莫西沙星方法开发.docx

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莫西沙星方法开发

作为一个制造和销售AnalyticalQbD软件的公司的代表，我经常能够有机会帮助到一些药物研发机构设计，建立或者改进一些分析方法。

莫西沙星的有关物质的分析方法的研究是2018年8月份间发生的一个故事。

分享给更多的制药公司的分析工作者，以期共同进步。

这个课题是莫西沙星的有关物质的方法开发。

有关物质如图1。

图1莫西沙星的有关物质

对莫西沙星进行结构进行分析（应用我们ACD公司的pKa预测分析工具），其结构上的最强碱性pKa为8.7，而最强酸性pKa是6.3（可能受共轭系统的影响很大）如图2，其他的芳香性的N原子，碱性很弱。

图2莫西沙星的pKa分析

但对应的药典方法，则令我感到困惑，如图3。

体系里使用了1苯基柱2四丁基硫酸氢盐的离子对0.5g/L，pH为2磷酸缓冲体系

图3莫西沙星的某药典的方法

这里面稍作分析就觉得可疑：

1pH为2时，整个莫西沙星以及有关物质多数都带一个单位的正电荷，用带永久正电荷的四丁基铵是做什么用呢？

有关物质列表里没有带负电荷的高极性物质存在，明显不合理。

2色谱柱是苯基柱，四丁基铵很难像和C18柱作用那用形成暂时的吸附，如图4，四丁基铵多数会在体系里游离，而不是吸附在固定相的顶部。

图4苯基柱和四丁基铵离子对是不融洽的

在最终的分析方法中，这个令人不解的离子对还是被去掉了。

现在分析一下，可能药典方法的开发者对结构中的羧基的pKa有错误的判断认为其酸性很强pKa

很低，所以用四丁基铵来做对离子。

但是在pH=2来使用还是令人费解，因为羧酸的离子化不完全，离子对的效应没有完全体现，会令整个方法的耐用性很差，随pH变动，保留时间发生变动。

总体来讲，这个离子对的增加是一个败笔。

将众多的化合物的结构在ACDAutoChrom的pHselector下进行分析，如图5所示，众多有关物质的疏水性是接近的（logD线相互靠近），而且极性偏大。

进行色谱柱的挑选，除了苯基柱之外，具有良好的氢键保留能力以及空间选择性的C18柱也是可选的对象。

图5pHselector来查看疏水性的分布以及选择pH的平台期

当然，如果这个药典方法在分离上没有问题，恐怕国内也没有哪个团队说因为一个不合理的离子对的使用就把原来的药典方法推翻。

实际工作中是碰到了分离度不足的问题并且已经花费的较多的时间也难以解决，如图6

图6主峰与杂质A是关键Pair，基线也不令人满意

以上是AQbD工作的Knowledgespace部分，对物质的理解越多，接下来的工作可能会越顺畅吧。

我们还是再讨论一下这个离子对试剂：

四丁基硫酸氢铵。

我看到留言说四丁基铵是用来扫尾的，功能类似于二乙胺。

我认为不对，二乙胺的扫尾功能是主要用在A类色谱柱上，现在几乎都不用了，它体积比较小，其带电的N原子能进入基底裸露的硅醇基前，在硅醇基带负电的情况下与之发生正负离子互相吸引，令碱性化合物的正离子与硅醇羟基负离子互相吸引引起的拖尾减小。

而在本例中，pH=2，硅醇基都是分子态，如何吸引亲和？

显然不是这个功效。

另外四丁基铵的立体形态类似于一个锚，臂长N小位阻大，真正用它扫尾效果会远远不如二乙胺。

还有同仁说，四丁基铵是用来加快出峰的，这个说法很有意思。

在本例中我们碰到的情况是化合物不易保留，再用四丁基铵加快出峰，那又何必呢？

我们都知道，离子对是不能随便用的，用它次数越多，色谱柱就会被逐渐改性，就只能用于当前的项目，如果用于其他的项目，保留会有所变化，会给其他项目的开发带来很大的困扰。

在改性的色谱柱上开发的方法缺乏可重复性。

另外我们一直没有说这个盐的另一部分，硫酸氢根。

做为强电解质，在酸性条件下，硫酸根能够对碱性化合物的三角形局部过载峰有修饰作用，能够减少峰宽，改善对称性。

我们在肖柏明老师的报告上见过不同浓度氯化铵的在酸性条件下修饰苯胺峰型的例子，机理一致。

硫酸根带两个单位负电荷，实际效果还强于氯化铵。

而在项目的后期，为了修饰主峰的三角形态，我们用了高浓度的氯化铵。

我的合作伙伴告知我，她的团队已经筛选了3根不同厂家的苯基柱，都是在加离子对试剂的情况下筛选的，最好的结果如图6。

也筛选过其他的色谱柱例如C18柱，Agilent的SBC18似乎不错，但是苯基柱为主流，但后来C18拯救了这个项目。

由于有这个药典方法的存在，我们选了两条路径。

第一条路径是试图在这当前最好的方法的情况下去优化。

使用甲醇乙腈混合流动相，甚至向甲醇内加入异丙醇等操作都不能改变主峰和主峰后的化合物，如图7的分离度。

而原方法本身就是等度，等度都无法解决的分离度问题，梯度肯定不能有所帮助了。

图7主峰和与之难分离的对象的分子结构

而第二条路径就是重新开发一个方法，最后也只能走这条路。

前期的筛选工作也证实甲醇的选择性优于乙腈，而pH=2的磷酸buffer按照ACDpHselector来分析是没必要改动。

作为影响分离度的主要的三因子：

色谱柱，流动相的种类，pH目前已经锁定了两个。

而影响分离度的次要因子：

梯度（有机相的比例），温度，盐浓度等还有一些优化和探索的空间。

而考虑分离度之前，探索发现温度和盐浓度（强电解质氯化铵的浓度）都能够修饰峰型。

在较低的温度下，以及高浓度的氯化铵时，主峰峰型最佳。

因此研究的策略就可以设计为首先在旧有甲醇磷酸缓冲体系（离子对已经被摒除），pH=2下，用高浓度的氯化铵以及在低的柱温下先筛色谱柱，走一个较陡的梯度，如果峰型过关，分离度还不错的情况下，加做两针缓梯度，用ACDAutoChrom建立梯度模型，去评估在此色谱柱下分离度。

基本过程如下图8所示

图8影响因子的分析策略

设想，如果有柱筛选系统在手边，这个筛选工作会很方便，但在普通液相上就只能一根一根的试，然后用梯度建模的方式来快速找到某根色谱柱的极限，如图9-1初始陡梯度和图9-2优化后梯度。

  图9-1某苯基柱上初始陡梯度

图9-2某苯基柱上的优化后梯度

所有筛过的苯基柱都有共同的特点，靠近色谱峰底部色谱峰宽展宽很宽。

在图9-2中箭头处所指是两个已知杂质的共流出峰。

计划将之一起控制，但是还是考虑三角标记处的未知杂质峰的分离度不足，风险大而放弃。

由于我拒绝使用加过离子对试剂的色谱柱，实际上可用的苯基柱资源就比较有限。

考虑到化合物的极性比较大，除了苯基柱之外，偶然筛的一根C18柱带来了很大的惊喜。

三针梯度如下，图10

图10-1第一针

图10-2第二针

图10-3第三针

以上述三针建立模型，预测最优解如下，图11:

图11用ACDAutoChrom建模模拟获得C18色谱柱下的最优解的模拟图

经过确认，合作伙伴选择了当前的方法，完成了方法的验证，进入了工作的新的阶段。

总结一下经验：

1要从原理上理解药典方法，可以允许挑战它不合理的地方，改进和优化它

2莫名其妙的离子对方法可能是个坑

3在追求分离度之前要修好峰型

4应该买一台柱筛选系统，用好它

5 ACD的软件能够带来很多帮助，在本例中用有限的针数追求到了梯度因子的极限

最后再讨论一下药典方法的重现的策略作为故事的番外篇

重现药典的方法是很多仿制药公司的分析研发人员在做的事情，一般来说这个重现工作比较难。

日前还和一位分析研发同事交流，她说她们的QC部门只认药典方法，她只能不停的测试色谱柱，找到能满足条件的色谱柱，其他的条件不能动。

我说你放缓梯度或者等度降低有机相比例都有可能解决问题，筛到有苗头的色谱柱后拿时间换分离度就行了呗。

她说，这是不行的，QC不接受，QC和QR会打架的，这个受不了。

好嘛，这也算是很有原则的QC了，问题是这样真的好么，这会浪费多少的公司资源和QR的时间呢？

能够放入药典的内容，一定是有工作积累的。

也许耐用性很好，也许本身也是trialanderror来的。

不管怎样，在符合逻辑和科学设计的情况下，我们可以用色谱柱空间和多因子的方式综合评估它，用科学数据下一个科学的结论。

行还是不行，从实践来，到实践去。

如果药典方法本身没有严重的耐用性缺陷，重现药典方法的首要决定因素是色谱柱。

如果药典标明的色谱柱并没有提供足够的分离能力，那就去寻找其类似的色谱柱来筛选。

色谱柱的评判可以用USP的方法，也可以用ACD的基于TANAKA柱效测试的方法来比较，我们称之为ColumnSelector/Comparsion。

如下图12所示，色谱柱的保留能力，疏水选择性，立体选择性，氢键保留能力，电荷保留能力（碱性和酸性）可以分别评判和比较，权重建议设定为2，2，2，1，1，1。

这样即可找到差异度低或者说匹配度高的候选色谱柱。

如果是在酸性条件下进行试验，权重建议优化为2，2，2，1，0，1效果会更好。

图12类似柱的推荐，Distance越小替换性越高

如果类似柱的筛选都不足以解决问题。

但是发现有苗头的方法，实际上是可以进行微调，也应该允许微调。

如果原方法是做过耐用性研究的，这些调整的余地我认为不应被视为方法的改变。

因为在下表1里，以上的调整都在耐用性的验证的范围之内。

可以从方法优化的角度上去考虑，比如等度的话可以把有机相比例降低2-3%，梯度的话把时长延长10%-20%，温度的话降低2-3摄氏度。

这些都能够用时间来换取分离度。

表1耐用性验证测试表（来自Synder现代液相色谱导论第12章）

如果经过了以上的筛选和耐用范围内的微调依然不能奏效的话。

那就有理由认为这个方法质量不佳，缺乏可操作性，需要重新开发一个新的方法来控制风险。

我是推荐以上重现药典方法的策略可以形成一个SOP，如果条件允许，可以这个工作可以尽量的自动化，减少人的思考干扰，争取短时间就有所系统化判明。

行与不行都能够迅速进入下一个研究阶段。

当然如果原药典里的方法是离子对方法，考虑到离子对的破坏性，就要慎重一些。

上文说到QC部门不接受QR的自建方法也有其理由。

因为很多QR的自建方法由于各种时间紧任务重，很多都是trialanderror得来的。

温度略变动一下（室温变化），pH稍微低一点（配置可能不规范，多滴了一滴），换了仪器，或者同品牌仪器管路粗细长短变化了都能引起方法出问题。

QC自然会敬而远之。

以上的这些问题都应当在优化阶段加以确认而在验证阶段得到操作边界。

但是我还没见过国内的QR团队设计周密的方法耐用性验证，图13。

如果有了精密的验证，确认了方法的MODR，在MODR范围内的改变不是方法的改变，有了准确的边界，QC用起QR自建方法来也会放心。

用统计学软件进行方法耐用性实验的设计和验证，是很多BigPharma是必做的内容。

在国内还是只闻其名未见其实。

在方法筛选和方法优化没有做到位的情况下，用JMP这样的统计学去设计耐用性验证方案，那也是空中楼阁。

还是要踏踏实实地做好工作才行。

图13方法耐用性验证