腺病毒中文操作手册.docx

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腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版

腺病毒重组系统

AdEasyTM操作手册

目录第一章简介1

3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3

第四章主要流程24

第二章应用重组腺病毒的优点4.1技术3将基因克隆入AdEasyTM转移载体4第三章AdEasyTM4.1.133.1技术概况缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani（broth）LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5血清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdVAdenoviralVectorAmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection（Virus/Cell）-半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNAmRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-off

bpBasePair碱基对

PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNA

DNA闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNACPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfectionCsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEMRITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠乙二胺四/二硫苏糖醇DTTDithiothreitolTBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸乙酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化乙锭EtBrEthidiumBromide

量FBSFetalBovineSerum胎牛血清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白小时HrHour

ITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTATE卡那霉素KanKanamycinwtWildType野生型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltonsβ-D-第一章简介

当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

人类基因组计划和正不断发展的基因治疗同样急需发展快速有效和治疗性的分析工具。

为解决这一问题，基因输送技术（通常使用病毒载体如增殖缺陷的腺病毒）通过基因工程不断发展，致力于生产基因表型药物。

重组腺病毒提供了一类在基因转移系统发展中有极大潜力的新的生物治疗剂。

1953年对普通感冒病因的探索和研究导致了腺病毒的发现。

迄今为止已发现了40多种不同血清型和93种不同种类的腺病毒，它们通常感染眼、呼吸道或胃肠上皮（Fields等，1996）。

1977年，FrankGraham博士建立了一种细胞株，可在无辅）。

此后，腺病毒载体作为极具潜力的哺乳动物基因转移载体而得到广1977等，Graham助病毒的情况下产生重组腺病毒（．

泛应用，尤其是在基因治疗相关领域。

迄今为止已有大量关于腺病毒及其应用的综述发表，我们给感兴趣的读者推荐以下文章：

Hittetal，1999和Wiveletal，1999。

腺病毒亦可被用来在人体细胞中过量表达蛋白（Massieetal，1998A,B）。

但迄今为止还只有熟知腺病毒的研究人员才会采用腺病毒系统。

昆腾生物科技公司是第一个提供完备而且能广泛应用的重组腺病毒试剂盒Adeno-QuestTM系统及其相关产品和客户服务的公司，这个系统的基础是在293细胞中产生重组腺病毒。

现在介绍的AdEasyTM系统以细菌内重组取代哺乳动物细胞（Heetal，1998），使获得重组腺病毒对任何有细胞培养设备的分子生物实验室都更方便。

重组腺病毒事实上可在任何细胞或组织中用来研究表达重组蛋白。

AdEasyTM转移载体可允许插入7.5kb的外源DNA，目前正研究腺病毒其它区的缺失以提高腺病毒在基因治疗中的应用。

这本手册提供了重组腺病毒技术中所有必须遵循的原则，并详细描述了产生一个重组腺病毒的所有实验步骤，包括重组腺病毒在QBI-293A细胞中扩增并纯化到1012VP的操作步骤。

AdEasyTM载体系统包含了生产5型重组腺病毒所需的全部试剂，所有成分购买后即可使用。

第二章应用重组腺病毒的优点

1.宿主范围广,对人致病性低

这套腺病毒载体系统可广泛用于人类及非人类蛋白的表达。

腺病毒可感染一系列哺乳动物细胞，因此在大多哺乳动物细胞和组织中均可用来表达重组蛋白。

2.在增殖和非增殖细胞中感染和表达基因

逆转录病毒只能感染增殖性细胞，因此DNA转染不能在非增殖细胞中进行，而必须使细胞处于持续培养状态。

腺病毒则能感染几乎所有的细胞类型，除了一些抗腺病毒感染的淋巴瘤细胞。

腺病毒是研究原代非增殖细胞基因表达的最佳系统，它可以使转化细胞和原代细胞中得到的结果直接进行对比。

3.能有效进行增殖，滴度高

这套腺病毒系统可产生1010到1011VP/ml，浓缩后可达1013VP/ml，这一特点使它非常适用于基因治疗。

4.无需辅助病毒，可容纳7.5kb外源DNA：

为提供克隆空间，此腺病毒缺失了E1和E3早期区。

此外，此腺病毒可包装比正常病毒DNA稍大的DNA分子（105%）。

这些特点允许插入腺病毒的基因或多基因表达盒可达7.5kb。

5.与人类基因同源

该腺病毒载体系统应用了人类病毒作为载体，以人类细胞作为宿主，因此为人类蛋白进行准确的翻译后加工和适当的折叠提供了一个理想的环境。

大多数人类蛋白都可达到高水平表达并且具有完全的功能。

6.不整合到染色体中，无插入致突变性

逆转录病毒可随机整合到宿主染色体，导致基因失活或激活癌基因。

而腺病毒则除了卵细胞以外几乎在所有已知细胞中都不整合到染色体中，因此不会干扰其它的宿主基因。

在卵细胞中整合单拷贝病毒则是产生具有特定特征的转基因动物的一个较好的系统。

7.能在悬浮培养液中扩增：

293细胞可以适应悬浮培养，这一调整可使病毒大量扩增。

大量事实证明悬浮293细胞可在1~20L的生物反应器中表达重组蛋白。

8.能同时表达多个基因

这是第一个可以在同一细胞株或组织中用来设计表达多个基因的表达系统。

最简单的方法是将含有两个基因的双表达盒插入腺病毒转移载体中，或者用不同的重组病毒共转染目的细胞株来分别表达一个蛋白。

测定不同重组病毒的MOI比值可正确估计各重组蛋白的相对共表达情况。

第三章AdEasyTM技术

3.1技术概览

在AdEasyTM载体系统中，含有大部分腺病毒基因组的载体为超螺旋质粒，而不是线性DNA，同源重组则在大肠杆菌进行。

相对于传统系统而言，这二点改进使病毒DNA操作更容易，同时由于利用了大肠杆菌的高效率同源重组特性而使重组载体的筛选更为简单。

在本系统中，首先将基因cDNA插入一个转移载体，将得到的质粒用PmeI线性化，然后在大肠杆菌BJ5183中与病毒DNA质粒pAdEasy-1进行同源重组。

pAdEasy-1缺失了E1和E3区，其E1区功能将在293A细胞中得到互补。

重组子通过卡那霉素筛选，用内切酶进行鉴定分析。

最后将得到的重组腺病毒用PmeI线性化，暴露其反向末端重复序列（ITR，IavertedTerminedRepeats），转染QBI-293A细胞后产生重组病毒颗粒。

同源重组在线性化的转移载体和完整的超螺旋腺病毒质粒之间进行。

应用完整的腺病毒质粒而不用内切酶进行线性化，对于产生重组腺病毒至关重要。

转移载体中的卡那霉素抗性基因则可用来筛选重组子。

由于线性化的转移载体产生卡那霉素活性，但同时缺失介导细菌重组的recA有BJ5183抗性克隆的背景较低，因此此同源重组系统有较高的信噪比。

大肠杆菌

其它酶，具有高效的转化和重组能力。

一旦重组子经确定，则可转入普通的无recA、endA活性的细菌株如DH5α等进行扩增。

由于缺乏recA活性，DH5α不能用于腺病毒的同源重组。

3.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程

与传统系统相比，AdEasyTM系统中筛选和纯化腺病毒所需的时间大大缩短了。

克隆和筛选约需1-3周，重组后需验证重组病毒质粒是否含有目的基因。

重组子在DH5α中扩增后转入哺乳动物细胞293A，最后将293A细胞中产生的重组病毒颗粒进行纯化和滴定。

最终得到的重组腺病毒只能在提供E1区功能的293A细胞中进行增殖。

一般来说，用传统方法产生重组腺病毒并不需要大量工作，每天只需1小时进行细胞传代和观察空斑形成。

但由于病毒空斑形成速度慢，整个过程就需要很长时间。

而AdEasyTM载体系统用大肠杆菌产生重组病毒，大大缩短了所需时间。

我们强烈建议初学者用QBI-Infect＋阳性对照进行感染力测定（见5.2.2

第四章主要流程

4.1将基因克隆入AdEasyTM转移载体

AdEasyTM系统中有2种转移载体可供进行重组腺病毒构建：

pShuttle和pShuttle-CMV，这2个载体都含有多克隆位点（MCS）供插入基因。

pShuttle不含有启动子和多聚腺苷酸位点（polyA），允许插入含特定启动子和polyA位点的表达盒。

pShuttle-CMV含有单拷贝CMV启动子和polyA位点供基础表达和高表达重组蛋白，你只需将目的基因插入pShuttle-CMV的多克隆位点。

表1提供了各转移载体的特性。

表1AdEasyTM转移载体特性

载体名称克隆能力启动子polyA位点克隆位点线性化位点说明

pShuttle7.5kb——MCS共转化位点PmeI（ECoRI）

转染位点（PacI）将完整的表达盒装入多克隆位点（MCS）

pShuttle-CMV6.6kbCMV+MCS共转化位点PmeI（ECoRI）

转染位点（PacI）CMV启动子能在大多数哺乳动物细胞中高效表达蛋白

4.1.1克隆的一般原则

AdEasyTM转移载体的特殊设计使其极易在克隆中应用，但在设计克隆策略时应考虑以下因素：

1）在BJ5183中进行共转化之前必须将转化载体线性化。

确证表1中所列的线性化位点不存在于插入的基因中。

注意：

在pShuttle中用EcoRI线性化时，需要用RecA辅助的限制性内切酶进行酶切。

如果插入基因含有所有线性化酶切位点，那么必须进行定向突变。

2）重组腺病毒质粒在转染QBI-293A65℃20分钟进行灭活。

5．凝胶纯化线性化载体。

尽管胶纯化可能会降低转化效率，但不完全消化往往产生较高的背景，从而降低重组率。

将线性化质粒去磷酸化也有助于降低背景信号。

6．重悬纯化的DNA，浓度至少为0.2ug/ul。

每个转化实验取1ug进行，包括对照。

4.2细菌内AdEasyTM重组子的产生2mm电穿孔杯，防止有气泡形成。

4．按电穿孔供应商的使用说明转化BJ5183，Bio-Rad仪器一般使用的参数为：

200Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：

5Ohms、2.5KV、C=0。

5．用1mlLB重悬转化物。

6．转入15~50ml离心管中，37℃震荡培养60分钟。

℃4.3AdEasyTM37重组质粒的筛选和扩增3~5块LB/Kan（50ug/ml）培养板，7．将转化物铺将侯选重组子进行酶切分析，验证其结构。

比如：

PacI酶切后通常得到约30kb的片段和一个3.0或4.5kb的小片段。

小片段的大小因重组位置在左臂还是复制子而不同。

建议同时用克隆基因的内切酶进行分析，鉴定是否含有插入基因。

挑选最佳阳性重组子转入DH5α中进行扩增：

转化DH5α只需1-5ul小量制备的重组子。

这一步对于扩增时保持重组DNA的结构是必需的，因为AdEasyTM这样的大质粒在recA+细菌株如BJ5183中是不稳定的，会迅速出现缺失,而在DH5α中能很容易地获得大量DNA。

1．将DH5α感受态细胞和电穿孔杯置于冰上。

2．将1-5ulDNA加入40ulDH5α感受态细胞中，DNA必须用水溶，避免含有离子。

3．将DH5α感受态细胞转入2mm电穿孔杯，防止形成气泡。

4．按照说明转化DH5α：

Bio-Rad仪器一般使用的参数为：

200Ohms、25uF、2.5KV；BTX仪器则为：

50Ohms、2.5KV、C=0。

中。

1mlLB．将转化混合液重悬于5．

6．转入15-50ml离心管中，37℃振荡培养60分钟。

7．培养后用LB按一定梯度稀释转化的DH5α（1:

10、1:

100和1:

1000）

8．取100ul转化液铺在LB/Kan（50ug/ml）板上，37℃培养24小时。

未用的转化液可在4℃保存-2周。

9．每个重组子挑1~3个克隆转入5mlLB扩增，以备有足够量质粒。

这时，用内切酶再次分析重组DNA，以确证含有插入基因，以及重组子的稳定性。

10．用柱纯化试剂盒制备至少5ug高质量的重组DNA。

11．取5ug质粒用PacI消化，酚/氯仿抽提一遍，乙醇沉淀后在无菌条件下溶于50ul0.1×TE溶液。

具体要求参见磷酸钙技术一章中有关转染前DNA制备的内容。

4.4AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞

注意：

培养细胞前先参阅5.1章中有关QBI-293A-293A细胞在60mm培养皿中铺板，用DMEM5%培养，第二天的细胞数应达到1.0~1.5×106。

37℃2M氯化钙溶液。

上下吸打二次混匀，然后一滴一滴加入50ulAdVDNA溶液和26ul2M氯化钙，再用移液枪慢慢吹打混匀。

此时缓冲液的体积为250ul，含有0.25M氯化钙和5ugDNA。

3．准备第2管离心管（编号2），加入250ul2×HBS缓冲液。

4．用1ml移液枪吹打2号管中的溶液形成气泡，在吹打的同时逐滴加入1号管的溶液。

加完后继续吹打5秒以使其完全混匀。

这一步骤对于形成的共沉淀颗粒的大小至关重要，小颗粒转染效率更高，而吹打可以形成较小的颗粒。

等一分钟后再加入细胞培养皿内。

5．在超净台内将磷酸钙-DNA共沉淀混合物逐滴加入到培养皿中，覆盖范围尽可能广。

培养液稍后即会透明，十字形晃动培养皿使沉淀均匀分布。

6．培养皿放入孵箱培养过夜。

4小时后，沉淀颗粒在200×倒置显微镜下应清晰可见，尤其在无细胞的培养皿表面。

7．第二天，去除含共沉淀颗粒的培养液，用PBS制备的1mMEDTA溶液洗一次，PBS洗2次。

注意：

转染后细胞都十分脆弱，容易脱壁。

清洗时应十分轻柔，将PBS沿培养皿壁加入，然后轻轻旋转培养皿。

用移液枪反复将培养液直接加在细胞上，即可使细胞脱落，然后收集。

由于这一时期细胞十分脆弱，切勿使用胰酶消化。

8．将细胞分装入4个60mm培养皿（每个培养皿中加5mlDMEM5%）或一块6孔板中（每孔加3mlDMEM5%），静置6小时使其贴壁。

6小时后覆盖琼脂糖以供形成病毒空斑。

第五章常用技术

5.1QBI-293A细胞培养

昆腾公司的293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293作为第一代，则30代内能得到最佳结果。

一旦到了30代，最好复苏一管细胞开始新的培养。

所以，我们建议你在收到细胞后应尽快建立自己的QBI-293A细胞库。

QBI-293A细胞在DMEM培养液中培养，该培养液还含有4.5g/LL-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺和胎牛血清。

血清浓度为2%~10%，视实验需要来调节细胞生长速度。

为简化此操作说明，培养基描述为DMEM后加血清浓度（如：

DMEM5%表示：

含有4.5g/LL-葡萄糖、110mg/L丙酮酸钠、终浓度为2mM的谷氨酰胺和终浓度为5%的热灭活胎牛血清）。

QBI-293A细胞需按标准的细胞培养规程进行操作，在健康状态时，它们呈成纤维细胞样并在培养瓶中贴壁形成单层细胞。

被感染的细胞则变圆脱落，即所谓的细胞病理效应（CPE）。

所有的细胞培养操作都应严格遵循无菌原则，这一点是至关重要的。

抗生素可用可不用，但无抗生素条件对于操作质量来说通常是一个好的对照。

QBI-293A细胞生长的相对密度见下表：

表2：

汇合率与细胞数量汇合率（%）60mm培养皿100mm培养皿

501.60×1063.5×106

752.40×1065.25×106

1003.20×1067.00×106

5.1.1QBI-293A细胞初始培养

1.将冻存的一管QBI-293A细胞在37℃水浴轻轻晃动融化。

2.融化后在超净台无菌条件下用70%乙醇将冻存管的盖沿擦拭干净。

3.将细胞转入15mL无菌离心管中，加入10mLDMEM10%，600×g离心5分钟使细胞沉淀。

4.弃去上清。

重悬，轻轻打匀10mLDMEM10%将细胞用5.

6.转入75cm2培养瓶或100mm培养皿中培养。

7.在5%CO2孵箱中37℃-293A细胞的维持培养和增殖

QBI-293A-293A细胞的冻存

建立细胞库时必须使培养的细胞汇合率低于50%，以保证亚克隆的特定表型。

1.QBI-293A细胞必须在含10%高质量FBS的DMEM中培养。

2.将健康生长的QBI-293A细胞离心沉淀。

3.以最小体积的DMEM10%重悬细胞。

4.用血球计数器进行细胞计数。

5.用DMEM5%+10%DMSO+40?

S重悬细胞，细胞终浓度为1×106/mL。

6.无菌操作将1mL细胞悬液转入2mL冻存管中。

7.将冻存管放入冻存盒中，-80℃储存24小时。

这一简便措施可保持约1℃/分钟的降温速率，适于冻存细胞。

8.第二天将冻存的细胞转入液氮罐或-150℃冰箱中长期保存。

QBI-293A细胞若正确冻存，则可在液氮罐中保存数年。

5.2QBI-293A细胞的感染和病毒空斑的产生

感染QBI-293A细胞和产生病毒空斑在这本手册的多种操作中都得到应用，其具体操作视不同的实验目的而稍有差异（如滴度测定、大规模扩增和纯化）。

这一节提供了一个基本的操作说明，并详细描述了QBI-293A细胞感染后不同时间的具体变化。

-293A细胞

QBI-293A细胞中腺病毒的感染周期表现为光镜下可见的细胞表型的改变，此周期始于病毒和细胞接触后。

被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率相关，这个比率称为感染复数（MOI）。

病毒控制细胞并阻止细胞的生长需要几个小时的时间。

当QBI-293A细胞在MOI值为1或更低的情况下被感染，则只有一部分细胞能被感染。

此时感染所有的细胞必须产生完整的感染周期并释放病毒，整个过程大概需要4天。

在这个过程中，未被感染的细胞将继续生长，细胞可能在未被全部感染时达到100%汇合率而停止生长。

感染后的表现是多种多样的，但典型的表现是在感染后5天可见大多数细胞呈现CPE而其余的细胞表现为原来未被感染的形态。

感染的操作很简单，只要将病毒与细胞接触。

为增加感染的有效性，在最初2小时感染中最好将培养液的体积减到最小，这样病毒与细胞接触得会更紧密，然后再增加培养液。

此外，缓慢而持续地晃动培养板（Mitterederetal.1996）可使病毒分布更均匀，从而使感染效果更好。

注意：

处理细胞和病毒时都必须使用消毒的枪头。

病毒空斑形成源于一个细胞被一个病毒感染后，经过多次完整的感染周期释放病毒再感染周围的细胞。

病毒空斑的形成是一个缓慢的过程，甚至在光镜下能观察到空斑之前，细胞已经达到100%汇合。

为限制病毒的扩散，通常在培养液中加入琼脂糖，但在琼脂糖覆盖下观察细胞形态的改变则要稍微困难一些。

感染后7天左右可以在显微镜下看到小的空斑，表现为一定区域内细胞呈现CPE。

第10天可以在光镜下看到形态完整的空斑，有经验的研究者则能凭肉眼观察到培养板底部有小的空白斑点形成。

到14天，空斑可非常容易地被挑选出来。

将琼脂糖覆盖细胞不是一项容易的技术，你必须在琼脂糖凝固之前迅速地将它在单层细胞上完全铺匀。

但是如果铺得太快太重，那么细胞往往会脱壁。

但通过几次实验后，这一步应该比较容易了。

琼脂糖/DMEM混合物制备：

1.用无菌PBS制备5%SeaPlaque琼脂糖（FMC产品）储存液，高压消毒后每管10mL分装在50mL塑料离心管中，4℃保存。

2.使用之前先在微波炉中融化5%SeaPlaque琼脂糖（避免沸腾），然后冷至45℃。

防止琼脂糖沸腾最好的办法是在沸水浴中加热，如果没有完全融化的话再在微波炉中加热数秒。

3.加入30mL预平衡至37℃的DMEM5%后充分混匀，这样琼脂糖的终浓度为1.25%。

立即使用。

覆盖QBI-293A细胞：

在进行下一步操作之前，请确认细胞是否已贴壁完好。

混合物覆盖单层细胞。

/DMEM琼脂糖1.25%移去培养液，用1.

2.沿着培养板的边缘将琼脂糖轻轻加入，加入的具体体积参考表3，然后放回CO2孵箱培养。

表3：

不同培养器皿应用的琼脂糖体积

培养皿大小首次量追加量

100mm10mL5mL

60mm5mL3mL

6孔板3mL1.5mL

空斑应在10~21天内形成，为保持细胞活力，每4~5天或培养基变黄时追加琼脂糖/DMEM混合物。

5.3MOI测定

这一实验用来粗略估计病毒上清中病毒颗粒的数量（精确测定病毒颗粒数量见5.8节的滴度测定）。

MOI测定通常在扩增病毒尤其是在大量扩增的时候使用，以确定感染的最佳条件。

这一实验可在含有1×106QBI-293A细胞/孔的6孔板中进行。

1.移去培养液，每孔加入500μL新鲜的培养液

2.一孔为对照，其余每孔分别加入2、5、10、25、50μL病毒上清。

3.不断缓慢晃动培养板，培养约3小时。

4.加入1.5mL新鲜培养液培养72小时。

观察每孔细胞是否出现CPE，根据预先的估计，感染后3天细胞完全出现CPE的病毒MOI值为10~20。

这样，根据感染的细胞数量，你就可以估计出上清中的病毒量。

5.4腺病毒感染力测定

这一实验的目的是确定腺病毒是否能将DNA转导入293之外的某一细胞株。

该实验至关重要，因为它将确定腺病毒是否可应用于这个细胞株，以及如果能应用则需要多少的病毒量（也就是需要大量扩增的程度）来完成整个研究。

这个实验中，如果用的是Ad5-CMV-LacZ则检测β-半乳糖苷酶，Ad5-CMV-GFP或Ad5-CMV5-GFP则检测GFP。

这些高滴度的产品都可单独向昆腾公司购买。

本实验的阳性对照（β-半乳糖苷酶检测）亦可向昆腾公司购买，但由于病毒滴度太低而