吡喃并43b吡喃衍生物与牛血清白蛋白作用的荧光光谱解读.docx

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吡喃并43b吡喃衍生物与牛血清白蛋白作用的荧光光谱解读

第27卷第5期

2010年5月应用化学　　　　　　　CHINESEJOURNALOFAPPLIEDCHEMISTRY　　　　　　　Vol.27No.5May2010吡喃并[4,32b]吡喃衍生物与牛血清白蛋白作用的荧光光谱

梁　晶　张新迎　冯素玲　范学森

（河南师范大学化学与环境科学学院　新乡453007）3

摘　要　用荧光光谱法分析了在生理条件下一种吡喃并[4,32b]吡喃衍生物—22氨基272甲基242（42硝基苯）252氧代24H,5H2吡喃并[4,32b]吡喃232腈与牛血清白蛋白的作用机制。

求得不同温度下二者的结合常数和结合位点数,探讨了微量金属离子对实验体系结合常数的影响,并根据热力学参数确定了这种吡喃并[4,32b]吡喃衍生物与牛血清白蛋白之间的作用力类型。

根据F󰂪rster非辐射能量转移机理,测定了这种吡喃并[4,32b]吡喃衍生物与牛血清白蛋白相互结合时,能量给体2受体间的作用距离和能量转移效率,并用同步和三维荧光技术讨论了其衍生物对牛血清白蛋白构象的影响。

结果表明,吡喃并[4,32b]吡喃衍生物主要以静态猝灭方式使牛血清白蛋白荧光强度显著降低,二者主要凭借氢键和范德华力结合。

关键词　吡喃并[4,32b]吡喃衍生物,牛血清白蛋白,,中图分类号:

O657.3　　　　　文献标识码:

A　　　　　:

2）0600206

DOI:

10.3724/SP.J.1095.2010.90482

其许多衍生物可以作为爱滋病毒（HIV）蛋白酶的抑制剂[1,2],[5～7][3]等性质。

药物分子与血清白蛋白分子间的[4]相互作用,、代谢过程和药理作用具有重要的意义。

目前,有关有机小分子与蛋白质分子相互作用的文献报道很多,但尚未见有关吡喃并吡喃衍生物与牛血清白蛋白

（BSA）相互作用的报道。

本文利用荧光光谱和紫外吸收光谱法,分析了生理条件下22氨基272甲基242（42硝基苯）252氧代24H,5H2吡喃并[4,32b]吡喃232腈（PPD,Scheme1）与牛血清白蛋白的相互作用,测定了它们之间的结合常数和结合位点数,利用求得的热力学参数确定了其相互作用的主要形式。

根据F󰂪rster非辐射能量转移机理,测定了PPD与牛血清白蛋白相互结合时,能量给体2受体间的作用距离和能量转移效率。

讨论了金属离子对二者结合作用的影响,并采用同步和三维荧光技术考察了PPD对牛血清白蛋白构象的影响。

H3CNH2

Scheme1　Molecularstructureofpyrano[4,32b]pyranderivative

1　实验部分

1.1　试剂和仪器

BSA（美国Genview公司）,配成110×10-4mol/L水溶液,贮存于0～4℃冰箱中,用Tris2HCl缓冲溶液将溶液稀释为410×10

2009207220收稿,2009211216修回-5mol/L的工作液待用;PPD按文献[8]方法制备,并用无水乙醇配成

国家自然科学基金资助项目（20772025）

通讯联系人:

冯素玲,女,博士,教授;E2mail:

slfeng@;研究方向:

分子发光

　第5期梁晶等:

吡喃并[4,32b]吡喃衍生物与牛血清白蛋白作用的荧光光谱

-4601210×10mol/L储备液,用Tris2HCl缓冲溶液将储备液稀释成810×10-5mol/L的工作液待用。

pH=7140Tris2HCl缓冲溶液（含011mol/L的NaCl以维持离子强度）;实验用水均为二次蒸馏水,所用试剂均为分析纯。

FP26500型荧光分光光度计（日本JASCO公司）;TU21900型双光束紫外2可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）;PFS280型氟度计（上海大中分析仪器厂）。

1.2　实验方法

在10mL容量瓶中加入110mLBSA工作液和一定量PPD工作液,用Tris2HCl缓冲溶液稀释至刻度,摇匀,分别记录溶液的荧光光谱和吸光度。

荧光激发波长为278nm,激发和发射狭缝宽度均为5nm,记录300～500nm的发射强度。

2　结果与讨论

2.1　荧光光谱与猝灭类型的确定

如图1所示,固定BSA的浓度,随着PPD浓度的增加,BSA,但其峰位及峰形基本不变。

说明PPD对BSA的荧光有猝灭作用。

荧光猝灭过程通常可分为动态猝灭和静态猝

[9]灭。

动态猝灭遵循Stern2Volmer方程:

1F0/F=1+Kqτ0[Q]=1+KSV]

式中,F0,

Kq,KSV为动态猝灭常

数,τ0。

为了阐明体系的猝灭机理,分别在常温（25℃）

和人体体温（37℃）下,以F0/F对[Q]作图,得到蛋

白质荧光猝灭的Stern2Volmer曲线（图2a）。

从

图2a可以看出,曲线的线性关系良好,且随着温度

的升高,猝灭曲线的斜率降低,由此可初步证明体系

的猝灭过程为静态猝灭;而图2b为体系的

Lineweaver曲线,亦可证明PPD与BSA之间发生了图1　PPD对BSA的荧光猝灭光谱Fig.1　FluorescencequenchingspectraofBSAbyPPDc（BSA）=4.0×10-6mol/L;105c（PPD）/（mol・L-1）:

a.0;b.0.4;

c.0.6;d.0.8;e.1.0;f.1.2;g.1.4;h.1.6;i.1.8;.j2.0

静态猝灭。

图2　PPD对BSA荧光猝灭的Stern2Volmer图（a）和Lineweaver2Burk图（b）

Fig.2　（a）Stern2Volmerplotand（b）Lineweaver2BurkplotofBSAquenchedbyPPD

为进一步证明体系为静态猝灭过程,先将此过程按动态猝灭处理。

由于生物大分子的荧光寿命约为1×10-8s,故可由Stern2Volmer曲线的斜率求得猝灭过程速率常数Kq,结果见表1。

一般认为,各类

10猝灭剂对生物大分子的最大扩散碰撞猝灭常数为210×10L/（mol・s）,可见PPD对BSA荧光猝灭过程

602

应用化学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第27卷　

速率常数远远大于扩散控制的动态碰撞引起的猝灭常数。

所以,体系的猝灭主要是因为形成复合物所引起的静态猝灭。

表1　不同温度下体系的Stern2Volmer猝灭常数

Table1　Stern2Volmerquenchingconstantsofthesystematdifferenttemperature

t/℃

KSV/（L・mol-1）

Kq/（L・mol-1・s-1）

2537

3.532×1044

3.532×101212

0.99940.9996

2.2　结合位点数n及结合常数KA的求算

静态猝灭时,如果有机小分子与蛋白质分子的结合比为n∶1,则荧光强度与猝灭剂浓度的关系式可由二者之间的结合常数表达式推导求出

[10]

=lgKA+nlg[Q]

（2）

（F0-F）

以lg

（F-F）

对lg[Q]作图,由斜率可求得25、37℃时BSA与D0192和1104。

由此可以看出,PPD与BSA作用有一个结合位点。

[9]

对于以1∶1结合的静态猝灭,:

0/=]

（3）

-1

　　[4（F0-F）

-1

=F0

-1

+KAF0[Q]

-1-1

（4）

-1以（F0-F）对（如图2b）,由斜率和截距可求得结合常数KA,结果见表2。

由表中数据可以

看出,二者的结合常数较大,PPD与BSA有较强的结合力,且温度对结合常数有一定影响。

表2　体系的结合常数KA

Table2　BindingconstantsofthederivativeandBSA

t/℃

Linearequation

（F0-F）

（F-F）

-1-1

KA/（L・mol-1）

-1-1

2537

=0.0029+5.148×10-8[Q]=0.0020+8.711×10-8[Q]

5.652×1042.296104

0.99830.9980

2.3　共存金属离子对二者结合常数的影响

为了探讨金属离子的存在对有机小分子与蛋白质结合力的影响,本文选择了3种金属离子,分别测定了当金属离子的浓度为110×10

-6

mol/L时,PPD与BSA的结合常数KA′,结果见表3。

由表中数据可

以看出,这3种离子均使PPD与BSA的结合常数降低,特别是Zn,结合常数降低了90%,大大降低了二者的结合力,缩短了衍生物在血浆中的储存时间,有利于PPD分子被释放。

表3　不同金属离子存在下体系的结合常数（18℃）

Table3　EffectsofdifferentmetalionsonthebindingconstantofthethederivativeandBSA（18℃）

SystemPPD2BSA

PPD2Ca（Ⅱ）2BSAPPD2Zn（Ⅱ）2BSAPPD2Fe（Ⅲ）2BSA

KA′/（L・mol-1）

KA′/KA

6.150×1045.562×1043.687×102.234×10

-0.9250.0600.363

0.99590.99980.99780.9973

　　c（Ca2+,Zn2+,Fe3+）=1.0×10-6mol/L.

2.4　PPD与BSA作用力的确定

一般药物与生物大分子的作用力包括氢键、范德华力、静电引力及疏水作用力等。

根据反应前后热

力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小,可以判断药物与蛋白质之间的主要作用力类型:

ΔH<0,ΔS<0为

[11]

氢键和范德华力;ΔH≈0,ΔS>0为静电引力;ΔH>0,ΔS>0为疏水作用力。

　第5期梁晶等:

吡喃并[4,32b]吡喃衍生物与牛血清白蛋白作用的荧光光谱

603

在温度变化不大时,反应的焓变ΔH可以看作一个常数。

由结合常数可以求出反应的自由能变化ΔG（ΔG=-RTlnK）,然后根据下式分别求出ΔH和ΔS:

K2ΔH

）=-K1T1T2R

（5）

ΔG=ΔH-TΔS（6）

　　根据以上关系式,计算本实验中PPD与BSA发生结合作用过程的热力学参数变化,结果见表4。

由表中数据可以看出,ΔH<0,ΔS<0,可认为PPD与BSA之间的作用力主要为氢键和范德华力。

表4　热力学参数变化

Table4　Changesofthermodynamicparameters

t/℃

ΔH/（J・mol-1）

-57660-57660

ΔG/（J・mol-1）

-27110-25880

ΔS/（J・mol-1・K-1）

-102.5-102.5

2537

2.5　PPD在BSA上结合位置的求取

荧光能量的给体（Donor）和受体（Acceptor）,而这种能

。

根据F󰂪rster非

[12]

辐射能量转移机理,能量转移效率（E）02受体间距离（r）有关,可表示为:

R0R0+r

-25

（7）

式中,R050%:

R0=8.8×10

KNΦJ

2-4

（8）

式中,K为偶极空间取向因子,N为介质的折射指数,Φ为给体的荧光量子产率,J为给体的荧光发射光谱与受体的吸收光谱之间的重叠积分,可表示为:

λF（λ）ε（λ）λΔ

λ为计算重式中,F（λ）为荧光给体在波长λ处的荧光强度,ε（λ）为受体在波长λ处的摩尔吸收系数,Δ

叠积分时分隔的波长跨度。

而能量转移效率（E）可由下式求出:

E=1-F0

（10）

λF（λ）Δ

（9）

式中,F为当化合物与蛋白的物质量浓度比为1∶1时的荧光强度。

图3为PPD与BSA摩尔浓度比为1∶1时的荧光光谱与PPD的紫外吸收光谱的重叠光谱。

本实验中,取向因子给体2受体各项随机分布的平均值K=2/3,折射指数取水和有机物平均值N=11336,取给

体BSA的荧光量子产率Φ=0115,将重叠光谱中的

重叠部分分割成极小的矩形面积,并结合式（9）积

-153

分求得J=2198×10cm/（L・mol）。

将数值代入式（8）,求得R0=1195nm。

又由式（10）得能量转移效率E=01156,根据式（7）可得给体2受体间距离

图3　PPD和BSA摩尔浓度比为1∶1时的荧光光谱（a）与PPD的紫外吸收光谱（b）的重叠光谱

Fig.3　（a）BAS′sfluorescencespectrum

atc（PPD）∶c（BAS）=1∶1and（b）theabsorptionspectrumofPPD

r=2158nm,小于7nm

[13]

并且015R0

115R0

[14]

。

结果说明,蛋白质与PPD之间发生了非

辐射能量转移,促使蛋白质荧光猝灭。

604应用化学　　　　　　　　　　　　　　　　　　　第27卷　

2.6　PPD对BSA构象的影响

λ=15nm所作2.6.1　同步荧光光谱　利用同步荧光可以了解有机小分子对蛋白质构象的影响。

由Δ

λ=60nm的同步荧光光谱仅表现了色氨酸出的同步荧光光谱只显示了酪氨酸残基的光谱特性;而由Δ

[15]残基的荧光。

因残基的最大发射波长与所处微环境极性有关,故由发射波长的改变可以判断蛋白质

[16]构象的变化。

发射波长红移表明,氨基酸残基所处环境极性增加,蓝移则疏水性增加。

图4为体系的同步荧光光谱。

图中可见,随着PPD浓度的增加,酪氨酸残基和色氨酸残基的发射波长均略有红移。

说明由于PPD与BSA的结合,使氨基酸残基所处微环境的极性增加,构象发生了变化。

图4　（a）（b）的同步荧光光谱

Fig.spectraof（a）Trpand（b）Tyrradicals

c（BSA）=4.0×10-6mol/L;

）/（L-1）:

a.0;b.0.4;c.0.8;d.1.2;e.1.6;f.2.0;g.2.4;h.2.8;i.3.2;.j3.6

2.6.2　三维荧光光谱　三维荧光光谱是在研究溶液状态下蛋白质2有机小分子相互作用时,蛋白质构象变化的一种很有价值的光谱技术。

图5为在本实验条件下BSA和BSA与PPD相互作用后的三维荧光光谱等高线图。

从图中可以看出,等高条纹线在疏密程度和形状上发生了一定的变化,同时BSA色氨酸残基的激发和发射峰的峰位均略有红移,荧光强度有明显的降低,说明了BSA与PPD发生相互作用后,导致色氨酸近邻区域环境的极性增大,使得处于BSA中疏水区域的色氨酸残基更多地暴露于介质溶液的亲水区,这与同步荧光光谱的分析结果一致。

另外,BSA色氨酸残基所处周围环境由于小分子的插入引起局部构象改变,也可能导致了BSA构象的变化。

图5　三维荧光光谱等高线图

Fig.5　Three2dimensionalfluorescencecontourplots

c（BSA）=4×10-6mol/L;c（PPD）=2.4×10-5mol/L

参　考　文　献

　1　WangS,MilneGWA,YangX,Posey,IJ,NicklausMC,GrahamL,RiceWG.MedChem[J],1996,39:

2047

　第5期梁晶等:

吡喃并[4,32b]吡喃衍生物与牛血清白蛋白作用的荧光光谱605　2　MazumderA,WangS,NeamatiN,NiclausM,SunderS,ChenJ,MilneGWA,RiceWG,BurkeJTR,PommierY.Med

Chem[J],1996,39:

2472

　3　WangY,MoSY,WangSJ,LiS,YangYC,ShiJG.OrgLett[J],2005,7:

1675

　4　YANGMan2Man（杨曼曼）,YANGPin（杨频）,ZHANGLi2Wei（张立伟）.ChineseSciBull（科学通报）[J],1994,

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782

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分析）[J],2008,28（4）:

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2561

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SciencePress（科学出版社）,2006

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199

FluorescenceSpectraoftheInteractionBetweenPyrano

[4,32b]PyranDerivativeandBovineSerumAlbumin

LIANGJing,ZHANGXin2Ying,FENGSu2Ling,FANXue2Sen

（CollegeofChemistryandEnvironmentalScience,HenanNormalUniversity,Xinxiang453007）3

Abstract　Themechanismoftheinteractionbetweenbovineserumalbumin（BSA）andpyrano[4,32b]pyranderivative,22amino272methyl242（42nitrophenyl）252oxo24,52dihydropyrano[4,32b]pyran232carbonitrile,wasstudiedbymeansoffluorescencespectroscopyunderphysiologicalconditions.Theresultsshowthatthispyrano[4,32b]pyranderivativeobservablyquenchesthefluorescenceofBSAinastaticquenchingmode.ThebindingconstantsandthenumbersofbindingsitesatdifferenttemperatureswereobtainedandtheeffectsofsomemetalionsonthebindingconstantofthederivativeandBSAwerealsodiscussed.Accordingtothethermodynamicparameters,themainbindingforcesbetweenthemarehydrogenbondingandVanderWaalsinteractions.Furthermore,thebindingdistanceandtransferefficiencyoftheinteractionenergybetweenBSAandthepyrano[4,32b]pyranderivativewereobtainedaccordingtothetheoryofF󰂪rsternon2radiationenergytransfer.Theeffectofthispyrano[4,32b]pyranderivativeontheconformationofBSAwasanalyzedviathesynchronousfluorescencespectraandthree2dimensionalfluorescencespectra.

Keywords　pyrano[4,32b]pyranderivative,bovineserumalbumin,fluorescencespectra,interaction

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