冷冻病理学.docx

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冷冻病理学

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概述

冷冻治疗的实质是利用低温冷冻方法破坏病变组织，最后达到去除病变的目的。

冷冻所借助的手段就是通过反复的冻—融过程使病变组织坏死，这种坏死过程有别于一般坏死，其修复过程也有别于一般坏死后的修复过程，有其自身的特点；因此，了解冷冻后组织的病理变化特点有助于该治疗手段的合理应用。

虽然不同组织冷冻后的病理变化各有特点，但基本改变是类似的，故本章将选取一些代表性的组织冷冻后的病理改变的机制、超微结构、光镜下的形态改变作概要说明。

第一节冷冻致细胞损伤的机制和病理改变

一、冷冻损伤的机制

冷冻的作用主要就是使局部快速降温、冻结、复温，在此过程中产生一系列的病理变化，最终导致细胞受损而死亡。

由细胞内、外液中因冻结而分离出的纯水形成冰晶，并由此而产生的一系列变化是冷冻致组织损伤的重要机制。

冷冻治疗过程中还存在冷冻速度的区别，因此致细胞损伤的作用的机制可能也存在一些差别。

目前关于冷冻致细胞死亡的机制主要存在以下几种学说：

迅速的低温使细胞内外的水分形成冰晶，细胞脱水，细胞内电解质浓度增高，使脂蛋白复合体受到破坏，引起细胞膜的溶解损伤从而致细胞死亡；冷冻还可伤害线粒体中的光磷酸化作用，使三磷酸腺苷的合成发生不可逆性的裂解，造成细胞器膜的损害，而琥珀酸脱氢酶的活性有赖于线粒体膜的完整性，溶酶体膜的破坏可导致其中酶的释放，引起细胞的自溶，内质网、细胞核的膜均可在冷冻过程中发生破裂，而细胞可因细胞器的破坏而发生死亡；冷冻过程中由于细胞内外冰晶形成，可造成细胞内的脱水状态，体液浓缩，细胞内电解质浓缩，浓度达到有害的程度，同时酸碱度也随之改变，出现细胞酸中毒和代谢障碍，从而导致胞浆、胞膜、细胞内成分蛋白产生变形，进而导致细胞死亡；冷冻还可使细胞膜、蛋白等细胞成分中的结构水丢失，细胞因此失去功能而死亡；温度休克学说认为温度的急剧变化较绝对温度对细胞的杀伤作用更重要，这可能是由于细胞内组成成分缩胀比率不均衡以致细胞破裂的结果；组织冷冻后，血流速度减慢，这在小静脉表现的尤为明显，小静脉出现血流郁滞后，毛细血管的血流也就会出现障碍，继此之后，小动脉的血流也相应减少，最后同样发生郁滞，这种血流郁滞乃至造成微循环的阻断，另外，冷冻还可直接损伤毛细血管壁，使血小板和其他血细胞与损伤的血管壁黏附，在血管内形成血栓栓塞。

毛细血管腔出现阻塞后，则血流停止，组织细胞出现缺血性梗死。

冷冻后继发的组织细胞坏死还可能与冷冻后所引起的一系列生化反应有关。

冷冻致细胞死亡的机制可能与细胞凋亡有关。

凋亡是与坏死不同的另一种细胞死亡机制，它是一种耗能的主动的促细胞消亡的方式。

冷冻治疗脑胶质瘤的动物模型表明在冷冻灶的中心以坏死为主，而在冷冻灶周围则出现较多的TUNEL阳性的细胞，这种细胞出现的峰值时间是24~48h，并可延缓到冷冻后的72h，与冷冻致组织中细胞坏死的时间分布相一致。

上述研究表明凋亡可能是冷冻杀伤肿瘤细胞又一种机制。

有研究发现在冷冻致大鼠脑水肿的过程中，一氧化氮合酶（NOS）及一氧化氮（NO）在脑组织中浓度升高。

其可能的原因是由于冷冻致脑组织中一氧化氮合酶的活性升高，进而导致一氧化氮的浓度升高；高浓度的NO损伤了毛细胞血管及紧密连接，血—脑脊液屏障功能破坏，发生血管源性脑水肿；同时，由于大量NO使多种酶的活性改变，能量耗竭，导致细胞毒性脑水肿的发生。

NOS活性增加的可能原因是：

兴奋性氨基酸增加，激活NMDA/谷氨酸受体，NOS活性增加；由于冻伤时组胺、白三烯C4、血小板激因子等大量化学介质释放，进而激活NOS。

通过冷冻后大鼠血清中丙二醛（一种脂质过氧化产物）的监测，发现血清中丙二醛的变化规律与冻后的临床过程相吻合，说明脂质过氧化过程在冷冻损伤、修复过程中具有重要作用。

冷冻可以加强脂质过氧化过程，而脂质过氧化产生过多的自由基又可致组织损伤，进而产生更多的氧自由基。

自由基又促进脂质过氧化的形成，二者间存在相互促进的关系，共同加速对局部病变组织的损伤，达到治疗的目的。

二、冷冻后细胞的形态变化

由于冷冻后细胞内渗透压的升高，可造成细胞膜的收缩，引起膜相分离、膜萎缩；线粒体则可明显增大、基质密度减少、消失等多种变化；内质网可呈现出结构不清，张力原纤维失去成束状态而断裂和融合成斑块状；细胞核在冷冻后的变化最为明显，核内染色质可呈浓缩状态，分布不均，核内可见冰晶空泡，核膜可见破裂，还可观察到核固缩、核溶解等现象，整个核的面积缩小；有研究发现细胞冷冻后胞浆内的中间丝分布发生紊乱，原来着色均匀的细胞呈现出丝网状和斑块状，这间接反映了冷冻后细胞浆内各种成分的分布和排列发生紊乱；细胞连接在冷冻后也常发生破坏、变性、坏死。

这种细胞连接的改变具有重要的临床意义，冷冻能使血管内皮细胞紧密联结开放，同时血管通透性短期内迅速增加，导致抗癌药物能顺利进入瘤区，从而增加肿瘤组织内的药物浓度，提高其杀瘤作用，利用冷冻的这一效应，联合化疗药物治疗肿瘤在实践与理论上已取得了一定的进展。

三、冷冻后组织病理改变的特点

组织冷冻后数小时乃至24h已发生坏死，电镜检查冻—融后的细胞超微结构已出现明显改变，但坏死体征出现较晚；冷冻坏死灶境界清楚，修复力强，生理性愈合比较快；毛细血管堵塞，颇似淤血性梗塞；肿块缩小是冷冻破坏细胞膜导致细胞内外液丧失，乃至整个肿物缩小；炎性反应轻微，因冷冻死仅限于治疗局部，很少涉及其周围组织；自冷冻中心至其边缘部，光镜下所见几乎相同，均呈现一片坏死性变。

第二节冷冻后组织反应的一般规律

一、组织反应的三个阶段

（一）直接期

受冻部位由于“冻-融-冻”的结果，则产生均匀、柔软的边缘变化，明显的部分与其周围形成鲜明界限。

（二）延迟期

这是组织破坏的最后阶段（极限期），即产生冷冻组织坏死，逐渐发生于冻后数小时乃至3d间。

坏死组织的最终平滑结瘢见于1~2周之内。

这时的病检呈现明显的缺血性坏死。

到4~8周内获临床痊愈。

（三）晚期（免疫反应期）

已有研究表明，冷冻治疗恶性肿瘤后，患者体内的免疫球蛋白水平及细胞免疫水平上升，机体的免疫力上升。

冷冻前列腺原发癌使得骨组织转移消失以及食管癌经冷冻治疗后体内细胞免疫、部分体液免疫指标以及冷冻组织周围淋巴结的反应性增生的事实可能均与冷冻治疗有关；而化疗或手术治疗后机体的免疫力通常是下降的，这使得冷冻治癌具有独特的优势。

二、冷冻后坏死组织的修复过程

冷冻后的过程可分水肿期（继融解期后）、坏死期和恢复期（包括肉芽形成、结瘢期）三个不同时期。

受冻病灶以皮肤肿瘤为例，先有水疱形成，随后水疱消失而体积渐小，坏死灶则与周围健康细胞界限分明。

经过数天乃至2周，肉芽组织急剧增殖，然后结痂脱落而上皮化获愈。

如为粘膜，冻后首先出现肿胀，继有苔膜形成，以后的痊愈经过与皮肤相同。

结缔组织多的病灶，冻后仍有少许纤维组织残留，其下常有脓肿形成，冻后10d左右出现分界线，可将坏死组织切除，术中几乎无出血和疼痛反应。

总之，冷冻疗法很少引起组织缺损等不良后遗症，其修复创口比较合乎生理要求，瘢痕形成窄而浅，极少引起组织变形和机能障碍，这是本疗法的一大特征。

在家兔身上进行的肝冷冻实验指出，冷冻坏死部分可见少量肝组织再生填充，经过4周左右则有小纤维性瘢痕形成，5~6周变得很坚硬，探之感到困难。

第三节不同正常组织冷冻后的病理改变

一、上皮组织

皮肤组织经冷冻后，冻区皮肤肉眼观可呈现暗红色，连同周围组织都伴有轻度水肿，有的出现水泡；受冻部位先后还会出现液体渗出、肿胀等改变。

此后逐渐出现机体的修复反应。

受冻组织表面坏死后可形成痂皮，呈暗紫色或紫黑色，后逐渐缩小剥落，较早脱落处可露出肉芽创面。

有的干痂脱落处表面上皮化生；经3~4周后，干痂完全脱落，受冻创面完全愈合；以后会逐渐长出毛发等结构，直到与周围皮肤相似程度。

光镜下，冻后早期的皮肤标本可见到表层皮肤坏死，表面有痂皮形成。

皮肤和肌肉内有炎性细胞浸润。

之后，表面出现溃疡，部分表面伴有脓痂覆盖，真皮内有水肿、炎性细胞的浸润；浅层坏组织与其下健康的真皮组织之间有一层炎细胞浸润区，形成坏死组织的溃疡带。

同时，作为机体的修复反应，周围上皮已开始向冻区生长，表面干痂逐渐分离；4周后，上皮已完全修复冻后坏死区的溃疡面；6周后，皮肤结构恢复正常。

牙龈和唇粘膜也为上皮组织的一种，但对冷冻的反应同皮肤有所同，冻后2min后即迅速出现肿胀，唇粘膜肿胀较牙龈更明显。

以后肿胀逐渐消退。

冻区表面不平滑，有稍增厚而粗糙的坏死组织覆盖，有的因坏死组织较早脱落则稍凹陷，因口腔内潮湿的环境及进食、咀嚼活动的摩擦，故创面无痂皮覆盖，为红色肉芽创面；冻后约4周，粘膜基本恢复正常。

冻后24~48h的标本在电子显微镜下可观察到牙龈和唇粘膜的表层细胞有广泛坏死，大部分细胞核已溶化分解，细胞器消失，细胞内结构不清；还有的细胞破裂，胞质外溢。

棘细胞层及基底层细胞可见空泡变性、核固缩、核碎屑等改变，棘细胞层内细胞间桥清晰可见，细胞界限清楚。

在同一区域内，不同细胞间核的破坏程度也不同。

粘膜下层组织也有明显破坏，如细胞坏死、破碎、血管充血和纤维断裂等，粘膜下毛细血管内血小板增多，有血栓形成，管壁有破坏，血细胞外溢。

冻后1周，粘膜已处于修复期，主要表现为棘细胞生长活跃，核大、核仁多、细胞大。

基底细胞已为新生的正常细胞，排列整齐；上皮细胞结构已恢复正常，基底细胞内线粒体多，表明功能活跃，牙龈粘膜的表面角化层增厚。

粘膜下层纤维组织丰富，组织结构已基本恢复正常；随后，粘膜下层见有新生的细小神经纤维，髓鞘尚薄；冻后4周，牙龈上皮表层角化良好且厚，上皮细胞发育良好，基底膜恢复正常，粘膜下层有新生的神经纤维和结构正常的血管。

对兔的皮肤进行深低温冷冻研究发现，在冷冻后2h，局部出现潮红、水肿的改变，24h后出现大疱，48h后局部呈深红色，炎症范围扩大到冻区以外0.5cm，以后即出现糜烂、渗出、组织坏死、溃疡，1周后创面开始结痂、干燥，2周后痂皮开始脱落，创面愈合。

镜下，冷冻24h内，表皮明显水肿，海绵形成，空泡变性，部分表皮出现凝固性坏死，真皮组织水肿，成纤维细胞减少，有的胶原纤维有透明变性及灶状坏死，血管明显扩张；24h表皮下水疱形成，血管壁有不同程度的变性和坏死，并见红细胞外溢，48h更明显，真皮中有大量中性白细胞浸润，部分血管有血栓形成，管腔闭塞，冷冻后1周，冷冻边缘有显著的增生性改变，2周后开始愈合。

二、脉管组织

大血管具有抵抗冷冻破坏的作用，而小血管对冷冻的破坏作用较敏感，其中尤以毛细血管、小静脉的影响最重，而内皮细胞的病理改变在冷冻对脉管的损伤中起着关键性的作用。

以冷冻后兔的动静脉的病理改变为例。

冷冻后1h的标本中，见到动脉内皮细胞出现肿胀、突出，还有一部分细胞脱落，平滑肌染色性降低，结构上未见明显破坏现象，静脉的内皮细胞也有肿胀、突出并有部分破裂。

血管腔内见有凝固蛋白。

随后可观察到动静脉各层组织的破坏，表现为细胞核消失，管壁结构模糊；静脉壁破坏较明显，而动脉除内弹力膜未见明显破坏外，其余各层均可见破坏，毛细血管的内皮细胞则出现明显的肿胀、破坏和剥落，破坏更为明显。

在冻后短时内（2~3d），动静脉仍可见血液流动，而毛细血管则可见广泛的组织内出血，表明其管壁已有穿破。

坏死的动、静脉管壁引起炎细胞浸润，呈现脉管炎的征象。

晚期，静脉腔内可有血栓形成，呈退行性变，出现血流受阻情况，动脉也可出现类似变化，但有些动脉对冷冻的反应较迟缓，在冻后7~8周的标本中，仍可见到内皮细胞肿胀、突出，内膜增厚，中膜萎缩等状态，有的动脉因内膜特别增厚，使血管腔缩得很小，出现逐渐阻塞现象。

由于纤维结缔组织对冷冻比较耐受，因此具有丰富纤维组织的大动脉冷冻后不易发生梗阻，而静脉和毛细血管的管壁较薄，纤维组织少，易于受到破坏。

特别是毛细血管，因其主要结构就是内皮细胞，故最易受到破坏。

因此冷冻外科对一般由静脉和毛细血管结构组成的血管瘤治疗效果较好，而对由动脉血管组成的蔓状血管瘤则冷冻效果差。

三、神经组织

以冷冻后的面神经为例。

冻后即时的组织，在光学显微镜下未见到神经纤维的轴索和髓鞘有明显异常变化，而在电子显微镜下则可见到神经纤维和细胞内外有冰晶空泡分布。

髓鞘因有冰晶形成而出现排列疏松、紊乱，呈水波状弯曲不平，轴索有溶解现象。

施万细胞内有冰晶形成及核染色质凝聚。

冻后1周则出现光镜下所见的髓鞘和轴索坏死，神经束膜外血管有出血现象，随后在坏死的神经组织周围，可见有密集的中性粒细胞浸润，间质内开始出现新生的施万细胞和成纤维细胞，在有的标本中，可见到新生的细小神经纤维幼芽，有单个的，有成簇；坏死的神经组织逐渐分解、减少，而新生的神经纤维多见。

冻后4周，在标本中可见到有大量施万细胞包绕许多大小不等的神经纤维，其中有的髓鞘已增厚，有的仍为一层很薄的膜，在生长变粗的轴索周围有较厚的髓鞘，此时仍可见部分冻坏的神经组织残存。

新生的神经组织中成熟过程中，轴索和髓鞘的发育程度并不同步，轴索的成熟程度往往早于其髓鞘，约冻后8周，神经纤维的髓鞘和轴索，都有已达到正常结构。

由上可知，神经被冷冻破坏后，都有可能复生和恢复功能，而与切除一段神经不同。

有髓神经纤维由轴索和包裹在外的施万细胞构成，两种成分对冷冻的敏感性不同，通常是后者对冷冻更敏感，因此髓鞘的病变往往早于轴突的改变，这也可能是有髓神经纤维的损伤重于无髓神经纤维的原因；而再生过程中，无髓神经优于有髓神经。

对脑组织的冷冻可导致大脑水肿已在大鼠脑水肿动物模型中得以证实，冷冻后一定时间内，肉眼可见损伤灶呈进行性扩大，光镜下可观察到相应的组织学改变。

脑水肿的原因有人认为是血管源性的，也有人认为是混合源性的。

脑水肿的同时还伴随着的神经元的变性、坏死，其原可能的冷冻导致局部微循环障碍，组织缺血缺氧所致。

四、骨组织

（一）软骨组织

以耳软骨经-180℃冷冻后的病理改变为例。

软骨细胞的破坏消失见于冻后1周的组织片中，并可见软骨膜有急性炎症状，而2周后即可见到在原有坏死软骨的表面开始有新生软骨，有的一侧先有增生，有的两侧都有增生，有的继续增生，也有成片增生。

在冻后6周的标本中见到原有软骨的两侧，都有连成一片的大量新生软骨。

（二）骨组织

以颌骨经-180℃冷冻后的病理改变为例。

骨组织的冷冻病理变初期主要表现为骨髓中毛细血管扩张充血，管壁的破坏和出血，骨髓内出现急性炎症反应；稍后才可见到皮质骨内骨细胞坏死消失，骨陷窝呈现空泡状。

6周后，坏死骨的外周有吸收和新生骨组织，出现吸收与代偿现象。

动物实验发现，冷冻可致缺血性股骨头坏死，其病理改变类似于无菌性股骨头坏死。

液氮即刻冷冻家兔股骨头可引起股骨头内血管痉挛、血管内凝血及血管内皮细胞损伤，继而血管壁通透性增加、股骨头内髓腔出血，股骨头复温后血管再通血诱发缺血再灌注损伤，最终导致股骨头无菌性坏死。

术后3周组实验动物，可见软骨下小血管数量明显减少，血管壁有内膜增生，中层平滑肌细胞结构紊乱、模糊等现象，骨小梁排列紊乱，骨细胞死亡，软骨下髓腔内有新、旧的出血迹象。

X线摄影可见软骨下月芽形骨密度减低影，与人类股骨头缺血性坏死早期出现的软骨下骨“新月征”极为相似。

术后6周组实验动物可见骨小梁稀疏、变细，结构紊乱，有断裂现象，甚至有碎片出现，骨小梁间有少量的成纤维细胞、成软骨细胞及成骨细胞，未见明显新骨沉积性生长，在距坏死区稍远部位出现新生血管及初期骨小梁。

术后12周组实验动物坏死骨小梁间隙有明显纤维肉芽组织增生，包绕坏死骨小梁，骨小梁萎缩及紊乱。

髓腔内多核破骨细胞数量增多。

骨小梁周沿稍可见梭形成骨细胞排列，但数量很少。

五、肌组织

以-10℃和-20℃冷冻的大鼠骨骼肌的超微结构改变为例。

骨骼肌经上述温度冷冻后，主要表现为肌原纤维的扭曲、变形或断裂；线粒体的聚集和高度肿胀，其嵴大都断裂，基质密度明显降低；内质网系统明显扩张，形成透亮的液泡；肌细胞膜与基膜分离而形成透亮的液腔，并可见局部细胞膜破裂。

肌细胞的坏死稍后出现，肌细胞变性坏死后偶可引起吞噬细胞的反应。

在冻结性低温（-20℃）条件下，骨骼肌主要发生坏死，而在不全冻结性低温（-10℃）条件下，则同时发生变性和坏死。

冷冻过程中，除可见组织水肿外，还可见细胞内水肿，这也是骨骼肌细胞冷冻损伤的亚细胞病变特征。

线粒体对冷冻高度敏感，其变性是骨骼肌冷冻操作损伤中最为敏感而显著的改变，因此，可将其病变视为肌细胞变性的指标。

第四节肿瘤组织冷冻后的病理变化

一、鳞状上皮源性恶性肿瘤冷冻治疗后病理改变

鲍温病在受冻后45min内取材活检，结果显示上皮下面及其下部的组织完全呈脱离状态，或呈裸体状或脱壳状。

受冻的原位癌各边缘，均与其下面的支持组织完全分开，且见小动静脉明显舒张和充血；同时见有炎症反应。

经历3昼夜后，原位癌则表现出明显的水肿和渗出，此时的镜检发现皮肤显示出血性坏死，毛细血管内壁内皮细胞丧失，使其同离位的纤维融成一片云雾状外观。

在另外一些皮肤切片上见有小动脉坏死性变。

这些小动脉的内皮全被破坏并有纤维填充。

1周后，镜下改变类似冻后初期所见，有些切片上可见明显的出血坏死和血管外细胞聚积现象，还有的血管内血液郁滞，并可见栓塞的小动脉。

约2周后，患处活检呈现出完全坏死状态，结构消失的皮肤几乎识别不出细胞和血管轮廓。

有些呈深度的缺血性坏死。

此时，尚未见明显的修复迹象。

约4周后，出现修复性炎性肉芽组织，胶原纤维与弹力纤维并列贯穿着肉芽组织，大量的细胞浸润同时伴有细胞渗出到新生的结缔组织内。

2个月后，创面完全长出平滑的上皮。

癌细胞冷冻后的超微结构的变化：

口腔颌面部鳞状细胞癌和基底细胞癌经冷冻后的变化为例。

在癌肿冷冻后即时取出的标本中见到癌细胞的内外，包括细胞质、细胞核和细胞间隙中，都有冰晶形成。

细胞核内除可见冰晶空泡外，还可见染色质变性，凝聚成斑块状，分布不均匀，核发生皱缩。

在有的癌细胞中还可见到核膜破裂和核质外流的破坏现象。

在冻后稍久（64h）的标本中曾见到核膜消失、核溶解现象。

癌细胞冷冻后，细胞小器也有明显破坏，如线粒体肿大、嵴断裂或减少、空泡性变。

内质网扩张呈池状，张力原纤维失去条束状态而呈斑块状，排列紊乱。

在细胞核与细胞小器已有明显破坏时，细胞膜和桥粒在电子显微镜下仍清楚可见。

细胞膜的破坏出现时间较晚，通常发生在细胞已失去活力而死亡之后。

这一观察结果有别于一般文献上所认为的由于冷冻导致细胞内生化方面改变，而引起蛋白质分子变性、细胞膜破裂，导致细胞死亡的学说。

由上述癌细胞冷冻后的超微结构变化的观察结果发现，癌细胞与正常细胞冷冻后的变化并无多大差异。

二、食管癌冷冻治疗后的病理变化

经冷冻后，食管肿胀程度和术前低温呈正比，管壁断面呈淤血状，冷冻处食管外膜及纵膈胸膜与周围组织呈条索状或瘢痕性粘连，病变周围淋巴结肿大，剖面上见食管腔面变黑，癌组织表面部分脱落呈浅溃疡，有假膜形成。

镜下可见部分组织坏死溶解，食管壁有大量炎性细胞浸润，冷冻处血管壁变性坏死，有血栓形成。

肿大淋巴结光镜下可见滤泡呈增生反应。

电镜下超微结构改变：

绝大部分癌细胞坏死，癌细胞退变明显，桥粒连接消失，张力纤维增生，细胞膜破裂，胞浆减少，有空泡形成，细胞质内超微结构不清，细胞器几乎消失，嵴结构消失，基质空泡化，染色体聚集。

三、肝癌冷冻治疗后的病理变化

冷冻致肝组织死亡的机制同其他器官类似，但因肝脏是一血供十分丰富的器官，冷冻导致的血液循环障碍对细胞杀伤具有特殊的意义，冷冻可使肝组织导致营养障碍，包括局部微血栓形成，组织缺血缺氧，微循环衰竭，肝脏微血管/肝窦的不可逆行灌注停止，不可避免地导致冷冻组织发生营养障碍性坏死。

动物研究显示，冷冻后3d肝冷冻区呈界限分明的苍白色凝固性坏死，周围有成熟的肉芽组织形成，其中夹杂增生的小胆管，1个月后边界全部为成熟的纤维结缔组织，在纤维包膜形成后，坏死逐渐缩小，1个半月后坏死区吸收，仅留下薄层白色瘢痕。

肝癌患者冷冻后肿瘤缩小作为二期切除，病理显示，冷冻区内肝细胞和瘤细胞呈凝固性坏死，与周围组织界限清楚，包膜增厚，病程长者表面纤维瘢痕形成，收缩。

冷冻区与正常组织交界处见胶原纤维增多，纤维结缔组织包裹。

电子显微镜显示冷冻治疗后的动态病理学变化：

冷冻2h可见冷冻区细胞膜破裂，细胞结构开始溶解；6h肝细胞坏死明显；1d后肝细胞破坏形成碎片；3d后可见冷冻区与周围组织之间界限分明的凝固性坏死；7d后坏死区形成纤维组织；30d后纤维包膜形成，病变区缩小；45d后病变区仅存留白色薄层纤维组织周围环绕正常肝组织。

多次冻凝融化较单次冻凝组织损伤更大，坏死更为显著。

四、恶性黑素瘤冷冻治疗后的病理变化

黑色素细胞对冷冻的敏感性较高，因此冷冻治疗对恶性黑素瘤也具有较好的疗效，而且能限制瘤细胞扩散。

黑色素瘤细胞经冷冻后，细胞肿胀，胞浆黑素体凝聚，细胞间出现空隙；冷后10~14d，瘤细胞间隙明显加大，界限不清，瘤细胞散在，外形不规则，细胞膜破裂，核膜不清晰，核异染质浓聚，核周池扩张。

粗面内质网呈不同程度扩张，线粒体呈退行性改变，黑素体周围出现空隙，细胞间有絮状物质沉着，可能是细胞坏死后残余物，其中尚可辨认残留细胞器结构，细胞间出现较多胶原纤原，排列无一定规律；3~4周后，见胶原纤原进一步增多，未见肿瘤细胞，仅见可疑细胞坏死残余物，出现肥大的纤维母细胞。

冷冻免疫学

第一节冷冻免疫学的基本知识

冷冻外科或冷冻疗法是指利用0℃以下的低温冷冻机体某部，并借冷冻破坏组织的作用，以达到治疗疾病的目的。

冷冻外科治疗的机制是通过冷冻疗法应用液态氧在变为气体时，产生-196℃的低温作用，降低生物体内分子运动的速率，使病变组织失去巨大热量，冷冻死亡，对生物细胞产生杀灭作用。

冷冻治疗能破坏病理组织，保存正常组织。

其不但可以直接破坏病理性组织，而且可使破坏的细胞组织成为某种抗原，刺激机体发生特异性反应而形成成为抗体，产生的抗原物质，扩散到血液及淋巴系统内，激发冷冻免疫效应。

冷冻免疫效应是Yantoron和Shulman分别于1967年和1968年首先证实。

Yantoron证明冷冻能引起机体产生抗体，并且有组织器官特异性和种属特异性。

田中茂男经动物试验和临床研究认为冷冻可引起抗肿瘤免疫使肿瘤生长受抑制。

Soanes报道3例前列腺转移腺癌经冷冻后肿瘤治愈，而破坏的颈椎骨质得到增生，肺转移灶也吸收，淋巴转移灶消失。

ZxLu等报道33例冷冻治疗较晚期支气管肺癌，随访31例中，生存1年以上的有18例，2年以上的有7例，最长生存5年1个月。

XieDeye等冷冻治疗36例Ⅲ、Ⅳ期支气管肺癌，中位生存期25个月，其中1例生存7年，1例生存12年。

这些资料明显提示冷冻对该肿瘤的抗肿瘤免疫效应。

张中兵等检测冷冻治疗直肠癌病人的OKT4+和Ia阳性细胞明显增加。

BeyJop等对植入肿瘤的鼠肝冷冻治疗，其NK细胞毒性较对照组提高。

Hanawa等对鼠肝癌冷冻，指出细胞免疫的变化诱导了机体的免疫反应。

西方发达国家有关前列腺肿瘤冷冻治疗的大量研究表明，冷冻治疗效果与被冷冻组织的抗原参与免疫反应有直接或间接的关系。

并且冷冻免疫反应是冷冻破坏治疗的主要作用，其临床治疗效果越来越受到人们的重视。

有关对坏死组织产生影响的基础和临床研究成果显示，冷冻免疫反应有可能增强肿瘤破坏的效果。

也就是说，“冷冻治疗既可产生特殊的体液免疫，也可产生细胞的免疫反应”。

有证据显示，在肿瘤的早期阶段，冷冻免疫反应可能增强病人对局部残留肿瘤的破坏。

在进展期的肿瘤，当肿瘤的异质性抑制了传统的治疗方法，且病人有可能死于转移肿瘤的直接影响或与治疗有关的并发症，冷冻免疫反应对转移肿瘤是一种补充治疗。

就是说，冷冻的肿瘤破坏作用和对肿瘤诱发的免疫反应为治疗肿瘤提供了一个双效应武器，即双重治疗方法。

一、冷冻与免疫反应类型

根据目前的文献资料，一般认为实体肿瘤主要引起细胞免疫，非实体性肿瘤则主要引起体液免疫。

然而，一般肿瘤可能以某种免疫反应为主，但并不排除其他方式的辅助作用，况且他们之间本来就是相辅相成的。

肿瘤的冷冻治疗实施后，机体的体液免疫和细胞免疫反应都有所提高，这一事实已在不少的动物实验及临床观察中得到证实。

在很多情况下，这些反应一般被称为“冷冻免疫反应的品质特征”。

肿瘤冷冻所产生的免疫效应的机制目前尚未完全清楚，可能与下列因素有关：

①游