酵母菌的培养与分离.docx
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酵母菌的培养与分离
微生物学大实验
实验指导
编者：
生物技术教研室
2007.3
目录
实验一酵母菌的培养与分离2
实验二酵母菌的鉴定7
实验三酵母菌耐受能力的测定19
实验四酵母菌发酵工艺条件的优化22
实验五耐高温酵母菌株的诱变选育24
实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵27
耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究
实验一酵母菌的培养与分离
一、实验目的
学习培养和分离酵母菌的技术和方法
二、基本原理
大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5-6,常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。
酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。
三、实验主要内容和要求
（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：
1．马铃薯葡萄糖培养基,乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。
2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。
3.酵母菌的分离,要求接种一次,28-30C,培养24小时，转接一次，28-30C,培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。
4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下
为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。
四、实验的准备
1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：
原料：
马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）配制方法：
（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml，制成20%的马铃薯汁。
⑵在20喲马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115C条件下高压灭菌20分种。
（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：
配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸的量加入，并分装试管。
五、实验设计
l、接种：
取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置
28-30°C，培养24小时，可见培养液变混浊。
2、培养，用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28一30C再培养24小时或稍长（过长则霉菌长出）。
3、观察：
用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。
活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。
4、分离：
马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。
用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落。
挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养。
六、实验注意事项
1.配制培养基时，应注意琼脂的加量，不同规格及批次的琼脂的加量应由实验确定，不能照搬书上的加量。
2.对培养基加热时应注意琼脂的糊底与暴沸。
3.灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。
4.接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。
七、实验结果的观察及记录
1.24小时，观察试管内培养液的情况并作记录，每组转接2支试管。
2.48小时，观察试管内培养液的情况，镜检培养液内菌的数量，粗略判断是否为酵母菌并作记录，每人蘸取培养液进行划线分离，并作记录。
3.72小时后，观察培养皿内菌的生长的情况，挑取单个菌落进一步划线分离，直到为纯菌落。
4.每组转接10支斜面试管，备用。
八、实验的延伸
自然条件下酿造苹果酒，葡萄酒、猕猴桃酒。
七实验报告要求
1.实验完毕后，每位同学都应独立作出实验报告，实验报告应类似于小型论文格式。
2.实验报告内容包括：
（1）立题意义。
（2）实验设计。
（3）实验步骤详细记录。
（4）对实验结果的分析讨论和总结。
（5）实验延伸。
（6）实验心得体会。
附1：
果酒的酿制方法
—、目的要求了解果酒酿制原理，学习苹果酒酿制技术。
二、基本原理
果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。
它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。
其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。
各种果酒以原料而称名。
除坚果外，所有栽培果，野生果均可做酿果酒的原料。
本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。
三、实验材料
1、菌种在7°Be'麦芽汁琼脂斜面培养基上的葡萄酒酵母（s.cerevisae
ellipsoieleus）。
2、器材苹果汁培养基，7°Be'麦芽汁培养基，10ml/管、100ml/三角瓶等装量，白糖，食用酒精，亚硫酸，果胶酶，发酵缸，破碎机，果汁分离器等。
a.苹果汁培养基
粗滤新鲜果汁（蔗糖调至13°Be,酸度0.5%以下）1000ml
K2HPO40.1gMgSO4-7H2O0.1g
配好后，加热煮沸3〜5分钟，静置10小时以上，过滤、分装，0.7Kg/cm2灭菌20分钟。
四、实验步骤
（一）酒母培养
1、菌种活化（一级种）取装有10ml苹果汁或7°Be'麦芽汁培养基1支，按无菌操作法接种葡萄酒酵母菌一环，混匀后置28〜30°C下培养2〜5天（用苹果汁活化菌种时需培养5天以上），镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。
2、母发酵剂制备（二级种）在装有100ml苹果汁培养基的三角瓶中，接1〜2ml经活化的葡萄酒酵母菌液，于28C下培养2〜3天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。
3、生产发酵剂的制备（三级种）方法与母发酵剂相同，只是采取更大的容器。
一般采用500〜1000ml的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积1/2〜3/5的果汁培养液，灭菌冷却后，按10%接种量接人母发酵剂，在25〜28C下培养24〜48小时，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。
4、如果使用活性干酵母，添加量为20g/L发酵醪，复水用水量是干酵母重量的5〜10倍。
复水用水的温度应保持在40C左右（38〜43C），将酵母静置5〜10min后搅拌，酵母在水中的时间不能超过30min。
然后使酵母溶液缓慢冷却到与将被接种发酵醪的温差小于10C，然后直接加入发酵醪。
（二）果酒生产
工艺流程如下：
果胶酶
苹果一分选除杂下清洗一破碎一压榨一粗果汁一果楂、苹果酸、丹宁
活化酵母f母发酵剂f生产发酵剂
蔗糖f发酵f皮渣分离f后发酵f原酒f
f换捅除渣f贮存陈酿f配制f贮存f澄清过滤f装瓶f巴氏灭菌f封口f成品。
（2〜3次）操作要点：
1、分选取成熟苹果，除去腐烂、干疤和伤果。
2、清洗清水充分洗涤，除去果皮上的污物、杂质及药剂，以保证原料干净卫生。
3、破碎为易于压榨，提高出汁率，需进行破碎。
用破碎机破碎至果块粒度0．5cm3左右，并除去果籽。
4、压榨分离破碎后立即进行压榨分离。
分离出的果汁中不得夹带果肉，同时需添加适量苹果酸调整含量（要求果汁总酸含量为5g/L）,并加入0.1〜0.15g/L的果胶酶，促进果胶分解，使果汁澄清并提高酒的风味。
由于苹果汁易被自身含有的多酚氧化酶氧化，故需加SQ还原剂抑制酶活性，同时SQ
也具有杀菌、防腐和澄清果汁作用。
SQ来源，除工厂应用液态SQ外，实验室常加入亚硫酸钠（N&SQ）和偏重亚硫酸钾（K2SQ），其用量为果汁量的0.02%即可。
5、前发酵取澄清果汁放入经干热灭菌的发酵缸中，装量占缸容积的4/5，按3〜5％
的接种量接入酵母生产发酵剂进行发酵，保持品温在18〜22C之间，最高勿超过25C,
发酵应在7〜12天内结束。
一般苹果汁糖分约为11%，经发酵后，酒精含量约达6%以上，前发酵结束后，原酒酒度应大于8%（V），残糖v20g/L,总酸（苹果酸）〉5g/L。
6、后发酵前发酵结束后，迅速将酒液与皮渣分离，酒汁转入经干热灭菌的发酵缸
中，进行后发酵，使残糖继续分解。
期间，控制品温在18〜22C之间，不要超过25C,
时间1个月，即得原酒。
要求残糖含量小于2g/L以下，挥发酸（以醋酸计）小于0.6g/L，总酸（以苹果酸计）大于5g/L。
7、换桶除渣为使已澄清的原酒与其酒脚（沉淀物）及时分离，以免酒脚产生异味而影响酒质，故需进行换桶（缸）。
换桶次数新酒每年换三次。
8、贮存陈酿应满桶贮存。
陈酿即酒的老熟，经长期密闭贮存，可使酒质澄清、风味醇厚。
贮存室温8〜16C，存期半年以上。
9、配制原酒贮存半年后可开始配制。
配制时，按工艺规定将不同原酒按一定配比相混，然后添加适量的糖、酒精、继续贮存半年以上。
10、澄清过滤可采用冷冻法使其澄清，即于-4C左右存放7天，然后冷过滤。
澄清后的酒置-5〜-7C下冷冻3天不发生混浊沉淀，或暴露空气中氧化4天不变混浊即为合格。
11、装瓶灭菌装瓶后需进行巴氏灭菌，即在63r下处理15分钟，冷却后封口保存。
五、实验报告
1、简述苹果酒的酿制法。
2、二氧化硫在果酒酿制中的作用是什么？
六、思考题
1、酵母菌酿酒的原理是什么？
2、果酒酿制中为何要加入果胶酶？
实验二酵母菌的鉴定
酒精生产中所用酵母菌在微生物学中的分类依据是什么?
微生物学的类别分门、纲、目、科、属、种，生产酒精用酵母菌属于微生物中的真菌门、子囊菌纲、原子囊菌亚纲、内孢霉目、内孢霉科、啤酒酵母属、卡尔斯伯酵母属等。
酵母菌的分类依据是根据它的形态特征、生理生化反应特征来确定的。
在分类前将菌体细胞进行分离纯化，得到由单细胞长成的菌落，然后再进行形态特征和生理生化鉴定。
（一）形态特征的鉴定
把酵母菌接种到麦芽汁固体培养基上，让它长成菌落，观察其菌落的形态、颜色、质地、边缘、表面等特征。
把它再接种到液体麦芽汁培养基中，观察是否能产生醭、试管或培养仪器表面壁上能否形成菌环，培养液中是否产生沉淀、混浊程度等。
另外，还要取样在显微镜下观察其单细胞的形态、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。
（二）生理生化特征的鉴定
酵母菌的生理生化特征主要表现为发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类的能力。
同时，还需测定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸盐还是硫酸盐，发酵产酸、产醋、耐温、耐酸、抗重金属离子、抗杂菌性等的能力。
最后，根据以上得出的形态特征和生理生化特征，查阅有关资料，把具有相同特征的一类酵母菌，就可以归属于某一属。
怎样鉴定酵母菌在液体培养基中的培养特征?
将酵母菌种接种于米曲汁或麦芽汁液体培养基中，放于恒温培养箱内以28—30°C保温
培养18—24、24—48、48—72小时，取出观察各个时期液体培养基表面有无白色浮膜物-
醭的存在，各个不同时期培养基中有无沉淀或沉淀的多少、有无混浊和混浊程度、试管或其它培养器壁上有无菌环形成，最后取出各个不同时期的样液，注入酵母细胞计数器--血球计中，放置显微镜下观察单个细胞的形态变化情况、液泡的大小、细胞数增加的多少以及培养基中pH值的变化情况等，并测定其酒精和二氧化碳的生产量。
然后根据不同的反应情况，作好详细的原始记录，便于以后培养菌种时比较和参考。
酵母菌生理生化试验
一、酵母菌糖发酵试验
（一）实验目的了解鉴别酵母菌的实验方法。
（二）实验原理酵母菌在厌氧条件下能分解糖类，产生各种有机酸、气体和其它产物。
酵母菌种类不同对各种糖类的发酵能力各异。
因此，这是鉴别酵母菌种类的一项重要依据。
酸的产生可根据培养基中溴甲酚紫（pH6.8-5.2由紫变黄）或溴麝香草酚蓝（pH7.6-6.0由蓝变黄）指标剂颜色的改变来确定。
产气可由发酵管气泡的产生予以证实。
（三）材料
糖发酵基础液，1.6%溴甲酚紫或0.2%溴麝香草酚蓝溶液，葡萄糖、乳糖、半乳糖和麦芽糖，啤酒酵母斜面菌种。
（四）实验内容
1、糖发酵基础液配制好后，按培养液容量的1%加入糖，分装于杜氏发酵管中（培养液的高度约为4-5厘米），再在试管内加入倒置的小玻管（约0.4X2.0—2.5厘米）一支。
每种糖设三个重复管，＜121C＞高压灭菌15分钟。
2、将酵母分别接入上述各发酵管中，置＜30C＞下培养48-72小时，另以不接种者作对照
3、如产酸则培养液pH值下降而变黄色；如产气，则必先产酸，并在杜氏小管顶端出现气泡。
4、结果记录。
以“”表示产酸，“＜0”＞表示产气，“＋”表示产酸产气，“—”表示无变化，“碱”表示产碱。
二、酵母菌碳源同化试验
（一）实验目的了解酵母菌对各种碳源的利用情况。
（2）实验原理
碳是酵母菌细胞的重要组成成分，约占酵母菌体重量的50%，为酵母菌生命活动提供所需
的能量和组成其结构的物质。
酵母菌对各种碳源的利用，因种类不同而异。
这是酵母菌分类鉴定的一个重要依据。
（3）材料
无碳基础培养基，啤酒酵母斜面菌种，0.5%的葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖溶液。
（4）实验内容
1、液体试管法
（1）每管加无碳基础培养基5毫升，加被测试的某种碳源，并以葡萄糖作为对照。
（2）接入啤酒酵母，＜28C＞下培养1-2周，观察结果。
2、生长图谱法
（1）无碳培养基内加入2%勺水洗琼脂，融化后冷却至45＜-50C＞，到至平板。
（2）接种新鲜培养的啤酒酵母于1毫升无菌生理盐水内，搅匀后倒入上述未凝平板内，摇匀待凝。
（3）皿底用特种蜡笔写上被测试各种碳源勺标记。
（4）用不锈钢匙，按标记加入相应勺米粒大小勺碳源，并以葡萄糖作对照。
（5）＜28C＞下培养24-48小时后观察结果。
3、结果观察
（1）液体试管中是否形成醭，环岛等。
（2）生长图谱中测量菌落大小，说明对碳源勺利用情况。
三、酵母菌氮源同化试验
（1）实验目勺了解酵母菌对各种氮源勺利用情况。
（2）实验原理酵母菌蛋白酶不分泌于菌体外，故酵母菌对复杂勺蛋白质不能利用，酵母菌对一些较简单
勺含氮化合物勺利用程度也不一致。
（3）材料
无氮基础培养基，啤酒酵母斜面菌，0.5%勺蛋白胨、硫酸铵、硝酸铵和尿素溶液。
（四）实验内容
1、液体试管法方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮源作空白对照。
2、生长图谱法方法同二，以被测试的氮源代替碳源，不加任何氮化物作空白对照。
3、结果观察
（1）液体试管中溶液pH值的变化。
（2）生长图谱中测量形成菌落的大小，说明对各种氮源的利用情况。
四、酵母菌生长曲线的测定试验
（一）实验目的掌握单细胞微生物群体生长曲线的几种测定方法。
（二）实验原理酵母菌属于单细胞真核型微生物，把一定数量的酵母菌接种于的液体培养基中，在适宜的温度下培养时，它的生长过程具有一定的规律性。
在其生长过程中，定时取样测定酵母菌细胞数量，然后以酵母菌细胞数的对数作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制所得的曲线叫生长曲线。
此生长曲线大致可划分为四个阶段：
调整期、对数生长期、稳定期和衰退期。
（三）材料酵母菌增殖培养基，苹果酒酵母斜面菌种。
（四）实验内容
1、将培养24小时左右的酵母斜面菌种，用无菌水洗下菌苔，以3000转/分的速率离心，得菌体。
将酵母菌体沉淀物再用无菌水洗2-3次后，制备酵母菌悬液（细胞数量约106左右/毫升），测数备用。
2、取上述菌悬液1毫升于盛有清亮的酵母增殖培养液的试管中，<25C>下培养，以此为起始时间，记录起始溶液的细胞数。
并在培养1，2，4，6，8，9，10，11，12，14，16，20，22，24小时时分别取样检测酵母菌细胞数量。
3、酵母菌细胞数量的检测
方法①：
活菌计数法。
此法是将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，取一定量体积
（在0.1-1毫升之间）的稀释液涂布于盛有固体培养基的培养皿内，在<25C>下培养24
小时左右，计算培养皿内菌落数就可测出溶液中活菌数量。
方法②：
血球计数板计数法。
此法是先将以上定时取出的被检样品作一系列稀释后，使菌落数约为105-106个/毫升，取一滴稀释液滴于血球计数板内，在显微镜下直接计算细胞总数。
4、绘制生长曲线以酵母菌细胞数的对数作为纵坐标，以培养时间作为横坐标，画出酵母菌的生长曲线。
并分析酵母菌群体的生长规律。
五、实验结果的观察及记录（见表1－2）
六、思考题
1.为什么碘液反映无色糖化即可结束？
2.煮沸强度对麦芽汁质量有什么影响？
表1酵母菌分属鉴定结果
菌种号
形态特征
生理特征
群体
个体
假菌丝
子囊孢子
葡萄糖发酵
类淀粉化合物的生
成
硝酸钾同化
肌醇同化
其他
巨大菌落
沉
淀
瞨
环
岛
细胞形状大小
无性繁殖方式
Kleyn
Gorodkow
a
马铃薯块
石膏块
表2酵母种的鉴定结果记录
菌株
形态特征
生理特征
糖发酵
糖同化
菌落
瞨膜
细胞形态大小
无性繁殖方式
假菌丝
子囊孢子
葡萄糖
乳糖
半乳糖
麦芽糖
蜜
糖
蔗糖
棉子糖
葡萄糖
乳糖
半乳
糖
麦芽糖
蔗糖
纤
维
糖
蜜
糖
海藻糖
L阿拉伯糖
D阿拉伯糖
棉子糖
D木糖
可溶性淀粉
山梨糖
菌株
氮源同化
醇类同化
在无
其他
维生素需要
硝酸钾
硫酸铵
乙醇
甘油
山梨醇
卫矛醇
赤藓醇
阿东醇
肌醇
甘
露
醇
维生素培养基上生长
牛奶反应
油脂分解
抗放线菌酮
产生类淀粉
于
37C
生长
耐高渗透压
生物素
微生素
B
微生素
B2
微生素
B6
微生素
Bl2
叶酸
烟酸
泛酸钙
对氨基苯甲肚厶
酸
附1麦芽汁培养基的制备：
麦芽汁制备俗称糖化。
所谓糖化是指将麦芽和辅料中高分子贮藏物质（如蛋白质、淀粉、半纤维素等机器分解中间产物）通过麦芽中各种水解酶类（或外加酶制剂）作用降解为低分子物质并溶于水的过程。
溶解于水的各种干物质称为浸出物，糖化后未经过滤的料液称为糖化醪，过滤后的清夜称为麦芽汁，麦芽汁中浸出物含量和原料干物质之比（质量分数）称为无水浸出率。
方法一
（1）取50g麦芽，在EBC标准磨上粉碎；
（2）将已经粉碎好的麦芽粉放入已称重的糖化杯中，力卩200mL46C水，不断搅拌并在46C
水浴中保温30min；
（3）使醪液以「C/min速率升温到70C。
此时杯内加入100mL7（T水，保持恒温。
（4）5min后用玻璃棒取麦芽汁1滴，置于白滴板上，再加碘液1滴，混合后观察碘液颜色变化。
直到碘液呈纯黄色不再变色，停止保温，糖化结束。
（5）在10~15min内急剧冷却到室温；
（6）冲洗搅玻璃棒拌器，擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g；
（7）用玻璃棒搅拌糖化杯，并注于漏斗中进行过滤，即获得麦芽汁。
方法二
称取市售麦芽粉或大麦经浸泡、发芽、干燥、粉碎的麦芽粉，按每Kg麦芽粉加入60—65C温热水3.5—4kg。
于55—60C保温糖化3-4小时，用碘液检查，然后4层纱布过滤，过滤液中加鸡蛋白加水20mL调匀之生出丰富的泡沫为止，然后倒在糖化液中搅拌煮沸后用4
层纱布过滤，即得到澄清、透明的麦芽汁，灭菌后方可备用。
附2酵母菌鉴定常用培养基
1.酵母菌生孢培养基
（1）麦氏琼脂
葡萄糖
1g
KCL
1.8g
酵母浸膏
2.5g
醋酸钠
8.2g
琼脂
12g
蒸馏水
1000ml
115C灭菌20min
2）胡萝卜培养基
将葫萝卜切成的6~7cm的长条，下后上薄，装入培养管中，加水1ml,杀菌，即成
（3）Gorodkowa氏培养基
消化蛋白
1g
葡萄糖
0.1g
氯化钠
0.5g
琼脂
1.2g
水
100ml
2.12.5％豆芽汁培养基
黄豆芽125g加1L,煮沸半小时，过滤后补足水至1L。
115C灭菌30min
3.0.6％酵母浸汁
加60g干酵母粉于1L水中，必要时加入一些蛋清以澄清滤液，121T灭菌15min,趁热用双层滤纸过滤；115C灭菌15min。
4.同化碳源基础培养基
（NH4）2S040.5%,KH2P040.1%，MgS04-7H200.05%,酵母膏0.02%，水洗琼脂2%。
115C灭菌15min
同化碳源液体培养基
（NH）2SO0.5%,KHPQ,MgSQ7H2O0.05%,CaC2-2H2O0.01%.NaCI0.01%,酵母膏0.02%，糖或其它碳源0.5%。
用蒸馏水配，培养基过滤后分装小试管，每管3ml,115°C灭菌20min。
5.同化氮源基础培养基
葡萄糖2%，KHPQ0.1%，MgS07H200.05%酵母膏0.02%，水洗琼脂2%。
用蒸馏水配，培养基过滤后分装大试管，每管20ml,115C灭菌15min。
附3酵母各属检索表
（一）1.生子囊孢子（简称孢子），营养细胞芽殖
（二）。
2.生子囊孢子，营养细胞裂殖或兼有芽殖（三）。
3.不
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