞,也可分泌TNFα、β等细胞因子作用于靶细胞;Th2亚群主要分泌IL4、IL5、IL10等细胞因子而促进体液免疫反应。
近年来研究发现,人类CD8+T细胞至少可分为Tcl、Tc2两个亚群。
Tc1与Th1相似,可分泌IL2、IFNγ等细胞因子:
Tc2与Th2相似,可分泌IL4、IL5、IL10等细胞因了[3]。
Mosmann等[4]将Th1/Tc1、Th2/Tc2细胞分别称为Th1类、Th2类细胞。
Th细胞间的平衡状态与多种疾病的发生发展密切相关,Alves等认为Th1/Th2细胞间的平衡,是体内体液免疫及细胞免疫间重要的调节枢纽。
因此,建立一种准确、灵敏、快速的检测Th的方法十分必要。
目前检测Th1/Th2的方法有多种,其基本原理都是外周血淋巴细胞经刺激后,检测培养液中细胞因子的含量,或者检测细胞内细胞因子的表达。
但是它们都无法判断所分泌的细胞因子是来自CD4+T细胞或是其他单个核细胞,所以并不能真正地检测出Th细胞的极化状态。
Thl类/Th2类细胞间的平衡状态对研究包括AIHA在内多种自身免疫病有重要意义,然而,长期以来,一直缺乏一种特异性表面标志以区别Th1类/Th2类细胞。
近年来有研究发现CD30是检测Th2和Tc2细胞可靠的表面标志,DelPrete等[1]研究发现Th1细胞克隆基本上不表达CD30mRNA,其CD30膜结合形式及可溶性形式水平也检测不到,而在Th2细胞克隆,CD30mRNA及CD30膜蛋白结合形式则大量表达,并释放出大量的sCD30。
Chilosi等[5]从一名类Omenm综合征(OLS)患者外周血中分离出的CD30+T细胞形成的集落中,绝大多数具有Th2细胞特征,而CD30T细胞集落多数是Th1细胞。
Nakamura等[6]研究发现,IL4能施用诱导CD30在活化的CD4+T细胞上表达,在内源性IL4缺失的状态下,Th2细胞会失去CD30表达的能力。
目前国外相关研究均表明CD30是Th2细胞的标志之一。
本研了以PE标记的抗CD30单抗测得的正常人外周血T细胞中CD4+CD30+T(Th2)细胞为(0.80±0.16)%,与Nagata等[7]的结果相似。
因此我们可以运用CD30或sCD30的表达水平来分析Th2细胞在一些疾病发病机制中的作用,可为疾病的活动性、预后评估等方面提供一定的帮助,但其价值还有待进一步研究。
AIHA是一种常见的自身免疫性疾病,临床上以溶血性贫血为主要特征。
主要是由于服用药物或病毒感染后,使红细胞膜表面成分发生改变,从而刺激机体产生抗红细胞的自身抗体,这种抗体与自身改变的红细胞结合导致红细胞破坏增加所致。
然而,越来越多的资料显示,除体液免疫机制外,细胞免疫起着非常重要的作用。
本研究应用流式细胞术检测纯化的外周血T细胞,分别以CD4+T细胞,CD8+T细胞代表Th、Tc细胞,以CD30区分Th1类和Th2类细胞。
我们的结果发现AIHA患者外周血Th1类/Th2类细胞间失衡,呈现明显Th1类优势,这一结论与Fagiolo等[8,9]的报道一致。
同时,我们发现,尽管AIHA患者Th细胞下降,Tc细胞无明显变化,然而Th1/Th2及Tc1/Tc2比例均明显升高,提示在AIHA的发病过程中,Th1类/Th2类比例较Th和Tc细胞数所起的作用更为明显。
AIHA患者体内Th1类/Th2类比例升高,提示机体自身反应性细胞免疫功能亢进。
在AIHA发生发展过程中,Th1细胞可通过分泌IL2、IFNγ等细胞因子,激活细胞毒T细胞、巨噬细胞,杀伤红细胞;而活化的Tc1细胞,也就是通常所说的Tc细胞,则能通过分泌穿孔素、颗粒酶特异性地杀伤红细胞[10,11]。
本研究表明,通过对Th1类/Th2类细胞平衡在AIHA中的作用的研究,不仅有助于阐明AIHA的发病机制,而且有可能为我们提供治疗AIHA的新方法,即通过调节Thl类/Th2类细胞的动态平衡,来调节过强的体液免疫或细胞免疫,达到治疗自身免疫病的目的[12]。
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