应用改进的质量评价方法考察复方丹参制剂.docx
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应用改进的质量评价方法考察复方丹参制剂
应用改进的质量评价方法考察复方丹参制剂
张烨，郑颖*，王一涛
（澳门大学中华医药研究院，中国澳门999078）
关键词：
复方丹参制剂；质量评价；含量；溶出度；稳定性
摘要：
目的：
应用改进的质量评价方法考察复方丹参制剂，为其现行质量标准改进提供参考。
方法：
选取水溶性部分丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B及脂溶性部分隐丹参酮、丹参酮ⅡA共5种指标成分，对6个厂家的复方丹参制剂进行含量、溶出度和稳定性测定，比较相同制剂不同厂家、相同厂家不同批次间的含量差异。
以相似因子法评价溶出曲线、用动力学过程描述各指标成分含量变化规律并推算有效期。
结果：
6个厂家的复方丹参市售品中指标成分的含量均超出药典规定含量下限。
4个厂家复方丹参片的各水溶性成分含量相差1.6-7.6倍，脂溶性成分含量相差1.4倍；2个厂家丹七片中水溶性成份含量相差2.3-8.5倍；复方丹参滴丸中指标成分含量批间RSD＜10%。
复方丹参片的水溶性成分在2小时内溶出完全、但脂溶性成分未见溶出；丹七片的水溶性成分溶出不完全；复方丹参滴丸中只有原儿茶醛溶出不完全。
相似因子结果表明，各厂家相同制剂的指标成分间无相似的溶出行为。
各厂家制剂的指标成分降解均符合一级动力学过程（r2≥0.9），预测的有效期均小于1年，但其中原因仍需深入探讨。
结论：
现行的复方丹参制剂质量标准应增加指标成分数量、增加指标成分的含量上限规定、增加溶出度和稳定性考察项目。
基金项目：
澳门大学科研基金（资助号：
RG088/07-08S/09R）
作者简介：
张烨（1985-），女，硕士研究生，从事中药制剂的质量评价及新剂型研究。
Tel：
853-83974694E-mail：
joey105@
*通讯作者：
郑颖（1977-），女，助理教授，药剂学博士，从事中药制剂的质量评价及新剂型研究。
Tel：
853-83974687E-mail：
yzheng@umac.mo通讯地址：
澳门大学中华医药研究院，3座204A室，澳门大学，澳门特别行政区
ApplicationofImprovedQualityEvaluationMethodsforFufangDanshenProducts
ZhangYe,ZhengYing*,WangYi-tao
（InstituteofChineseMedicalSciences，UniversityofMacau，MacauSAR999078，P.RChina）
KEYWORDS：
FufangDanshenproducts；Improvedqualityevaluation；Content；Dissolution；Stability
ABSTRACT:
AIM:
ToapplyimprovedqualityevaluationmethodsforimprovingcurrentqualitycriteriaofFufangDanshenProducts.METHODS:
Consideringbothhydrophilicandlipophilicactivecomponents,danshensu,protocatechuicaldehyde,salvianolicacidB,cryptotanshinoneandtanshinoneⅡAwereselectedasfivemarkers.AHPLCmethodwasdevelopedtosimultaneouslydeterminetheircontents,whichwereusedtocomparetheproductsfromdifferentcompanies,anddifferentbatchesfromthesamecompany.Similarityfactormethodwasusedtoevaluatethesimilaritiesofin-vitrodissolutionprofiles.Moreover,acceleratedandlong-termstabilitytestswereperformedtopredicttheshelf-lifeofFufangDanshenproducts.RESULTS:
AlloftheFufangDanshenproductspassedthecontentrequirementsofChinesepharmacopeia.However,thecontentvariationsofthehydrophiliccomponentsweremuchhigherthanthoseofthelipophiliccomponents.Indissolutiontests,mostofthehydrophiliccomponentsweredissolvedcompletelywhileallofthelipophiliccomponentscouldnotbedetected.Thef2valuesshowedthattherewerenosimilardissolutionprofilesamongdifferentbrandsofFufangDanshenproducts.Thecontentsoffivemarkersdecreasedbyfirst-orderkineticsprocessesinboththeacceleratedandlong-termstabilitytests.Thepredictedshelf-lifeofFufangDanshenproductswereshorterthanthoselabeledontheproducts.CONCLUSION:
ItwassuggestedthatmoremarkerswithdefinedcontentrangeinsteadoflowercontentlimitarerequiredforbettercontrolofFufangDanshenproducts.DissolutionandstabilitytestsneedtobeaddedintothequalitycontrolcriteriaintheChinesePharmacopeia.
丹参，唇形科鼠尾草属多年生草本植物丹参（SalviamiltiorrhizaBge.）的干燥根及根茎[1]，收载于2005版《中国药典》。
丹参可分为水溶性和脂溶性两大类活性成分，按结构亦可分为二萜醌类、酚酸类和其他类成分[2]。
作为常用中药，丹参已被开发成各种复方制剂，以它作为主药并被05版药典收载的有复方丹参片和复方丹参滴丸等，而丹七片收载于部颁标准。
国内多个厂家均可生产。
现行药典标准中只规定了指标成分的含量下限、在体外溶出和稳定性方面没有要求。
收载于部颁标准的丹七片未要求对指标成分进行含量测定。
之前也有提高复方丹参制剂质控标准的报道，但多侧重于改进高效液相方法同时测定多指标成分的含量，如同时测定脂溶性和水溶性成份[3]，以及三七皂苷的含量[4]，但对其相同制剂不同厂家及同厂家不同批次间的含量差异、体外溶出度及储存稳定性考察未见报道。
根据上述问题，本研究选取了5个活性指标成分[5]，分别为丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮和丹参酮ⅡA，对市面上4个厂家的复方丹参片、2个厂家丹七片和1个厂家复方丹参滴丸进行了含量、溶出度及稳定性测定，希望能为现行复方丹参制剂的质量评价标准的改进提供依据。
1.仪器与试药
Agilent1100系列高效液相色谱仪（包括四元泵，自动进样器，柱温箱，二极管阵列检测器）；ERWEKADT706/1000LH低头溶出测定仪；蓝豹LHH-150GSP综合药品稳定性试验箱；BRANSON8510超声仪等。
丹参素钠（批号08-2003）、丹酚酸B（批号08-2006）和丹参酮ⅡA（批号03-2008）对照品购于上海中药标准化研究中心；原儿茶醛（批号110810-200506）和联苯（批号43-9501）对照品购于中国药品生物制品检定所；隐丹参酮（批号0852-9902）对照品购于美国IL公司。
复方丹参片（厂家A，批号F7A014、G7A011、G7A018、L7A011；厂家B，批号7121542、7124044、7125101；厂家C，批号L07K010；厂家D，批号200704004）、丹七片（厂家B，批号7123795、7120956、7120957；厂家E，批号07110111、07120111）、复方丹参滴丸（厂家F，批号20070322、20070406、20070515）均为市售品。
甲醇、乙腈等色谱纯试剂均购于德国Merck公司，水为Milli-Q去离子水。
2.实验方法
2.1含量测定
2.1.1色谱条件
丹参的几类成分极性差别较大，为达到良好分离效果须使用梯度洗脱。
AgilentZORBAXSB-C18色谱柱（5μm，4.6×250mm）；流动相A为0.5%磷酸-水（w/w），B为乙腈；梯度洗脱：
0～7min（6～30%B），7～14min（30～32%B），14～17min（32～80%B），17～26min（80～100%B），26～29min（100%B）；检测波长281nm；柱温30℃；流速1.5mL·min-1；进样10μL。
本研究亦比较了甲醇和乙腈作流动相，乙腈洗脱的峰形比甲醇好，且分析时间短，加入一定量的酸可更好改善峰形。
2.1.2标准溶液与供试品溶液的制备
称取丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA对照品适量，加甲醇依次配成80.16、203.20、402.75、51.50、80.68mg·L-1的储备液。
称取内标（联苯）适量，加甲醇配成84.00mg·L-1的储备液。
取不同厂家各批次的复方丹参片（或丹七片、复方丹参滴丸），如为糖衣片需刮去糖衣，研成粉末，取约0.05g，精密称定，置25mL棕色容量瓶中，70%甲醇定容，25℃超声30min，静置放冷，补足溶剂。
混匀后，0.45μm微孔滤膜滤过，精密吸取续滤液加入内标溶液，摇匀后即得。
2.1.3提取溶剂的选择
在提取溶剂及时间方面，比较了甲醇、50%甲醇-水（w/w）、乙醇等，最终选取了70%甲醇-水（w/w）超声30min，和文献报道一致[4]。
2.1.4方法学验证
线性关系精密吸取2.1.2项下的各对照品储备液，加甲醇稀释得一系列浓度的混合对照品溶液进样，以指标成分与内标峰面积比定量。
结果表明指标成分线性良好，r2＞0.999，其线性回归方程及相关系数详见表1。
丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B、隐丹参酮、丹参酮ⅡA的线性范围依次为0.56～36.07、0.29～18.29、2.27～144.99、0.29～4.63、0.34～5.38mg·L-1。
以上5个指标成分的检测限依次为0.10、0.01、0.14、0.03、0.02mg·L-1。
表1各指标成分的线性回归方程及相关系数
指标成分
回归方程
相关系数r2
丹参素钠
y=0.0692x+0.0003
0.9994
原儿茶醛
y=0.2527x+0.0121
0.9998
丹酚酸B
y=0.0918x+0.0398
0.9994
隐丹参酮
y=0.2680x+0.0180
0.9994
丹参酮ⅡA
y=0.3954x+0.0156
0.9997
精密度取线性范围内混合对照品溶液，连续进样6次，连续3天每天进样2次，峰面积比的RSD＜3%，表明日内、日间精密度良好。
重复性取同一批次复方丹参片（或丹七片、复方丹参滴丸），按2.1.2项下平行制备6份供试品溶液进样，测得5个指标成分的含量RSD＜3%，表明方法重复性良好。
稳定性取混合对照品溶液和复方丹参片、丹七片、复方丹参滴丸制备的供试品溶液各一份，分别于0、2、4、8、12、24、48h进样，并与0h进样峰面积比较降解小于5%，表明样品溶液48h内基本稳定。
加样回收率取已知含量的复方丹参片，研成粉末，取约0.025g，精密称定9份，置25mL棕色容量瓶中，精密加入相当于其含量的50%、100%、150%的对照品储备液各三份，按2.1.2项下制备供试品溶液进样，计算加样回收率。
5个指标成分的加样回收率均在88.8%～105.9%，RSD在0.3%～5.5%；符合定量测定要求。
2.1.5样品含量测定
将6个厂家不同批次的复方丹参片、丹七片和复方丹参滴丸按2.1.2项下制备供试溶液进样，计算各指标成分的含量。
2.2溶出度测定
按照2005年版《中国药典》第二部附录ⅩC项下溶出度测定第二法（浆法）对各厂家不同批次的复方丹参片、丹七片、复方丹参滴丸分别进行溶出度测定。
以900mL纯水作为溶出介质，转速100r·min-1，温度为（37±0.5）℃，分别于0、5、10、20、30、45、60、120min取样5mL（立刻补充等温等体积的溶出介质），0.45μm微孔滤膜滤过，精密吸取滤液并定量加入内标，混匀，按2.1.1项下色谱条件测定，计算累计溶出度。
2.3稳定性试验
按照2005年版《中国药典》第二部附录ⅩⅠⅩC项下药物制剂稳定性指导原则，对各厂家不同批次复方丹参片、丹七片、复方丹参滴丸进行加速试验与长期试验。
加速试验：
购买后按市售包装，在温度（40±2）℃、相对湿度（75±5）%条件下放入药品稳定性试验箱6个月，在第0、1、2、3、6个月末分别取样，测定其含量。
长期试验：
购买后拆去市售包装并装于聚乙烯瓶中避光保存，在室温条件下放置3个月，在第0、1、2、3个月末分别取样，测定其含量。
将测得数据进行统计分析、预测药物有效期。
3.结果与讨论
3.1含量测定
各指标成分及内标峰达到完全基线分离且出峰时间适宜，符合定量分析要求，见图1。
图1混合对照及供试溶液HPLC图
A.混合对照溶液；B.4个厂家各批次复方丹参片供试溶液；C.2个厂家各批次丹七片供试溶液；D.厂家F各批次复方丹参滴丸供试溶液；化合物1~3.丹参素，原儿茶醛，丹酚酸B；4.内标；5~6.隐丹参酮，丹参酮ⅡA。
因丹参不同给药剂型的单位剂量差别很大，故这里以每日总给药剂量为纵坐标，比较了复方丹参片、丹七片、复方丹参滴丸中各指标成分的含量（图2）。
现行药典一部规定复方丹参片中丹参酮ⅡA每片不得少于0.2mg（换算成日剂量不得少于1.8mg），丹酚酸B每片不得少于5.0mg（换算成日剂量不得少于45.0mg）；丹七片无含量标准；复方丹参滴丸中丹参素每丸不得少于0.1mg（换算成日剂量不得少于3.0mg）。
结合图2（见下）和含量测定数据可知，复方丹参片中同时检测到丹参水溶性和脂溶性成分，而丹七片和复方丹参滴丸中只检测到水溶性成分。
所有厂家的复方丹参制剂中指标成分含量均达到药典规定的下限（按每单位剂量计算），但不同厂家或同厂家不同批次产品超出下限的程度却大有不同。
药典没有对指标成分的含量上限作要求，丹七片甚至无含量测定项。
另外，水溶性部分含量差异十分显著，脂溶性部分含量差异较小。
具体来说，4个厂家复方丹参片的水溶性成分中，丹参素在每片中含0.53mg～2.34mg不等，相差约4倍，批间RSD高达51%；而原儿茶醛在0.021mg～0.16mg不等，相差约7倍，批间RSD高达49.4%；丹酚酸B在8.04mg～13.20mg不等，RSD为5.3%；脂溶性成分中隐丹参酮在0.31mg～0.40mg不等，丹参酮ⅡA在0.38mg～0.52mg不等。
又如2个厂家丹七片中丹参素含量在0.97mg～2.22mg不等，相差约2倍，批间RSD达22.5%；原儿茶醛在0.05mg～0.43mg不等，相差约8倍，批间RSD高达45.1%；丹酚酸B在3.81mg～5.23mg不等，相差约2倍，批间RSD达18.2%。
复方丹参滴丸中指标成分含量批间RSD＜10%。
以上含量差异可能是由药材品种及来源、提取工艺等不同所造成，有待进一步研究。
图2复方丹参片、丹七片、复方丹参滴丸中各指标成分的含量比较图
3.2溶出度测定
根据2005版《中国药典》二部规定，药物在45min内溶出成分标示量的70%即视为溶出完全。
由图3可知，4个厂家复方丹参片的丹参素、原儿茶醛、丹酚酸B在水中均溶出完全；隐丹参酮和丹参酮ⅡA在水中基本不能溶出（低于检测限）。
对于丹七片中三种水溶性指标成分，厂家B产品三种水溶性指标成分在水中均溶出不完全，厂家E产品在水中均溶出完全。
复方丹参滴丸中的丹参素和丹酚酸B均溶出完全，仅原儿茶醛溶出不完全。
图3各厂家不同剂型指标成分在水中的溶出曲线
美国FDA和欧盟推荐使用相似因子（
）法评价仿制品与对照药品（即市售品）溶出度，确定两者的溶出度差异，以考察仿制药的生物等效性。
本研究运用此方法对溶出曲线作统计分析[6]。
但本研究中的复方丹参制剂均已为市售品，无对照药品，故将各厂家不同制剂间的指标成分依次设为对照药品，评价其他制剂间的溶出相似度。
值的简化数学表达式为：
为t时间对照制剂累计溶出度，
为t时间受试制剂累计溶出度，n为取点数目。
以复方丹参片为例，将不同厂家的产品分别设为对照制剂，用公式计算可得4个厂家间复方丹参片的相似因子
（0≤
≤100）。
如
≥50，表明受试制剂与对照制剂具有相似的溶出曲线。
同理，计算可得2个厂家间丹七片的相似因子
，详见表1。
表1各厂家复方丹参片及丹七片的
2
剂型
对照制剂
受试
制剂
丹参素
原儿茶醛
丹酚酸B
复方丹参片
A
B
33.5
42.6
38.0
C
30.6
26.3
35.7
D
39.0
28.4
37.9
B
C
57.3
35.3
41.8
D
22.5
42.3
42.8
C
D
20.5
49.8
53.6
丹七片
B
E
37.0
17.7
32.8
从表1可知，复方丹参片中，只有厂家B和C具有相似的丹参素溶出行为，厂家C和D具有相似的原儿茶醛、丹酚酸B溶出行为。
各厂家制剂其他成分的
2均＜50，无相似溶出行为。
丹七片中，3种水溶性指标成分均无相似溶出曲线。
以上结果再次证明了不同厂家复方丹参制剂之间的溶出差异性。
3.3稳定性试验
根据2005年版《中国药典》一部的复方丹参片质控项下测定丹参酮ⅡA和丹酚酸B含量、复方丹参滴丸项下测定丹参素含量的规定，本研究在长期试验中选用丹参素、丹酚酸B、丹参酮ⅡA，计算指标成分含量下降10%所需时间（t0.9）及成分含量降至药典规定下限所需时间（tlimit），各厂家复方丹参制剂的结果详见表2。
表2以长期试验预测各厂家复方丹参制剂有效期
剂型
厂家
丹参素
丹酚酸B
丹参酮ⅡA
t0.9/
日
tlimit/
日
t0.9/
日
tlimit/
日
t0.9/
日
tlimit/
日
复方丹参片
A
36
N/A
53
253
125
1016
B
29
N/A
39
342
33
229
C
26
N/A
55
339
39
236
D
42
N/A
35
224
30
194
丹七片
B
21
N/A
23
N/A
—
—
E
79
N/A
30
N/A
—
—
复方丹参滴丸
F
31
231
24
N/A
—
—
注：
t0.9：
指标成分含量下降10%所需时间；tlimit：
指标成分含量降至药典规定下限所需时间；N/A指药典无含量下限而无法预测有效期；—指制剂中检测不到此成分。
长期稳定性结果表明，复方丹参片、丹七片和复方丹参滴丸各指标成分的降解基本符合一级动力学过程，有较好的负相关性，r2基本大于0.9。
无论是指标成分含量下降10%所需时间或指标成分含量降至药典规定下限所需时间都少于1年。
加速试验也选用上述3个指标成分，各指标成分在上述3种复方丹参制剂中的含量下降也基本符合一级动力学过程，3个月后各指标成分的含量下降均大于10%。
以上结果表明市售复方丹参制剂并不能在本研究的长期试验和加速试验中保持稳定。
虽然结果与制剂包装上的标示有效期2～3年不符，但未能由此直接否定复方丹参市售制剂的标示有效期。
现分析原因可能有以下5点：
1、由于条件所限，本研究购买的市售制剂在其标示生产日期近1年后才开始长期试验和加速试验，且跟ICH指导原则中要求产品须在出厂后35天内开始加速试验和长期试验的条件有差别[7]。
2、长期试验中未做到严格控湿控温且已拆去市售包装，跟药典要求有差距。
3、目前对丹参及复方丹参的降解或反应机理尚无定论，无法对降解产物定量。
4、随着降解产物的不断生成，初始检测方法可能已不满足质量控制的要求（如降解过程中生成未知产物）。
5、指标成分的选择是否合理，是选择含量最高的成分、降解速度最快的成分或最易产生毒性的成分目前尚无定论。
虽然本研究有一定局限性，但结果提示对已上市复方丹参制剂仍有必要追踪考察其稳定性。
虽未能提供确切的市售复方丹参制剂稳定性评价标准，但希望能为其标准的制定提供参考，建议药典中复方丹参市售制剂质控项下增加稳定性考察项目。
4.结论
市面上各厂家复方丹参制剂中指标成分的含量均达到2005年版《中国药典》一部规定的下限，但超出程度不一，目前尚无标准规定其上限，建议药典应采用含量范围代替含量下限并适当增加指标成分数量。
各厂家复方丹参制剂中水溶性成分溶出差异大且脂溶性部分无溶出，建议药典可增加溶出度测定项。
稳定性考察方面，本研究中各厂家复方丹参制剂的预测有效期均小于1年，其中多种原因仍需深入探讨，但建议药典应增加稳定性考察项目以评价制剂的稳定性。
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