浅论一种新型结缔组织生长因子人源单链抗体的可溶性表达以及分离纯化.docx

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浅论一种新型结缔组织生长因子人源单链抗体的可溶性表达以及分离纯化

浅论一种新型结缔组织生长因子人源单链抗体的可溶性表达以及分离纯化

【摘要】目的：

研究单链抗体（scFv）在不同载体和菌株中的表达以及表达产物的免疫学活性评价。

方法：

将人源化单链抗体的基因通过酶切、连接等生物技术的方法克隆到pET28a、pET32a和pETEI:

X3种不同的载体中，并选用不同的表达菌株进行表达，观察单链抗体的表达情况并对抗体的可溶性表达进行优化，采用亲和层析和分子筛层析对目的蛋白进行纯化，并在体外研究目的蛋白的生物学活性。

结果：

抗结缔组织生长因子单链抗体在pET28a/BL21（DE3）中不能表达，在pET32a/BL21（DE3）和pETEI:

X/BLR（DE3）中均成功表达，但是在pETEI:

X/BLR（DE3）中scFv抗体无法从内含肽（intein）上裂解。

scFv在pET32a/BL21（DE3）中表达量占总蛋白的30%左右，经过两步层析纯化后纯度达到85%以上。

体外免疫试验显示，目的蛋白具有良好的免疫学活性。

结论：

人源化抗结缔组织生长因子单链抗体scFv在大肠杆菌中的表达需要分子伴侣，通过低温表达策略在pET32a/BL21（DE3）中成功得到表达。

【关键词】人源单链抗体;结缔组织生长因子;弹性蛋白;分离纯化

　　[Abstract]Objective：

ToinvestigatetheexpressionofanovalantiCTGFsinglechianFv（scFv）antibodywithindifferentplasmidand/orhostcellandtheinvitroimmunoreactivityofthisscFvantibody.Methods:

Inthisstudy,ascFvantibodyagainstCTGF/CCN2withfullhumansequencewasclonedintothreedifferentvectors,pET28a,pET32aandpETEI:

X,andexpressedinBL21（DE3）,BL21（DE3）,BLR（DE3）,respectively.Inaddition,weoptimizedthetemperatureforsolubleexpressionofthescFv.Theexpressedtargetproteinwasthenpurifiedbyusingmolecularfilterandaffinitychromatography,andthebioactivitywasalsoanalyzed.Results:

ThescFvantibodycouldnotbeexpressedinpET28a/BL21（DE3）whileitwasexpressedwellinpET32a/BL21（DE3）andpETEI:

X/BLR（DE3）.However,thescFvantibodycouldnotbecleavedfromtheELPinteinscFvfusion.Afteroptimization,thefusionproteinwasoverexpressedmainlyassolubleforminpET32a/BL21（DE3）andapproximatelyachieved30%oftotalproteins.AfterpurifiedwithNiSepharoseaffinitychromatography,thefusionproteinwascleavedwiththrombinprotease.Finally,thescFvwasseparatedfromthefusionpartnerbygelfiltrationchromatography,andthepuritycouldreachover85%.ImmunoreactivitystudydemonstratedthatthisscFvweobtainedhadaspecialaffinitytowardsCTGF/CCN2.Conclusion:

TheresultsshowthatthisscFvshouldbeexpressedwithafusedpartnertoachievesatisfiedamountinE.coli.ItiswellexpressedandpurifiedinpET32a/BL21（DE3）.

　　[Keywords]humanderivedsinglechainFvantibody;connectivetissuegrowthfactor;elastinlikeprotein;separationandpurification

　　结缔组织生长因子（CTGF）含有344个氨基酸，由生长因子结合区、整合素蛋白识别功能域、肝素和黏蛋白结合域以及二聚体作用位点4个分泌蛋白模块组成[1]。

在纤维化疾病中，组织生长因子（TGF）作为一个重要的细胞因子能调节胞外基质的形成，研究认为胞外基质表达的调节紊乱和肺纤维化、肾纤维化、肌营养不良以及其他的许多纤维化相关疾病的发病密切相关[1-2]。

然而，TGF是一个具有广泛生理功能的细胞因子，大量研究显示直接抑制TGF的生物学功能会抑制正常生理机能，从而对机体造成损害。

CTGF作为在纤维化疾病中TGF的一个主要下游分子，有望成为治疗纤维化疾病的一个非常理想的靶点。

　　单链抗体scFv由免疫球蛋白的可变区组成，分子量只有正常抗体的1/5，已经被广泛应用于临床治疗和检验。

目前，片段抗体的生产大多采用原核表达，但是由于scFv抗体含有两对二硫键，而原核细胞缺少翻译后修饰，给scFv抗体的生产带来了一定的技术难题。

有文献报道通过加入融合伴侣谷胱甘肽S转移酶（glutathioneStransferas，GST）、硫氧还蛋白（thioredoxin，Trx）、麦芽糖结合蛋白（maltosebindingprotein,MPB）可以帮助蛋白在细胞质中高表达，增加可溶性，而且还具有较高的生物学活性[5-6]。

　　1菌株、载体和试剂

　　菌株和质粒

　　大肠杆菌BLR（DE3）菌株和BL21（DE3）菌株购自NewEnglandBiolabs公司（Beverly,MA,USA）,pET28a、pET32a购自novagen公司（Madison，Wisconsin，USA），pETEI:

X质粒由普林斯顿大学DavidWWood教授惠赠。

　　试剂

　　内切酶NcoⅠ和NotⅠ购自NewEnglandBiolabs公司;AntiCTGFscFv基因由东南大学医学院提供;LB培养基含%葡萄糖、%酵母提取物、2%酪蛋白、2%（NH4）2SO4、%MgSO4、%K2HPO4、1%NaCl，用作BL21的培养液;TB培养基（每升含12g酪蛋白、24g酵母提取物、gKH2PO4和gK2HPO4）用于BLR菌株的培养液;溶菌缓冲液（1mmol·L-1TrisHCl、pH,2mmol·L-1EDTA,　mg·ml-1lysoozyme）和裂解缓冲液（PBS缓冲液加上40mmol·L-1BisTris、pH,2mmol·L-1EDTA）用于pETEI:

XEI:

scFv表达的纯化;羊抗鼠HRPIgG抗体、鼠抗CTGF/CCN2抗体和小牛血清购自R&D公司（USA）;CTGF/CCN2标准品购自Peprotech公司（英国，伦敦）;镍亲和柱和SephadexgelG50购自Novagen公司（Madison,Wisconsin,USA）。

本研究中所使用的其他试剂均为分析纯。

　　2方法

　　Scfv抗体表达载体的构建

　　pET32aTrxAscFvHis、pET28ascFvHis载体的构建由噬菌体展示技术获得的scFv基因片段含有NcoⅠ和NotⅠ位点。

用NcoⅠ和NotⅠ内切酶分别酶切scFv基因和pET32a、pET28a质粒，用连接酶过夜连接获得pET32aTrxAscFvHis、pET28ascFvHis表达质粒，并转入大肠杆菌BL21。

所构建的两个载体都具有ampicillin抗性。

　　pETEI:

scFv载体的构建scFv基因先经PCR扩增（引物：

5′AAAGTTGTACACAACATGGCCGAG

　　GTGCAGCTGGTGGAGT;3′TGATGGTGATGATGATGT

　　GCGGCCGCACCTA），在scFv基因5′端添加一个BsrGⅠ内切酶位点。

扩增后的scFv基因和pETEi:

X质粒分别用BsrGⅠ和NotⅠ过夜酶切，然后用连接酶过夜处理，获得pETEI:

scFv表达载体。

pETEI:

scFv表达载体带有ampicillin和kanamycin抗性。

　　scFv在不同载体和菌株中的表达

　　用pETEI:

scFv质粒转化BLR，经涂板筛选出具有ampicillin抗性的菌株，在37℃、170r·min-1条件下用含有200μg·ml-1ampicillin的TB培养基培养过夜，然后在18℃继续培养24h，诱导目的蛋白的表达。

用pET32aTrxAscFvHis和pET28ascFvHis分别转化BL21菌株，经涂板ampcillin筛选后，挑选具有ampicllin抗性的克隆分别用BL21培养基在37℃、170r·min-1条件下培养过夜，用mmol·L-1IPTG诱导目的蛋白表达。

各组的裂解产物用SDSPAGE电泳分析目的蛋白的表达情况。

　　scFv在pETEI:

scFv/BLR中的纯化

　　融合蛋白和scFv的纯化步骤参照标准操作手册。

通过摇瓶表达pETEI:

scFv/BLR，5000r·min-1、4℃条件下离心10min回收细胞。

回收的细胞按每克细胞使用5ml溶菌液重悬，经超声破碎后于4℃离心回收上清。

取10ml上清转移到50ml的离心管中，加入10ml3mol·L-1NaCl;37℃孵化10min，室温下12000r·min-1离心10min回收沉淀。

将沉淀重悬到1ml预冷的裂解液中，室温下裂解过夜，然后加入1ml3mol·L-1NaCl溶液，室温下孵育10min后5000r·min-1离心回收上清。

　　scFv在pET32aTrxAscFvHis/BL21中可溶性表达的温度优化根据pET使用手册，本研究对影响蛋白可溶性表达的主要因素温度进行优化。

菌体在37℃下过夜培养后，分别在37℃和18℃条件下用mmol·L-1的IPTG诱导表达6h。

离心回收细胞，分别取1g细胞用溶菌缓冲液裂解，进行SDSPAGE电泳分析上清和沉淀中的目的蛋白。

　　pET32aTrxAscFvHis中scFv的纯化

　　挑选1个含有pET32aTrxAscFvHis质粒的BL21单克隆在5ml含%ampicillin的LB培养液中37℃过夜培养，然后转接到500ml含%ampicillin的LB培养液中继续培养，当OD600达到时迅速冷却至18℃，并添加mmol·L-1的IPTG诱导目的蛋白表达5h。

发酵液在室温条件下，5000r·min-1离心10min回收细胞。

回收的细胞按每克细胞使用5ml溶菌液重悬;重悬液室温下放置过夜后超声破碎;4℃下8000r·min-1离心20min回收上清液。

上清液用镍亲和层析回收融合蛋白，回收的融合蛋白于纯水中过夜透析后冻干处理，冻干样品按mg蛋白·ml-1酶切裂解液溶解，经凝血酶酶切后用G50层析柱除去杂质，回收scFv蛋白。

　　scFv的生物活性测定

　　将获得的scFv抗体用2×稀释的方法从μg·ml-1到μg·ml-1的浓度以50μl·孔-1包被到96孔板上。

4℃过夜后，用含1%tween的PBS洗涤后加入50μl·孔-1的μg·ml-1的CTGF标准品，于37℃温箱中孵育2h后洗涤并加入50μl·孔-1的μg·ml-1的鼠抗CTGF/CCN2抗体，并在37℃下孵育1h，再经洗涤后加入50μl·孔-1的1μg·ml-1羊抗鼠HRPIgG抗体。

最后加入显色剂，待显色完全后加入终止液并用ELISA酶标仪记录结果。

　　3结果

　　pET28ascFvHis、pET32aTrxAscFvHis、pETEI:

scFv质粒的构建3个质粒构建完毕之后送往上海生工（上海）测序，结果显示3个质粒构建成功。

如表1所示，pET28ascFvHis中，scFv只在N端添加了1个Met密码子，末尾连接6个HIS密码子并紧接1个终止密码子;pET32aTrxAscFvHis中，scFv被融合到TRxA蛋白的C端，scFvN端附加6个His;pETEI:

scFv中，scFv被克隆到InteinC端。

表1抗体蛋白scFv在3种载体中的构建、表达和纯化

　　scFv在3个质粒和菌株中的表达

　　如表1所示，scFv蛋白在pET28ascFvHis/BL21中，诱导前后没有观察到目的蛋白明显表达，Western结果显示scFv蛋白不表达（datanotshown）;在pETEI:

scFv/BLR和pET32aTrxAscFvHis/BL21中均成功表达（见图1、2），其中融合蛋白TrxAscFvHis相对分子质量约为43000，ElastininteinscFv融合蛋白约为90000。

　　1.Marker;2.总蛋白;3.经过1次盐析纯化后的样品;4.盐析纯化后除去的蛋白;5.经过3次盐析纯化后的样品

　　图1scFv抗体蛋白在pETEI:

scFv/BLR中的表达和纯化

　　Fig1TheexpressionandpurificationofscFvinpETEI:

scFvLane1.Marker;Lane2.totalproteinoflysate;Lane3.theprecipitationafteronepurificationcyclebysaltaddition,heatingandcentrifugation;Lane4.thesupernatantafteronepurificationcycle;Lane5.theprecipitationaftercleavinginducingbypHshiftandthreecyclesofpurificationbysaltaddition,heatingand　scFv在pETEI:

scFv/BLR中的表达纯化

　　通过反复的加入高盐盐析和重新溶解，融合蛋白不断得到纯化，但是电泳结果显示，scFv无法从融合蛋白ElastininteinscFv中裂解游离出来（图1）。

　　温度对scFv蛋白在pET32aTrxAscFvHis/BL21中表达的影响pET32aTrxAscFvHis/BL21在37℃条件下表达的产物主要为包涵体或者其他不能与镍柱结合的形式，而18℃条件下scFv的表达主要为可溶性表达，可以吸附到镍亲和柱上，并能被高浓度咪唑溶液洗脱下来（图3）。

1.Marker;2.经过分子筛柱色谱纯化得scFv蛋白;3.纯化融合蛋白经凝血酶酶切16h后样品;4.经亲和柱色谱纯化后的样品;5.表达的溶解性总蛋白;6.IPTG诱导表达前总蛋白;w1.scFv蛋白的westernblotting结果;w2.融合蛋白的westernblotting结果

　　scFv蛋白在pET32aTrxAscFvHis/BL21中的表达和纯化优化后，在18℃条件下表达的scFv主要以可溶性的形式存在，融合蛋白占总蛋白的30%左右，经镍柱初步纯化后回收的融合蛋白的纯度能达到50%左右。

酶切后经进一步的分子筛分离纯化，电泳纯度能达到85%以上（图2）。

　　scFv生物学活性测定

　　如图4所示，在包被0、5、10、20、40、80ngscFv抗体所测得OD450nm分别为15±85、35±45、50±50、40±30、35±95、20±80，组内变异系数小于10%。

经回归统计，OD450nm吸收值和抗体含量成线性关系（y=016x+071）,R=%,,说明纯化所得抗体scFv与CTGF是能特异性结合的，具有良好的生物活性。

　　4讨论

　　本研究中scFv的基因来源于library，之前的研究显示这种来源的基因都很难获得可溶性表达的产物。

我们通过构建pET32aTrxAscFvHis质粒在低温表达的条件下成功获得溶解性的且具有免疫活性的产物，不同于以往的任何一种已经报道的方法。

　　大肠杆菌原核表达系统被大规模运用于重组蛋白的表达和生产，具有操作简单、周期短、耗费低的特点，而且大部分表达的外源蛋白都能保持生物活性。

但是，原核系统缺乏真核表达系统所具有的翻译后修饰功能，很多复杂的具有二硫键的外源蛋白会以不具有生物学活性的包涵体形式存在。

虽然目前的蛋白复性技术也在不断发展，但是应用的范围往往受二硫键的多寡和蛋白空间结构的复杂程度的限制，只能应用于一些小的、简单的、二硫键少的蛋白的复性。

相对于包涵体表达，可溶性表达具有很多优点，之前很多的研究显示大量的可溶性表达的蛋白可以不经过复性就具有生物活性。

有文献报道通过加入融合伴侣GST、NusA、MPB可以帮助蛋白在细胞质中高表达，增加可溶性，而且还具有生物活性[5,10-11]。

活性蛋白的生成依赖于正确空间结构的形成，二硫键的正确形成是含二硫键的蛋白能否正确折叠的首要影响因素[12]。

大部分分子伴侣无法使scFv在胞内形成二硫键，需要在周质空间里进一步的氧化修饰或者体外复性处理。

Trx是一种细菌来源的特殊的分子伴侣，它不但能够促进目的蛋白的折叠，而且能帮助蛋白在细菌体内高效表达、提高稳定性，并形成正确的二硫键[13]。

　　温度是影响细菌可溶性表达的一个非常重要的因素,在不同的温度下外源蛋白的表达形式也是不一样的。

有研究报道同一种蛋白在37℃下基本表达成包涵体的形式，但是在30℃下却主要表达成溶解性的形式，且具有生物活性[14]。

低温能通过降低蛋白合成相关酶的活性减缓蛋白的表达速率，使蛋白有足够的时间折叠成正确的空间结构[15]。

在pET32ascFvHis/BL21（DE3）表达系统中，温度是影响蛋白表达形式的主要因素，TrxscFvHis融合蛋白在37℃下主要以包涵体的形式表达，而在18℃下主要表达成可溶性蛋白。

　　目的蛋白scFv无法以游离的形式在pET28ascFvHis/BL21（DE3）中表达，可能是mRNA不稳定无法正常转录，也可能是蛋白的翻译过程中出现了某些差错。

在过去的研究中，外源蛋白的不表达一直是一个复杂的至今没有定论的问题。

经过多年的研究发现，分子伴侣的加入不仅可以帮助外源蛋白成功表达，而且还能大大提高表达产率和稳定性。

　　Inteinsystem是近年来出现的一种新型表达系统，融合蛋白CBDintein不但具有纯化标签而且具有自我切割功能[16]。

pETEI:

X是最近在Nature上才报道的一种，在Inteinsystem基础上改进的集表达纯化于一体的新型表达系统。

目的蛋白在pETEI:

scFv/BLR（DE3）中也成功得到表达。

ELP的功能类似于Trx能帮助scFv的表达，而且由于ELP具有独特的自我聚集和溶解特性，可以不借助任何传统的纯化方法，只需要通过反复加入高浓度的NaCl就可以达到满意的纯化效果。

pETEI:

X的另一个特性就是具有intein，它能通过特定的条件诱导自我裂解将scFv从融合蛋白中释放出来。

然而和现有的其他的具有intein的表达系统一样，intein的自我裂解并非严格意义上可控，和与intein相连的几个起始氨基酸有着重要关系，甚至外源蛋白的空间结构也能大大影响裂解的效率[17]。

scFv蛋白在pETEI:

scFv/BLR（DE3）中成功得到表达，但是最终无法从融合蛋白上裂解下来，可以通过在外源蛋白的起始区加入一段连接肽，比如在这个系统中已经表达成功的GFP的一段起始蛋白序列来帮助目的蛋白从融合蛋白上成功裂解。

　　体外酶联免疫吸附实验显示，通过pET32ascFvHis/BL21（DE3）低温表达后纯化获得的目的蛋白与CTGF/CCN2的结合具有良好的特异性。

接下来的工作，我们将进一步观察这个抗体蛋白在动物小鼠模型体内的抗纤维化活性，这将是目前已有研究中首次报道用CTGF的scFv抗体治疗纤维化疾病。

因为此scFv抗体来源于人类自身抗体库，在人体中不会引发抗原抗体反应，如果活性良好，将有望成为首个能应用于临床的治疗肺纤维化的抗体药物。

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