离子色谱方法应用.docx

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离子色谱方法应用

“离子色谱方法及应用”详稿

张筑元

2007年11月

1方法原理

1.1离子色谱的创立

离子色谱（以下简称IC）是高效液相色谱的一种，是分析离子的一种液相色谱方法。

液相色谱法（1906年，俄国植物学家Tswett）：

1906年色谱的发明者，俄国植物学家M.S.Tswett，是在研究植物色素的过程中，将植物叶子的萃取物倒入填有碳酸钙的直立玻璃管内，然后加入石油醚使其自由流下，结果色素中各组分互相分离并形成各种不同颜色的谱带（如Tswett色谱实验图）。

这种方法因此得名为色谱法。

以后此法逐渐应用于无色物质的分离，“色谱”二字虽已失去原来的含义，但仍被人们沿用至今。

Tswett的研究奠定了色谱法的基础，从此之后，化学家、生物化学家和生理学家们在制备高纯化合物、分离和鉴定复杂混合物时便有了一条崭新的有效途径。

自从有了这种手段，使许多过去被认为是单一的物质，判明却是多种化合物的混合物；许多化学反应的过程依靠这种方法而得以探讨；终于使许多复杂混合物，例如维生素、药物、色素、氨基酸等得到离析；这种方法甚至帮助科学家们了解了一些长期模糊不清的自然现象，诸如植物与动物的营养、激素对人和动物的生理特性、维生素在动植物体中的分布等等问题。

Tswett的实验意义很大，尽管他于1907年在德国柏林植物学会议上反复强调色谱技术，但并没有受到当时科学界的重视。

经过二十五年后，德籍奥地利化学家R.Kuhn等利用他的方法在纤维状氧化铝和碳酸钙的吸附柱上将过去一个世纪以来公认为单一的结晶状胡萝卜素分离成a和b两个同分异构体，并由所取得的纯胡萝卜素确定出了其分子式。

另外他还发现了八种新的类胡萝卜素，并把它们制成纯品，进行了结构分析。

同年，他又把注意力集中在维生素的研究上。

在确定了维生素A的结构以后，于1933年从35000升脱脂牛奶中分离出一克核黄素（即维生素B2），制得结晶，并测定了它的结构。

此外，他还用色谱法从蛋黄中分离出了叶黄素；还曾把腌鱼腐败细菌中所含的红色类胡萝卜素确定离析出来并制成结晶。

Kuhn正是由于在维生素和胡萝卜素的离析与结构分析中取得了重大研究成果而获得了1938年诺贝尔化学奖，也正因为他的出色工作使色谱法名声大振，迅速为各国科学家们所注目，广泛被采用起来。

纸色谱法：

20世纪40年代至50年代初，先后出现了纸色谱（paperchromatography,PC）和薄膜色谱法（thin-layerchromatography,TLC）。

特点：

较经典色谱法简单、分离时间短，样品量要求小。

气相色谱法（1952年）：

1952年，James和Martin提出了气相色谱法（gaschromatography,GC）。

特点：

以气体作为流动相。

应用范围广泛受到人们重视。

但对不易气化和热不稳定性差的化合物难以分离。

高效液相色谱法：

20世纪60年代后期由于新型色谱柱填料、高压输液泵和高灵敏度的检测器的出现，发展出了高效液相色谱（Highperformanceliquidchromatograghy,HPLC）。

高效液相色谱法的广泛应用始于70年代，经过三十几年的发展，在基础理论、仪器装置和色谱柱等方面的研究已趋于成熟。

其应用范围十分广泛，几乎能够分析所有的有机、高分子、生物样品。

据估计，目前已知的化合物中，有80%的化合物需要用高效液相色谱进行分离分析。

离子色谱法（1975年，SmallH）：

现代离子色谱开始于SmallH及其合作者的工作，他们于1975年发表了第一篇IC论文，同年商品仪器问世。

初期，IC主要用于阴离子的分析，而今，IC已在非常广的范围得到应用，已经成为在无机和有机阴、阳离子分析中起重要作用的分析技术。

虽然离子交换仍是IC的主要分离方式，离子排斥和离子对色谱在离子型和高极化分子的分析中也起着重要的补充作用。

（本讲义重点介绍离子交换色谱）

1.2色谱法实质与目的

实质：

分离。

目的：

定性分析或定量分析。

1.3色谱法分类

1.3.1按两相分子的聚集状态分：

类别

流动相

固定相

类型

备注

液相色谱

液体

固体

液-固色谱

液体

液体

液-液色谱

气相色谱

气体

固体

气-固色谱

气体

液体

气-液色谱

1.3.2按固定相的固定方式分：

柱色谱：

包括填充柱色谱、毛细管柱色谱；

平面色谱：

包括纸色谱、薄层色谱、高分子薄膜色谱；

1.3.3按分离机制分：

分配色谱，利用分配系数的不同；吸附色谱，利用物理吸附性能的差异；离子交换色谱，利用离子交换原理；空间排阻色谱，利用排阻作用力的不同。

1.3.4色谱法简单分类（按流动相）

色谱法

气相色谱法

填充柱色谱法

毛细管色谱法

液相色谱法

柱色谱法

经典液相柱色谱法

高效液相色谱法（包括离子色谱）

平板色谱法

纸色谱法

薄层色谱法

超临界流体色谱法

电色谱法

1.4液相色谱分类

按分离机理分为：

类型分离机理分析对象或应用领域

吸附色谱吸附能，氢键异构体分离、族分离，制备

分配色谱疏水作用各种有机物分析与制备

凝胶色谱溶质分子大小高分子分子量及其分布测定

离子色谱离子性物质的分析

手性色谱立体效应手性异构体分离，药物纯化

亲和色谱生化特异亲和力蛋白、酶、抗体

盐析色谱溶剂化作用蛋白质、非电解质分析

1.5离子色谱分类

分离模式分离机理分析对象或应用领域

离子交换库仑力无机和有机离子分析

离子排斥Donnan平衡有机酸、氨基酸、醇、醛

离子对疏水作用离子性物质分析

离子抑制疏水作用有机弱酸弱碱分析

离子分配疏水作用生物大分子

金属配合物疏水、螯合金属离子

1.6不同分离模式所利用的溶质性质

分离模式所利用的物质的性质差异

离子交换电荷与离子体积

离子排斥解离常数与疏水性

离子对（RP）与离子对试剂之间的亲和力，离子对化合物的疏水性

离子抑制（RP）在一定pH值下的疏水性

反相分配（RP）有机离子本身的疏水性

1.7离子色谱分析的对象物质

离子类别主要离子种类

无机阴离子卤素及简单阴离子、酸根阴离子、阳离子的配阴离子

无机阳离子碱金属、铵离子、碱土金属、过渡金属、稀土元素

有机阴离子有机酸、烷基硫酸、烷基磺酸、磷酸、多聚磷酸

有机阳离子胺、醇胺、铵盐、吡啶、生物碱、锍盐

天然有机物糖、醇、酚、醛、维生素

生物物质有机磷化合物、氨基酸、肽、核酸、核甙酸、蛋白质、

碱基、抗生素

1.8离子色谱法的优点

无机阴离子分析的绝对优势。

离子色谱对阴离子的分析是分析化学中的一项新的突破。

电感耦合等离子体发射光谱-质谱（ICP-MS）是目前同时测定多元素的快速、灵敏而准确的分析方法，则同时测定多种阴离子的快速、灵敏而准确的分析手段当首推离子色谱法。

分析速度快。

通常几分钟至十几分钟。

对7种常见阴离子（F-、Cl-、Br-、NO2-、SO42-、PO43-）和6种阳离子（Li+、Na+、K+、Mg2+、Ca2+）的平均分析时间分别小于10分钟。

用高效快速分离柱对上述7种最重要的常见阴离子的分离只需3分钟。

检测灵敏度高。

离子色谱分析的浓度范围为μg/L~mg/L。

直接进样50μL，对常见阴离子的检出限小于10μg/L。

选择性好。

非离子性物质无保留。

多离子同时分析。

离子色谱柱的稳定性高，使用寿命长。

1.9离子交换色谱基本原理

离子交换色谱分离机理主要是离子交换（书28页）。

离子交换色谱分离机理主要是离子交换,是基于离子交换树脂上可离解的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子之间进行的可逆交换,依据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离。

对树脂亲和力弱的离子较亲和力强的离子通过柱子快。

常见阴离子F-、Cl-、NO3-、SO42-对树脂的亲和力依次增强。

除了纯的离子交换过程之外，对某些离子也存在与固定相的非离子相互作用。

最重要的非离子相互作用是吸附。

（简略）

2仪器构成

2.1常用仪器

2.2仪器构成：

流动相输送系统、分离系统（分离柱）、检测系统（检测器）、数据处理系统4个部分。

2.3流动相输送系统

离子色谱流动相要求耐酸耐碱系统，这与高效液相色谱不同。

凡是流动相通过的管道、阀门、泵、柱子及接头等不仅要求耐压，而且要求耐酸碱腐蚀。

国际上生产离子色谱仪的著名公司均用全塑IC系统。

流动相储存容器（玻璃或聚四氟乙烯，碳酸体系需密封）。

在线脱气装置（惰性气体鼓泡吹扫、真空脱气）。

高压泵。

对泵的基本要求：

•高稳定性。

直接关系到分析结果的重复性和准确性。

•流量控制准确。

精度通常要求小于0.5%。

•一般要求能够耐2540MPa的高压。

•泵的死体积要小。

通常要求小于0.5mL。

•能精确地调节流动相流量。

流量测定精度约0.1%。

2.4分离柱

离子色谱仪的核心部件是分离柱。

分离柱由分析柱和保护柱组成。

常用分析柱内径：

3.0,4.0,4.6,8.0mm，长：

50,100,150,250mm。

柱管材料是惰性的，一般均在室温下使用。

固定相是分离柱（离子色谱）的核心。

固定相种类：

离子交换剂、两性离子交换剂、螯合树酯、氧化还原树酯。

最常用的固定相是离子交换剂。

离子交换剂是一类带有离子交换功能基的固体微粒。

其结构为在交联的高分子骨架上结合可解离的无机基团。

在离子交换反应中，离子交换剂的本体结构不发生明显的变化，仅由其带有的离子与外界同电性离子发生等量的离子交换。

离子交换剂种类：

无机离子交换剂（如水合磷酸锆、钨酸锆、钼酸锆等）、离子交换树脂（包括强酸型阳离子交换树脂、强碱型离子交换树脂、弱酸型、弱碱型、螯合型等）。

离子交换色谱的固定相具有固定电荷的功能基，阴离子交换色谱固定相的功能基一般是季胺基，阳离子交换色谱的固定相一般为磺酸基。

2.5检测器

离子色谱仪检测器分为2大类，即电化学检测器和光学检测器。

电化学检测器包括电导、支流安培、脉冲安培和积分安培；光学检测器包括紫外-可见和荧光。

常用检测器是电导检测器，分为抑制型和非抑制型2种。

离子交换色谱仪常用抑制型电导检测器。

抑制器是电导检测器的关键部件。

其主要作用是：

降低背景电导，增大溶质电导；在线产生再生剂；显著提高电导检测器的灵敏度和选择性。

其发展经历了四个阶段：

树脂填充抑制器、纤维膜抑制器、平板微膜抑制器、高抑制容量的电解和微膜结合的自动连续工作的抑制器。

电导检测器基本原理：

离子的摩尔电导与浓度成正比关系。

常见离子摩尔电导率（见表）。

2.6数据处理系统

色谱工作站

2.7影响离子色谱分离的主要因素

填料（功能基团种类、粒径及其分布）

柱温（室温－800C）

流动相组成与浓度

流动相流速（通常使用0.5-2.0mL/min）

流动相中的杂质成分

3实验技术

3.1样品预处理

在分析实际样品时，常会出现令人不满意的结果，其原因主要来自样品的基体。

有的组分不可逆地保留在柱上，使柱效降低或完全失效。

样品预处理的目的主要是将样品转变成水溶液或水与极性有机溶剂（甲醇、乙月青等）的混合溶液；减少和除去干扰物；减少基体浓度；浓缩和富集待测成分，使之符合IC进样的要求，得到准确结果。

常用样品预处理方法（只介绍化学法）：

IC法灵敏度较高，一般用较稀的样品溶液。

对未知液体样品，最好先稀释100倍后进样，再根据所得结果选择适当稀释倍数，可减少超柱容量和强保留组分对柱子的污染。

进样时须过滤除去颗粒物，用过滤器时必须事先洗净，待得到满意的空白后再用。

若样品中含有有机污染物，最方便而有效的方法是将样品通过预处理柱。

对有机物含量较高的工业污水，应先用有机溶剂萃取除去大量有机物，再通过预言处理柱。

对固体样品，常用的方法是用水或淋洗液提取，若溶解不完全或溶解速度很慢，可在超声波或微波处理下用水或淋洗液提取。

除化学法外，还有在线浓缩富集的方法（不细讲）。

3.2进样技术

手工进样、自动进样。

3.3固定相制备技术

球形、均匀的基质颗粒；

分析填料：

3－7um；制备填料：

20－40um

功能修饰：

键合与包覆（附聚）

柱填充技术：

高压、匀降

柱尺寸：

微柱（<1mm）、半微柱（1-3mm）

新技术：

整体柱,有序介孔材料

3.4淋洗技术

淋洗液流速：

流速和保留时间之间存在反比关系。

增加流速，可缩短保留时间，提高分析速度；降低流速，可使保留时间延长，优点是改善分离效果。

淋洗液的选取：

抑制型电导检测阴离子交换色谱常用流动相

阴离子交换色谱中，淋洗液类型和浓度主要由是否用抑制器来决定，而阳离子交换色谱中，此先决条件不是必须的。

对碱金属、铵、小分子脂肪族胺的分离，一般选用盐酸或硝酸，常用浓度2～40mmol/L，若淋洗液浓度太大，会导致高的背景电导，降低用电导检测碱土金属离子的灵敏度。

对碱金属和碱土金属的常规分析，推荐的分离柱是CS12柱，其色谱条件见图，一次进样能同时分析碱金属、碱土金属和铵。

3.5抑制技术

作用：

降低淋洗液背景电导，增加被测离子电导值，从而提高灵敏度。

如图：

图中样品为阴离子F-、Cl-、SO42-的混合溶液，淋洗液为NaOH。

若样品经分离柱后的洗脱液直接进入电导池，则得到图中右上部色谱图，图中非常高的背景电导来自淋洗液NaOH，被测离子的峰很小，即信噪比不好，一个大的系统峰（与样品中阴离子对应的阳离子）在F-峰前面。

当洗脱液通过抑制器后再进入电导池，则得到图中右下部的色谱图。

在抑制器中，淋洗液的OH-与H+结合成水，样品离子在低电导背景的水溶液中进入电导池，而不是高背景的NaOH溶液；被测离子的反离子（此处是阳离子）与淋洗液中的Na+一同进入废液，因而消除了大的系统峰。

溶液中与样品阴离子对应的阳离子转变成了H+，由于电导检测器是检测溶液阴离子和阳离子的电导总和，而在阳离子中，H+的摩尔电导最高，因此样品阴离子与H+的摩尔电导总和大大提高，从而提高灵敏度。

效果：

灵敏度提高1－2个数量级。

抑制剂（再生液）的提供（外加、在线电解）。

目前最先进的抑制器是美国Dionex公司生产的SRS型抑制器，它是微膜抑制器的改进和完善。

3.6无机阴离子分析

淋洗液：

一般情况下，只要弱酸在pH＞8时能以阴离子形式存在，其阴离子对固定相具有适当亲和力，这种弱酸的盐就可用作淋洗液。

见“3.4淋洗技术”。

有机改进剂：

有机溶剂可调节离子交换过程的选择性，改变分离柱对分析物的保留特性，从而改变洗脱顺序、峰效和分离度；可改善样品的溶解性，扩大IC的应用范围；使分离柱被有机物污染后的清洗成为可能。

若在较长的洗脱时间来改善分离度，则应选用含有甲醇的淋洗液；为了缩短保留时间，则应选用乙腈（见图）。

无机阴离子的洗脱顺序：

决定离子对固定相的亲和力有水合离子半径和离子的价数。

一般情况下，保留时间随水合离子半径的增加而增加；离子的价数越高，保留越强。

离子交换色谱分离的无机阴离子（见表）。

典型阴离子分离柱的应用，见表。

3.7无机阳离子分析

淋洗液：

对碱金属、铵、小分子脂肪族胺的分离，一般选用盐酸或硝酸，常用浓度2～40mmol/L。

4仪器维护

4.1分析泵常见故障与排除

离子色谱仪用分析泵要求：

（1）输出压力高，压力通常在7～21MPa之间，考虑到与液相色谱的兼容，泵的输出压力应不低于35MPa。

（2）耐腐蚀。

（3）流量稳定。

（4）良好的密封性等。

淋洗液脱气与泵内气泡排除：

仪器初次使用或更换淋洗液时，管路中的气泡易进入泵内，造成系统压力和流量不稳定，同时分析泵马达为维持系统压力平衡而加快运转产生噪音。

已经进入泵内的气泡，可通过启动阀排除。

具体做法：

先停泵，用一个10mL注射器在启动阀处向泵内注射去离子水或淋洗液，可反复几次直到气泡排除为止，然后再将泵启动。

漏液：

泵漏液时，仪器无法工作。

泵密封圈属易耗品，正常使用情况下每6至12个月更换一次。

为延长密封圈寿命，在使用了浓度较高的碱以后，要用去离子水清洗泵头部分，以防产生沉淀物。

系统压力升高：

在系统压力超过正常压力30%以上时，可认为该系统压力不正常。

保护柱的滤片因有物质沉积而使压力升高，更换滤片；某段管子堵塞造成系统压力突然升高，逐段检查，更换；室温较低时，系统压力升高，设法使室温保持在15℃以上；流量过高，压力升高，应按要求设定流量。

4.2检测器常见故障及排除

性能良好的检测器其基线噪音在较高灵敏度时仍能保持很小。

电导池内产生气泡会使基线噪音增大，可通过增加出口反压和向池内注射乙醇或异丙醇除去。

电导池被玷污也会造成噪音增加，可用酸清洗电导池。

4.3色谱柱常见故障

柱压升高：

色谱柱过滤网板被玷污，需更换，更换时注意不可损失柱填料。

柱接头不能拧的过紧，不漏液即可，拧得过紧会使输液管断口变形。

分离度降低：

改善分离度，要综合考虑组分对交换树脂的亲和力、离子半径、离子价态等因素。

死体积增大：

注意色谱柱的pH应用范围；若分离柱入口处出现空隙，可填充一些惰性树脂球以减小死体积的影响。

保留时间缩短或延长：

仪器某部分可能漏液，拧紧接头；系统内有气泡使得泵不能按设定的流速传送淋洗液，排除气泡；可能是抑制器的问题（见4.4节）；使用NaOH淋洗时空气中CO2的影响，可采用50%NaOH储备液，使用预先经过脱气的水配制，配好的淋洗液用氦气或高纯氮气保护。

4.4抑制器常见故障

抑制器常见故障是峰面积减小、背景电导升高和漏液。

峰面积减小：

微膜充分水化，做法是，用注射器向阴离子抑制器内以淋洗液流路相反的方向注射0.2mol/L硫酸（阳离子抑制器用0.2mol/LNaOH溶液），同时向再生液进口注入少许去离子水，恢复离子交换功能。

微膜充分水化之前，应避免用高压泵直接泵溶液进入抑制器。

抑制器内玷污的金属离子用草酸清洗。

背景电导升高：

若背景电导高，说明抑制器部分存在一定问题，绝大多数是操作不当造成，如流路堵塞或无溶液流动等；膜被污染，需更换新的抑制器。

漏液：

微膜须充分水化，保证再生液出口顺畅。

4.5色谱柱的保存

大多数阴离子分离柱在碱性条件下保存，阳离子分离柱在酸性条件下保存。

长时间保存时，先按要求向柱内泵入保存液，然后将柱子从仪器上取下，用无孔接头将柱子两端堵住后放在通风干燥处保存。

短时间不使用，每周至少开机一次，让仪器运行1至2小时。

4.6抑制器的保存

微膜抑制器应使其内部保持潮湿的环境。

使用前应充分水化。

从仪器上取下的抑制器必须用无孔接头将所有接口堵住，以防内部干燥。

4.7色谱柱与抑制器的清洗

色谱柱清洗前，应将系统中的保护柱取下，并连接到分离柱之后，但色谱柱流动方向不变。

这样做的目的是防止保护柱内的污染物冲至相对清洁的分离柱内。

将分离柱与系统分离让废液直接排出。

每次清洗后用去离子水冲洗10分钟以上，再用淋洗液平衡系统。

清洗时的流速不宜过快，最好在1毫升/分钟以下。

清洗亲水性离子和铝可使用1～3mol/L盐酸；清洗阴离子分离柱上的金属如铁，使用0.1mol/L草酸；清洗色谱柱内的有机污染物常用甲醇或乙腈，但对带有羧基的阳离子分离柱要避免使用甲醇。

抑制器清洗：

化学抑制型离子色谱抑制器长时间使用后性能会有所下降。

清洗时使溶液由分析泵直接进入抑制器，然后从抑制器排至废液。

液体流动的方向是：

分析泵抑制器淋洗液进口淋洗液出口再生液进口再生液出口废液。

酸可溶的沉淀物和金属离子，阴离子抑制器使用配制于1mol/L盐酸中的0.1mol/LKCl清洗；阳离子抑制器用1mol/L甲烷磺酸清洗。

有机物，阴离子抑制器使用配制于10%1mol/L盐酸和90%乙腈溶液清洗；阳离子抑制器用10%1mol/L甲烷磺酸和90%乙腈溶液清洗。

5应用领域

应用领域主要应用对象

环境大气成分（粉尘、颗粒物、雾、酸气）、酸雨、

水质分析、空气水质自动检测

食品生鲜、果菜、酒、饮料、纯净水分析、酿造过程监控

农业农药、肥料、土壤、饲料、粮食、植物分析

生物医学血液、尿、输液成分、临床检查、人体微量元素分析

制药植物药材、矿物药成分、制剂成分分析

材料金属材料、半导体材料、表面处理、超纯水分析

工业原料分析、产品质量控制、电解电镀液解析、造纸

化工原料和产品分析、反应过程监控

日化化妆品、洗涤剂、清洁剂、原料和产品成分分析

重点介绍：

在环境领域、食品分析、生化分析中的应用。