生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版.docx

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生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版

生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段学案（人教版）

课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段

问题导学

一、PCR的原理

活动与探究1

1．细胞内DNA复制需要的基本条件有哪些？

该条件在DNA复制中起何作用？

2．什么是引物？

它有什么特点？

用于PCR的引物一般长度是多少？

3．讨论：

DNA合成的方向有什么特点？

两条子链的合成起始于DNA的同一端吗？

4．PCR技术中，高温能使DNA双链解旋，但也会导致DNA聚合酶失活，如何解决？

迁移与应用1

PCR过程中起催化作用的酶是（）。

A．解旋酶B．RNA聚合酶

C．TaqDNA聚合酶D．DNA连接酶

细胞内DNA复制与PCR技术的比较

细胞内DNA复制PCR

不

同

点解旋解旋酶催化，部分解旋解链95℃高温解旋解链，双链完全分开

酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶TaqDNA聚合酶

能量ATP不加

温度体内温和条件95℃→55℃→72℃

特点整个DNA复制，只在分裂间期复制一次目的基因片段，按需要无限扩增

相同点①需DNA模板；②需脱氧核苷酸作原料；③子链延伸方向都是从5′端到3′端；④都遵循碱基互补配对原则，半保留复制

注：

解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键的。

二、PCR的反应过程

活动与探究2

1．PCR一般要经历30多次循环，每次循环可以分为哪几步？

2．PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？

3．PCR循环过程中，变性温度设置94℃，时间设置30s的原因是什么？

4．PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分？

5．当PCR反应体系的温度由变性后缓慢冷却到50℃左右时，引物与模板可结合，而解开的两个DNA模板链能够重新结合吗？

为什么？

6．PCR过程中的DNA聚合酶能对最初的DNA模板进行完整的复制吗？

为什么？

7．决定PCR反应特异性的原因有哪些？

迁移与应用2

利用PCR技术扩增某DNA片段得到下图所示产物，则该产物至少经过几次循环才能产生？

（）

A．1次B．2次

C．3次D．4次

1．PCR反应过程图解

（1）变性：

当温度上升到90℃以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：

（2）复性：

系统温度下降至55℃时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，如下图：

（3）延伸：

当系统温度上升至72℃左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：

2．PCR过程的温度条件和时间控制

变性复性延伸

预变性94℃，5min——

30次94℃，30s55℃，30s72℃，1min

最后一次94℃，1min55℃，30s72℃，1min

三、PCR实验操作和结果分析评价

活动与探究3

1．讨论PCR实验过程中有哪些注意事项。

2．如何判断DNA扩增成功？

迁移与应用3

PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（）。

A．反复洗涤B．用酒精擦洗

C．高压灭菌D．在－20℃下储存

1．PCR体外扩增DNA片段的实验流程

准备按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上

移液用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分

混合盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁

离心将微量离心管放在离心机上，离心约10s。

目的是使反应液集中在离心管底部

反应将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应：

变性―→复性―→延伸

2．实验中DNA含量的测定

DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。

可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：

（1）稀释：

2μLPCR反应液，加入98μL蒸馏水，即将样品进行50倍稀释

（2）对照调零：

以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的读数调节至零

（3）测定：

取DNA稀释液100μL至比色杯中，测定260nm处的光吸收值

（4）计算：

DNA含量（μg/mL）＝50×（260nm的读数）×稀释倍数

3．几种PCR方法

有反转录PCR、扩增未知序列的PCR、致突变PCR、定量PCR、免疫PCR等方法，PCR还可与其他方法联合使用，有很多新的联合法。

（1）反转录PCR

反转录PCR就是把RNA提取后反转录成互补DNA，并以此互补DNA链为模板进行的PCR反应。

通常用于检测某种RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平。

（2）实时荧光定量PCR

所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。

在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR的进行，PCR产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。

每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。

（3）免疫PCR

免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。

答案：

课前•预习导学

【预习导引】

一、1．体外DNADNA拷贝

2．解旋DNA母链脱氧核苷酸DNA聚合

预习交流1：

提示：

DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从3′端延伸DNA链。

因此，DNA复制需要引物，DNA的合成方向总是从子链的5′端向3′端延伸。

3．80～100℃双螺旋双链变性降低双链

4．缓冲DNA两条模板链引物脱氧核苷酸TaqDNA聚合温度

二、1．变性90℃解旋95

2．复性50℃两种碱基互补配对55

3．延伸72℃TaqDNA聚合酶

预习交流2：

（1）提示：

DNA分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一段子链，随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也不断延伸，同时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。

（2）提示：

PCR在高温条件下（90～100℃）解旋，而细胞内的DNA在解旋酶的作用下解旋。

三、1．温度3恒温水浴锅

2．塑料管0.5mL

3．微量移液器

四、1．外源DNA高压灭菌

2．分装成小份－20℃

3．枪头更换

预习交流3：

提示：

是用塑料加工制作的。

课堂•合作探究

【问题导学】

活动与探究1：

1．提示：

细胞内DNA复制需要的基本条件和作用分别是：

（1）解旋酶：

打开DNA双链。

（2）DNA母链：

提供DNA复制的模板。

（3）4种脱氧核苷酸：

合成子链的原料。

（4）DNA聚合酶：

催化合成DNA子链。

（5）引物：

使DNA聚合酶能够从引物的3′端开始连接脱氧核苷酸。

2．提示：

引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。

用于PCR的引物长度通常为20～30个核苷酸。

3．提示：

（1）DNA的羟基末端称为3′端，磷酸基团的末端称为5′端，且DNA的一条链为3′→5′，另一条互补链为5′→3′，即DNA的两条链是反向的。

（2）DNA合成的方向总是从子链的5′端向3′端延伸（即沿母链的3′→5′），所以两条子链的合成分别起始于DNA的两端。

4．提示：

寻找和使用耐高温的DNA聚合酶。

迁移与应用1：

C解析：

PCR技术解旋过程是利用了95℃高温使DNA变性解旋；RNA聚合酶是转录过程所需的酶；DNA连接酶是基因工程和DNA体内复制所需的酶；PCR技术延伸中所用的酶是TaqDNA聚合酶。

活动与探究2：

1．提示：

每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。

2．提示：

预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。

3．提示：

变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。

4．提示：

由于缓冲液为DNA的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。

5．提示：

不能。

（1）模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。

（2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于两个DNA模板链之间的碰撞机会。

（3）加入的引物的量较大，而模板数量少。

6．提示：

不能。

第一次循环时，只能从引用结合的部位开始。

由引物Ⅰ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅱ结合，进行DNA的延伸，由引物Ⅱ延伸而成的DNA单链会与引物Ⅰ结合，进行DNA的延伸之后，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。

7．提示：

（1）待扩增DNA片段的特异性。

（2）引物与模板特异性地结合。

（3）碱基互补配对原则。

（4）耐高温的TaqDNA聚合酶的催化作用具有专一性。

迁移与应用2：

B解析：

PCR技术中，第一次循环产生两个DNA分子，每个DNA分子只有一条链具有引物。

第二次循环产生四个DNA分子，其中两个DNA分子只有一条链具有引物，另两个DNA分子两条链都具有引物。

活动与探究3：

1．提示：

（1）避免外源DNA污染：

所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌。

（2）缓冲液和酶分装成小份，－20℃低温保存。

（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。

（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。

2．提示：

（1）教材中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。

（2）电泳检测的方法，可以通过在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。

迁移与应用3：

C解析：

为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。

PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在－20℃下储存。

使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。

当堂检测

1．下列有关PCR的描述，不正确的是（）。

A．是一种酶促反应

B．引物决定扩增的特异性

C．扩增的对象是氨基酸序列

D．扩增的对象是DNA序列

答案：

C解析：

PCR是特异扩增两个引物间的脱氧核苷酸序列，而不是氨基酸序列。

2．引物长度通常为20～30个核苷酸的一段（）。

A．DNAB．RNA

C．DNA或RNAD．双链DNA

答案：

C解析：

DNA复制过程均需要引物的参与，引物是一小段RNA或DNA。

3．PCR利用了DNA的什么原理，来控制DNA的解聚与结合？

（）

A．特异性B．稳定性

C．热变性D．多样性

答案：

C解析：

PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。

4．PCR过程中的复性是指（）。

A．在90℃以上时，两条DNA单链通过碱基互补配对形成DNA双螺旋

B．在50℃左右，两条DNA单链通过碱基互补配对形成DNA双螺旋

C．在90℃以上时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

D．在50℃左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合

答案：

D解析：

PCR过程中的复性发生在50℃左右的低温条件下，指引物与单链DNA的结合，不是两条单链DNA的结合。

5．标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（）。

A．94℃、55℃、72℃B．72℃、50℃、94℃

C．50℃、94℃、72℃D．80℃、50℃、72℃

答案：

A解析：

当温度上升到90℃以上时，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA，称之为变性；当温度下降到50℃左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度回升到72℃左右时（TaqDNA聚合酶的最适反应温度），在单链上4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则连接在引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链，称为延伸。

用流程图表示PCR的操作步骤。