农杆菌介导法转Bt毒蛋白樱桃.docx

农杆菌介导法转Bt毒蛋白樱桃.docx

《农杆菌介导法转Bt毒蛋白樱桃.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《农杆菌介导法转Bt毒蛋白樱桃.docx（9页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

农杆菌介导法转Bt毒蛋白樱桃

基因工程课题设计

课题名称：

农杆菌介导法转BT毒蛋白樱桃的初步研究

班级：

生物科学2013

姓名：

陈文宇

学号：

201346602015

课题基本信息

研

究

课

题

摘

要

研究目标、内容、方法及意义

Bt毒蛋白基因是目前世界上应用最为广泛的抗虫基因,已经被转入多种作物中。

其中,棉花、玉米、马铃薯等转Bt毒蛋白基因抗虫作物已经商品化生产,创造了可观的经济效益。

结合转Bt毒蛋白基因技术的成熟以及转Bt毒蛋白基因抗虫作物的培育现状,以及樱桃易受虫害危害的事实，主要研究运用农杆菌介导法将Bt毒蛋白基因转入樱桃中，以获得转Bt毒蛋白的抗虫樱桃。

以此提高樱桃的产量及减少农药对人体的危害。

同时降低樱桃昂贵的价格，使樱桃成为广大消费者食用的佳品。

一、课题研究目的和意义

虫害是制约农作物高产的重要因素，世界每年因虫害造成的损失约占农作物总产量的15%以上。

化学农药的施用在减少虫害的同时引起一系列副作用，如提高成本、污染环境、诱导害虫产生抗药性、引起次要害虫的大发生等。

而通过基因工程手段培育抗虫新品种可从根本上解决问题，对哺乳动物和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不造成环境污染。

人们已从细菌中、植物本身以及昆虫体内发现并分离到许多抗虫基因，其中棉花、玉米、马铃薯等转Bt毒蛋白基因抗虫作物已经商品化生产,创造了可观的经济效益。

樱桃属于蔷薇科落叶乔木果树，我国华东和河北、山西、河南、湖北、四川等地均有栽培，夏初果实成熟时采收，洗净鲜用。

樱桃医疗保健价值颇高。

樱桃味甘微酸，入脾、肝经。

补中益气，祛风胜湿，主水谷痢，止泄精。

主治病后体虚气弱，气短心悸，倦怠食少，咽干口渴，及风湿腰腿疼痛，四肢不仁，关节屈伸不利，冻疮等病症。

常食樱桃可补充体内对铁元素量的需求，促进血红蛋白再生，既可防治缺铁性贫血，又可增强体质，健脑益智。

给小儿饮用樱桃汁能够预防感染麻疹。

樱桃核则具有发汗透疹解毒的作用。

樱桃可祛风胜湿、杀虫樱桃性温热，兼具补中益气之功，能祛风除湿，对风湿腰腿疼痛有良效。

樱桃树根还具有很强的驱虫、杀虫作用，可驱杀蛔虫、蛲虫、绦虫等。

樱桃可以治疗烧烫伤，起到收敛止痛，防止伤处起泡化脓的作用。

同时樱桃还能治疗轻、重度冻伤。

樱桃所含蛋白质、糖、磷、胡萝卜素、维生素C等均比苹果、梨高，尤其含铁量高，常用樱桃汁涂擦面部及皱纹处，能使面部皮肤红润嫩白，去皱消斑。

在水果家族中，一般铁的含量较低，樱桃却卓然不群，一枝独秀：

每百克樱桃中含铁量多达59毫克，居于水果首位；维生素A含量比葡萄、苹果、橘子多4～5倍。

2.含糖、枸椽酸、酒石酸、胡萝卜素、维生素C、铁、钙、磷等成分。

樱桃的栽培过程中，喷洒了大量的农药和其他化学物质，其残留的农药和化学物质在人食用之后会对人体造成巨大的危害。

樱桃的栽培过程中主要害虫有介壳虫、卷叶蛾、绿盲蝽、梨小食心虫、金龟子、梨花网蝽（梨军配虫）、象甲、叶螨（山楂叶螨、二斑叶螨等）、叶蝉等。

而且对樱桃树的用药也分为地面处理用药和树上用药，不仅造成农药残留，还会造成土壤和水源的污染和环境的破坏。

随着现代分子生物技术的发展，我们拥有了将樱桃树转基因的条件。

拥有了新的方法来减少樱桃所遭受的虫害，即转Bt基因樱桃。

转Bt基因樱桃是将人工分离和修饰过的Bt毒蛋白基因导入到樱桃树基因组中。

我们主要是将苏云金芽孢杆菌中可以产生杀虫晶体蛋白的基因片段导入樱桃树生殖细胞，并将其培育成成熟植株。

，使这些樱桃树具有杀虫能力。

苏云金芽孢杆菌是一种分布广泛的革兰氏阳性土壤细菌，在形成芽孢的同时会在菌体的一端或两端形成伴孢晶体，即杀虫晶体蛋白。

伴孢晶体被敏感昆虫幼虫吞食后，在肠道碱性环境和蛋白酶作用下释放出的毒性肽与昆虫中肠上皮细胞的特异受体结合形成离子通道，破坏细胞渗透平衡，使细胞肿胀破裂，最终导致昆虫死亡。

其对鳞翅目、鞘翅目、双翅目和膜翅目等多种重要的农林业害虫都具毒杀作用。

二、国内外同类研究现状、水平及发展趋势

泰国农业大学的AnonThammasittirong和TipvadeeAttathom通过PCR技术，检测了泰国当地的苏云金芽孢杆菌中杀虫晶体蛋白基因。

这篇文献中，两位科学家运用PCR技术对泰国不同地区，不同生态环境的134种苏云金芽孢杆菌菌群进行了杀虫晶体蛋白基因序列的检测。

并将得到的结果与前人所做的进行了对比。

两位科学家先将菌株在37摄氏度条件下，在天然培养基琼脂平板上培养16小时。

然后将一环菌体转移到3ml的LB培养基中，震荡培养一夜。

之后将其两次离心，上清液加入到苯酚中再进行离心。

再经过氯仿、乙醇、TE缓冲液等的处理，最后得到进行PCR测定需要的DNA。

由前人研究已知基因Cry1,Cry2和Cry9对产生特异性杀死鳞翅目昆虫的晶体蛋白是必须的。

通过PCR检测，分析得到的三种基因的分布频率与其他的研究相比较多。

两位科学家分析认为这是由于他们使用的探针不同所致。

研究结果还得到了基因Cry1的不同亚型的分布频率。

以及基因Cry2的分布频率，并发现，其在各个地区的分布频率都很高。

除此之外，许多因素都会影响Bt蛋白。

例如，扬州大学园艺与植物保护学院的徐健、刘琴、谭永安和祝树德研究了粘虫颗粒体病毒对苏云金杆菌的增效特性及对Bt毒蛋白的降解活化作用。

许多作物，例如小麦、甘薯、谷子、花生等，都通过导入Bt蛋白基因来提高抗虫性。

其中玉米是应用转基因技术较早的作物之一。

玉米是世界三大粮食作物之一，也是重要的饲料及工业原料作物。

据统计，全世界有玉米害虫约350种，其中以鳞翅目害虫一玉米螟分布最广泛、危害最严重，是玉米产量和品质的重要影响因素。

在中国，玉米螟在全国各玉米产区均有不同程度的发生，常年发生面积达一千三百多万公顷，一般年份减产lO％～30％，严重时减产超过50％，危害损失五十多亿千克。

近年来，随着玉米种植面积的扩大，加之全球气候变暖，玉米螟安全越冬基数增高，导致玉米螟发生呈加重趋势。

由于这种情况，1990年，美国孟山都公司和迪卡公司开始研究转基因玉米。

1993年，Koziel等人工合成了一个G+C含量达到65％的结构基因（与野生型CryL4（6）基因的同源性为65％），利用基因枪技术把该合成基因导入玉米品种，获得2个转基因玉米品系能够抵御欧洲玉米蜞在生长季节的反复危害。

1996年抗虫转基因玉米开始进入商业化生产阶段，1999年即有3种转Bt毒蛋白基因玉米在美国进行商业化生产。

转基因玉米商业化生产以来，全球共有17个国家种植转基因玉米，其中有7个欧盟国家正式商业化种植抗虫Bt玉米。

国内在抗虫转基因玉米研究方面虽然起步较晚，但进展较快。

目前，国内外转胁毒蛋白基因玉米的主要转化方法有：

基因枪法、农杆菌介导法、子房注射法、花粉介导法超声波法等。

基因枪法又称粒子轰击，高速粒子喷射技术或基因枪轰击技术。

其基本原理是通过动力系统将带有基因的金属颗粒（金粒或钨粒），将DNA吸附在表面，以一定的速度射进植物细胞，由于小颗粒穿透力强，故不需除去细胞壁和细胞膜而进入基因组，从而实现稳定转化的目的。

国内外许多科学家已经运用这种方法成功的将Bt蛋白基因导入玉米中。

农杆菌介导法主要以植物的分生组织和生殖器官作为外源基因导入的受体，通过真空渗透法、浸蘸法及注射法等方法使农杆菌与受体材料接触，以完成可遗传细胞的转化，然后利用组织培养的方法培育出转基因植株，并通过抗生素筛选和分子检测鉴定转基因植株后代。

农杆菌有这样的作用是由于它的细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。

因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。

随着转Bt毒蛋白基因作物的大规模种植，许多人开始担心它对人类及生态环境的影响。

许多人质疑，在杀死昆虫的同时，对人也会产生毒性。

我认为，由导入基因产生的毒蛋白对人是基本无害的。

Bt杀虫晶体蛋白被敏感昆虫取食后，在昆虫中肠碱性和还原性条件下，溶解为前毒素，然后被蛋白酶水解为抗酶活性毒素分子，该活性毒素分子可与中肠上皮细胞纹缘膜上特异受体结合，插入膜内使细胞膜穿孔，破坏消化道细胞的离子、渗透压平衡，最终导致昆虫死亡。

而这种酶在人体内是没有的。

美国国家科学、工程和医学学院也发布了一份大型报告，试图回答一些转基因领域“令人困惑的”问题。

这份得到学术界赞许的报告再次确认，转基因食品对健康无不利影响，可安全食用。

但同时认为，转基因技术不像支持者所宣称的那样有助提高粮食增产率。

这份报告指出，从上世纪80年代开始，基因工程技术被应用于使植物产生特定的特性，如延长水果保存时间、提高食品维生素含量或增强作物抗病能力等，但只有两种转基因特性得到广泛的商业应用，即抗除草剂与抗虫害。

今天最广泛种植的转基因作物主要有3种，分别是大豆、棉花和玉米。

参考文献：

植物抗虫基因工程的研究进展李海燕，朱延明，马凤鸣

解读最新美国转基因报告新华社

三、课题研究采用的主要方法和技术路线

（一）主要研究内容

1、Bt毒蛋白基因的提取:

提取方法：

TritonX-IO0温和裂解法。

提取苏云芽孢杆菌质粒上的编码Bt毒蛋白基因。

这种Bt毒蛋白基因位于质粒DNA上，苏云金杆菌质粒DNA含量极其丰富（从1.5MD到大于130MD），组成极其多样化，不仅不同变种间而且同一变种不同菌株间，其质粒组成也不同，所以Bt质粒DNA的提取一直是实验中较难解决的问题．以往多采用碱裂解法和SDS裂解法，但在质粒DNA质量和产量、实验重复性等方面有一些缺陷。

改进的TritonX-IO0温和裂解法提取Bt质粒DNA，取得较理想的效果。

菌株:

苏云芽孢杆菌

试剂：

提取质粒DNA所用试剂为国产分析纯；RNase；DNAmolecularweightMarker。

仪器：

离心机。

苏云金杆菌质粒DNA的提取：

将苏云金杆菌株接种在LB平板上，培养16～18h后，取单菌落于3mlLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。

取培养液于Ep管中。

以4000r/min

离心5min，去掉上清液；加入100ul的TES洗涤菌体，以4000r/min离心2min，弃上清液。

LB：

胰化蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，NaCl1%。

TES：

50mmol/LTris-HCl，5mmol/LEDTA，50mmol/LNaCl，pH8.0。

TritonX-100裂解法提取质粒DNA于Ep管内加入100ul的溶液A，37℃水溶6Omin；加入溶液B，37℃水浴90min，每隔30min摇匀一次；加入40ul的5mmol/LNaC1，混匀，室温放置2min；用等体积饱和酚连续抽取3次，再用酚、氯仿1和氯仿2各抽取一次；离心弃上清液，加两倍体积无水乙醇沉淀，-2O℃放置1h，离心，再用70％乙醇洗涤，真空抽干，即得质粒DNA；用2OulTE（10mmol/LTris-HCl，1mmol/LEDTA，DH80）缓冲液溶解质粒DNA后，于-20℃保存备用。

溶液A：

5mg/mlLysozyme，100ug/mlRNase溶于TES。

溶液B：

0.6％TritonX—100，50mmol/LTris-HCl，pH8.0，10mmol／LEDTA，100ug/LPronaseK.

2、Bt毒蛋白基因表达载体的构建：

酶和生化试剂：

表达载体质粒pBI121；限制性内切酶BamHI和SacI，TaqDNA聚合酶，T4DNA连接酶，质粒提取试剂盒，胶回收试剂盒，其他生化试剂均为分析纯。

基因引物：

Primer1：

5′一AACAGTGCCCTFACAACC一3′

Primer2：

5′一TCCCGTCAAGAACAGATAG一3′

主要仪器：

离心机，恒温水浴摇床，PCR仪，紫外分光光度计，电泳仪。

Bt基因的克隆及测序：

将Bt基因和载体质粒pBI121用限制性内切酶BamHI和SacI进行双酶切，把切下来的基因与测序载体用T4DNA连接酶在4℃下连接过夜，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5α，涂平板后挑单菌落提取质粒。

提取质粒后，分别酶切回收胁Bt基因和去掉gus基因的片断，然后用T4连接酶连接。

酶切体系为质粒3.0uL，0.5×kBuffer（10×）3.0uL，SacI0.5uL，BamHI0.5uL，ddH₂O13.0uL，总体积20．0uL，37℃保温4h。

连接体系为Bt基因片断10.0uI，载体质粒pBI121（去除gus基因）片断2.0uL，T4DNA连接酶1.0uL，T4buffer（10×）2.0uL，ddH₂O5.0L，总体积20.0uI，4℃连接过夜。

将重组质粒pBI121—Bt转化到大肠杆菌中，用PCR方法和酶切检测。

PCR反应条件为ddH₂O15.0uL，buffer2．5uL，Mg²+2.0uL，dNTP2.0uL，Primerl1.0uL，Primer21.0uL，TagDNA0.5uL，模板1.0uL，总体积25.0ulPCR反应程序为：

94℃预变性10min，94℃变性1min．53℃复性1min，72℃延伸2．5min，循环30次，72℃保温5min，0.8％琼脂糖凝胶电泳。

采用冻融法将含有pBI121—Bt的大肠杆菌转化到根癌农杆菌中。

载体pBll21-Bt基因的构建

3、受体材料的准备：

樱桃叶片愈伤组织的诱导：

将樱桃幼嫩的叶片切下，其边长为3CM的正方形一块,用75%乙醇灭菌5min,再用2.5%的次氯酸钠灭菌处理不同时间（40min,37min,30min和25min）,以确定最佳灭菌时间,灭菌后用无菌水冲洗6～8次,于MS固体培养基上28℃避光培养,8天、10天。

12天、14天依次查看愈伤组织生长情况。

将愈伤组织进行继代培养,得到胚性愈伤组织。

4、转化樱桃叶愈伤组织：

材料：

含Bt基因的根癌农杆菌,樱桃胚性愈伤组织

步骤：

用AB固体培养基+氯霉素25mg/L+利福平20mg/L+AS20mg/L培养农杆菌,在20℃下培养5～6d。

用无菌勺子轻轻刮下培养的农杆菌,放入AAM液体培养基中（加有2mg/L2,4-D,0.7g/L脯氨酸,20mg/LAS）,在80rpm/min,27℃下,摇荡培养4h。

将挑好的樱桃叶胚性愈伤组织放入锥形瓶,菌液倒入另一锥形瓶中,并加入AAM培养基（+AS50mg/L）,分别调节浓度（0.120、0.145、0.158、0.190、0.195）,以确定最佳的农杆菌浓度。

然后将菌液倒入愈伤组织中,用手轻摇,感染15min。

再吸干菌液,将愈伤组织放入装有滤纸的培养皿中干燥,移至共培养基上27℃下共培养。

转化体的获得：

3-5天后，将共培养的愈伤组织转出,无菌水漂洗3～4次,再用NB培养基+50mg/L头孢霉素在室温下100rpm摇洗1～2h,洗2遍后吸干放在滤纸上。

将吸干的愈伤组织转入N6选择培养基上（+50mg/L潮霉素+500mg/L头孢霉素）,27℃下暗培养15-20d后,继代一次。

将新长出的抗性愈伤组织转移到N6预分化培养基上，28℃下,暗培养7d。

将抗性愈伤组织转移到N6分化培养基上,28℃下,光照12h/d,培养2～3周后,新鲜愈伤组织将有绿点出现,每2周继代一次,待分化出完整小苗后转入壮苗培养基MS中。

检测幼苗Bt蛋白含有量，筛选出成功转入Bt毒蛋白基因的樱桃幼苗。

炼苗并移栽：

保护地育苗的情况下，采取：

放风、降温、适当控水等措施对幼苗强行锻炼。

炼苗在定植前5-7天进行，不可时间过长。

炼苗的主要方法有：

停止加温，放风降温，将玻璃温室的放风口全部打开，塑料温室拱棚的上下放风口揭开。

定植前2—3天，在无霜的情况下，撤走全部覆盖物，打开所有通风口，减浇水量，在不萎蔫的情况下尽量减少浇水。

炼苗后将转基因的樱桃树移栽至合适的土地里栽培。

参考文献：

一种改进的提取苏云金杆菌质粒DNA的方法，刘全兰、张何、陈宇、夏立秋，湖南师范大学

Bt基因的克隆及植物表达载体的构建，于守江、王超，东北农业大学园艺学院

农杆菌介导法，

转基因技术原理及要点，李琳玲

搜狗百科

（二）技术路线如下：