生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版.docx

1、生物选修一52多聚酶链式反应扩增DNA片段学案人教版生物选修一5.2多聚酶链式反应扩增DNA片段学案（人教版）课题2多聚酶链式反应扩增DNA片段问题导学一、PCR的原理活动与探究11细胞内DNA复制需要的基本条件有哪些？该条件在DNA复制中起何作用？2什么是引物？它有什么特点？用于PCR的引物一般长度是多少？3讨论：DNA合成的方向有什么特点？两条子链的合成起始于DNA的同一端吗？4PCR技术中，高温能使DNA双链解旋，但也会导致DNA聚合酶失活，如何解决？迁移与应用1PCR过程中起催化作用的酶是（）。A解旋酶BRNA聚合酶CTaqDNA聚合酶DDNA连接酶细胞内DNA复制与PCR技术的比较细

2、胞内DNA复制PCR不同点解旋解旋酶催化，部分解旋解链95高温解旋解链，双链完全分开酶解旋酶、DNA聚合酶、DNA连接酶TaqDNA聚合酶能量ATP不加温度体内温和条件955572特点整个DNA复制，只在分裂间期复制一次目的基因片段，按需要无限扩增相同点需DNA模板；需脱氧核苷酸作原料；子链延伸方向都是从5端到3端；都遵循碱基互补配对原则，半保留复制注：解旋酶的作用是使DNA两条链的氢键断开，而DNA聚合酶都是催化形成磷酸二酯键的。二、PCR的反应过程活动与探究21PCR一般要经历30多次循环，每次循环可以分为哪几步？2PCR循环之前，常要进行一次预变性，预变性的目的是什么？3PCR循环过程中

3、，变性温度设置94，时间设置30s的原因是什么？4PCR缓冲液相当于细胞内的什么成分？5当PCR反应体系的温度由变性后缓慢冷却到50左右时，引物与模板可结合，而解开的两个DNA模板链能够重新结合吗？为什么？6PCR过程中的DNA聚合酶能对最初的DNA模板进行完整的复制吗？为什么？7决定PCR反应特异性的原因有哪些？迁移与应用2利用PCR技术扩增某DNA片段得到下图所示产物，则该产物至少经过几次循环才能产生？（）A1次B2次C3次D4次1PCR反应过程图解（1）变性：当温度上升到90以上时，双链DNA解旋为单链，如下图：（2）复性：系统温度下降至55时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结

4、合，如下图：（3）延伸：当系统温度上升至72左右时，溶液中的四种脱氧核苷酸（A、T、G、C）在DNA聚合酶的作用下，据碱基互补配对原则合成新的DNA链，如下图：2PCR过程的温度条件和时间控制变性复性延伸预变性94，5min30次94，30s55，30s72，1min最后一次94，1min55，30s72，1min三、PCR实验操作和结果分析评价活动与探究31讨论PCR实验过程中有哪些注意事项。2如何判断DNA扩增成功？迁移与应用3PCR实验中使用的微量离心管、缓冲液以及蒸馏水使用前必须进行的关键步骤是（）。A反复洗涤B用酒精擦洗C高压灭菌D在20下储存1PCR体外扩增DNA片段的实验流程准备

5、 按照PCR反应体系的配方将所需试剂摆放于实验桌上 移液 用微量移液器按照配方在微量离心管中依次加入各组分 混合 盖严离心管口的盖子，用手指轻轻弹击管壁 离心 将微量离心管放在离心机上，离心约10s。目的是使反应液集中在离心管底部 反应 将离心管放入PCR仪中，设置程序进行反应：变性复性延伸 2实验中DNA含量的测定DNA在260nm的紫外线波段有一强烈的吸收峰，峰值的大小与DNA的含量有关。可以利用DNA这一特点进行DNA含量的测定，具体方法如下：（1）稀释：2LPCR反应液，加入98L蒸馏水，即将样品进行50倍稀释（2）对照调零：以蒸馏水作为空白对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计的

6、读数调节至零（3）测定：取DNA稀释液100L至比色杯中，测定260nm处的光吸收值（4）计算：DNA含量（g/mL）50（260nm的读数）稀释倍数3几种PCR方法有反转录PCR、扩增未知序列的PCR、致突变PCR、定量PCR、免疫PCR等方法，PCR还可与其他方法联合使用，有很多新的联合法。（1）反转录PCR反转录PCR就是把RNA提取后反转录成互补DNA，并以此互补DNA链为模板进行的PCR反应。通常用于检测某种RNA是否被表达，或者比较其相对表达水平。（2）实时荧光定量PCR所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物的荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定

7、性的分析。在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR的进行，PCR产物不断累积，荧光信号强度也等比例增加。每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。（3）免疫PCR免疫PCR是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。答案：课前预习导学【预习导引】一、1体外DNADNA拷贝2解旋DNA母链脱氧核苷酸DNA聚合预习交流1：提示：DNA聚合酶不能从头合成DNA，只能从3端延伸DNA链。因此，DNA复制需要引物，DNA的合成方向总是从子链的5端向3端延伸。380100双螺

8、旋双链变性降低双链4缓冲DNA两条模板链引物脱氧核苷酸TaqDNA聚合温度二、1变性90解旋952复性50两种碱基互补配对553延伸72TaqDNA聚合酶预习交流2：（1）提示：DNA分子首先在解旋酶的作用下解旋，然后以解开的每一段母链为模板，在DNA聚合酶等酶的作用下合成与母链碱基互补的一段子链，随着模板链解旋过程的进行，新合成的子链也不断延伸，同时，每条新链与其对应的模板链盘绕成双螺旋结构。（2）提示：PCR在高温条件下（90100）解旋，而细胞内的DNA在解旋酶的作用下解旋。三、1温度3恒温水浴锅2塑料管0.5mL3微量移液器四、1外源DNA高压灭菌2分装成小份203枪头更换预习交流3：

9、提示：是用塑料加工制作的。课堂合作探究【问题导学】活动与探究1：1提示：细胞内DNA复制需要的基本条件和作用分别是：（1）解旋酶：打开DNA双链。（2）DNA母链：提供DNA复制的模板。（3）4种脱氧核苷酸：合成子链的原料。（4）DNA聚合酶：催化合成DNA子链。（5）引物：使DNA聚合酶能够从引物的3端开始连接脱氧核苷酸。2提示：引物是一小段DNA或RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为2030个核苷酸。3提示：（1）DNA的羟基末端称为3端，磷酸基团的末端称为5端，且DNA的一条链为35，另一条互补链为53，即DNA的两条链是反向的。（2）DNA合成的方

10、向总是从子链的5端向3端延伸（即沿母链的35），所以两条子链的合成分别起始于DNA的两端。4提示：寻找和使用耐高温的DNA聚合酶。迁移与应用1：C解析：PCR技术解旋过程是利用了95高温使DNA变性解旋；RNA聚合酶是转录过程所需的酶；DNA连接酶是基因工程和DNA体内复制所需的酶；PCR技术延伸中所用的酶是TaqDNA聚合酶。活动与探究2：1提示：每次循环可以分为变性、复性和延伸三步。2提示：预变性的目的是增加大分子模板DNA彻底变性的概率。3提示：变性温度过低，解链不完全导致DNA不能扩增，变性温度过高影响酶的活性；在此温度条件下如果处理时间过长，将会导致酶的钝化。4提示：由于缓冲液为DN

11、A的复制提供场所，相当于细胞内DNA复制的场所，所以缓冲液相当于核基质。5提示：不能。（1）模板DNA链比引物长得多而且复杂得多，不易重新结合。（2）引物和模板之间的碰撞机会远远高于两个DNA模板链之间的碰撞机会。（3）加入的引物的量较大，而模板数量少。6提示：不能。第一次循环时，只能从引用结合的部位开始。由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸，由引物延伸而成的DNA单链会与引物结合，进行DNA的延伸之后，DNA聚合酶只能特异地复制处于两个引物之间的DNA序列，使这段固定长度的序列呈指数扩增。7提示：（1）待扩增DNA片段的特异性。（2）引物与模板特异性地结合。（3）碱基互补

12、配对原则。（4）耐高温的TaqDNA聚合酶的催化作用具有专一性。迁移与应用2：B解析：PCR技术中，第一次循环产生两个DNA分子，每个DNA分子只有一条链具有引物。第二次循环产生四个DNA分子，其中两个DNA分子只有一条链具有引物，另两个DNA分子两条链都具有引物。活动与探究3：1提示：（1）避免外源DNA污染：所用仪器、缓冲液、蒸馏水等使用前必须进行高压灭菌。（2）缓冲液和酶分装成小份，20低温保存。（3）每添加一种反应成分，更换一个移液器的枪头。（4）混匀后离心处理，使反应液集中在离心管底部。2提示：（1）教材中的方法，可以通过计算DNA含量来评价扩增的效果。（2）电泳检测的方法，可以通过

13、在紫外线下直接观察DNA带的分布及粗细程度来评价扩增的效果。迁移与应用3：C解析：为了避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头、缓冲液以及蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌。PCR所用的缓冲液和酶应分装成小份，并在20下储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。当堂检测1下列有关PCR的描述，不正确的是（）。A是一种酶促反应B引物决定扩增的特异性C扩增的对象是氨基酸序列D扩增的对象是DNA序列答案：C解析：PCR是特异扩增两个引物间的脱氧核苷酸序列，而不是氨基酸序列。2引物长度通常为2030个核苷酸的一段（）。ADNABRNACDNA或RNAD双链DNA答案：

14、C解析：DNA复制过程均需要引物的参与，引物是一小段RNA或DNA。3PCR利用了DNA的什么原理，来控制DNA的解聚与结合？（）A特异性B稳定性C热变性D多样性答案：C解析：PCR利用了DNA的热变性原理，通过控制温度来控制双链的解聚与结合。4PCR过程中的复性是指（）。A在90以上时，两条DNA单链通过碱基互补配对形成DNA双螺旋B在50左右，两条DNA单链通过碱基互补配对形成DNA双螺旋C在90以上时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合D在50左右，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合答案：D解析：PCR过程中的复性发生在50左右的低温条件下，指引物与单链DNA的结合，不是两条单链DNA的结合。5标准的PCR过程一般分为变性、复性、延伸三大步，这三大步需要的温度依次是（）。A94、55、72B72、50、94C50、94、72D80、50、72答案：A解析：当温度上升到90以上时，作为模板的双链DNA解旋成为单链DNA，称之为变性；当温度下降到50左右时，两种引物通过碱基互补配对与两条单链DNA结合，称为复性；当温度回升到72左右时（TaqDNA聚合酶的最适反应温度），在单链上4种脱氧核苷酸按照碱基互补配对原则连接在引物之后，使引物链延伸，形成互补的DNA双链，称为延伸。用流程图表示PCR的操作步骤。