实验一血清蛋白质测定(范玉平).ppt

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1临床检验生物化学实验的教学目的：

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临床检验生物化学实验的教学目的：

指导学生掌握实验的基本操作和基本技能，指导学生掌握实验的基本操作和基本技能，树立实事求是的科学态度和科学作风，并通过实树立实事求是的科学态度和科学作风，并通过实验过程培养学生分析问题和解决问题的能力；在验过程培养学生分析问题和解决问题的能力；在专业理论知识的基础上，培养学生具有创新思维专业理论知识的基础上，培养学生具有创新思维和初步从事科研的能力；与时俱进，培养学生面和初步从事科研的能力；与时俱进，培养学生面对临床、面对市场，具有从事临床生化实验室实对临床、面对市场，具有从事临床生化实验室实际工作的能力。

际工作的能力。

生化实验室规则money净2桌面，边台，水池，窗台，仪器要桌面，边台，水池，窗台，仪器要一尘不一尘不染染，请值日生用抹布擦，请值日生用抹布擦干净干净。

1实验课结束后，请大家把凳子摆放实验课结束后，请大家把凳子摆放整齐整齐。

3值日生最后扫地和拖地，值日生最后扫地和拖地，关闭关闭水电门窗，水电门窗，带教老师带教老师检查合格检查合格后方可离开教室。

后方可离开教室。

4实验报告下次实验课前交给老师。

实验报告下次实验课前交给老师。

10实验一实验一血清蛋白质测定血清蛋白质测定一、血清总蛋白质测定（双缩脲法）一、血清总蛋白质测定（双缩脲法）二、血清白蛋白测定（溴甲酚绿法）二、血清白蛋白测定（溴甲酚绿法）三、三、A/G比值计算比值计算方法学介绍方法学介绍蛋白质测定方法很多，常用的有：

蛋白质测定方法很多，常用的有：

n化学法n物理法n染料结合法等一一.化学法化学法凯氏定氮法：

凯氏定氮法：

用于测定生物物质中总氮含量的方法，其准确度高、精密度好，成为测定蛋白质的最经典的标准方法，但由于其测定手续繁琐，操作复杂，费时，除用作血清蛋白质标准品定值及参考性测定工作外，现已很少在血清总蛋白测定中使用，不适合血清TP的常规测定。

一一.化学法化学法n酚试剂法：

酚试剂法：

灵敏度较高，可用于测定脑脊液和尿液中的微量蛋白质，但由于该法是先测定出酪氨酸的量，再根据酪氨酸在蛋白质中含量而得出蛋白质的含量，因而准确度较差。

一一.化学法化学法双缩脲法：

双缩脲法：

测定蛋白质最古老的方法之一，此反应的优点是对白、球蛋白产生的颜色反应相近，干扰物质小，且不受温度影响，唯一的缺点是灵敏度较低，比酚试剂法低约100倍。

但本法的检出限为0.21.7g/L，这相当于70g/L的血清324l，已能满足临床生化检验的需要，成为临床实验室血清TP首选的最方便，实用的常规方法。

二二物理法：

物理法：

又可分为紫外吸收法、折射法和重量法等。

除紫外吸收法外，其他方法现已很少使用或被淘汰。

三三蛋白质与染料结合的方法蛋白质与染料结合的方法是比较灵敏而特异的一类方法。

用的较多的染料有丽春红、考马斯亮蓝G250和邻苯三酚红钼。

丽春红蛋白结合法测得的结果与凯氏定氮法相符，并且显色后在室温可稳定24小时；考马斯亮蓝G250结合蛋白法灵敏度高，特异性强，操作简便，广泛用于尿蛋白，脑脊液蛋白及各种微量蛋白的检测，但该方法测定蛋白浓度的线性范围不宽，与白、球蛋白反应的灵敏度不同，反应强度亦受温度的影响，且比色杯吸附色素而干扰测定，不能用于自动化分析仪，因此该法的应用受到了一定的限制；邻苯三酚红钼络合显色法克服了考马斯亮蓝G250结合蛋白法的上述缺点，且具有简便、稳定等优点，可用于自动化分析仪。

双缩脲法测定血清总蛋白双缩脲法测定血清总蛋白【目的与要求目的与要求】1.掌握双缩脲法测定血清总蛋白的原理和方法；2.掌握分光光度计的使用方法和日常维护；3.熟悉血清总蛋白各种测定方法的原理和优缺点。

18【原理】血清（浆）中蛋白质的肽键（-CO-NH-）在碱性溶液中能与2价铜离子作用生成稳定的紫红色络合物。

此反应和两个尿素分子缩合后生成的双缩脲（H2N-OC-NH-CO-NH2）在碱性溶液中与铜离子作用形成紫红色的反应相似，故称之为双缩脲反应。

这种紫红色络合物在540nm处有明显吸收峰，吸光度在一定范围内与血清蛋白含量呈正比关系，经与同样处理的蛋白质标准液比较，即可求得蛋白质含量。

双缩脲法测定血清总蛋白双缩脲法测定血清总蛋白19【试剂与器材试剂与器材】16mol/LNaOH溶液溶液2双缩脲试剂3双缩脲空白试剂46070g/L蛋白质标准液5仪器分光光度计。

20【试剂与器材试剂与器材】大试管4支1ml吸管支5ml吸管2支洗耳球只操作步骤操作步骤n1.取试管4支，标明测定管（U）、标准管（S）、标本空白管（B）、试剂空白管（RB）。

操作步骤操作步骤2.按下表操作。

加入物（ml）空白管标准管样本管血清0.05蛋白标准液0.05蒸馏水0.05TP试剂3.03.03.0混匀,37度孵育20分钟,540nm比色,空白管调零操作步骤操作步骤n3.混匀，置2530min或3710min，n4.在波长540nm处比色，用蒸馏水调零，测各管吸光度。

n5.手工操作参数：

手工操作参数：

波长540nm，光径1cm；温度：

室温（18-26）；模式：

终点法；反应时间：

30min，样本量：

100ul，试剂量：

5ml.5.计算计算血清总蛋白（g/L）=样本管吸样本管吸光度光度xC标准（g/L）-标准管吸光度标准管吸光度血清总蛋白血清总蛋白参考范围参考范围正常成人血清总蛋白参考范围6080g/L。

长久卧床者约低3-5g/L，60岁以上约低2g/L，新生儿TP浓度较低，随后逐月缓慢上升，大约1岁后达成人水平。

【注意事项注意事项】1.测定的血清以新鲜为宜，但在冰箱保存而不混浊的标本也可应用，高脂血症混浊血清会干扰比色，可采用下述方法消除：

取2支带塞试管或离心管，各加待测血清0.1ml，再加蒸馏水0.5ml和丙酮10ml，塞紧并颠倒混匀10次后离心，倾去上清液，将试管倒立于滤纸上吸去残余液体。

向沉淀中分别加入双缩脲试剂及双缩脲空白试剂，再进行与上述相同的其他操作和计算。

【注意事项注意事项】2.胆红素和血红蛋白本身的颜色可引起吸光值增加，造成阳性干扰，但经样品空白校正后可忽略不计。

由于血红蛋白本身能与双缩脲试剂反应，产生与血清白蛋白和球蛋白相近的显色效价，故应注意高血红蛋白的影响。

【注意事项注意事项】3.酚酞、溴磺酞钠在碱性溶液中呈色，影响测定结果，右旋糖酐可使测定管混浊亦影响结果，理论上这些干扰均可用相应的标本空白管来消除。

【注意事项注意事项】n4.蛋白质与双缩脲试剂反应生成紫色复合物的吸光度与试剂的组分、pH、反应温度以及蛋白质的性质有关，所以在做蛋白质标化测定时，实验仪器的技术状态和反应条件等都必须严格加以控制。

【注意事项注意事项】5.血清蛋白质的含量一般用g/L表示，因为各种蛋白质的分子量不同，不能用mol/L表示。

注意要点：

1黄疸血清，溶血，高糖，酚酞等干扰用样本空白来消除。

2加入显色剂要准确，加入后立即混匀。

3.本反应是TP的最常用和方便的方法，也便于自动化分析。

4.其与蛋白质中的肽键成正比关系，与蛋白质的种类及AA的组成无明显关系.【临床意义临床意义】1血清总蛋白浓度降低

（1）蛋白质合成障碍

（2）蛋白质丢失增加（3）营养不良或消耗增加（4）血浆稀释2血清总蛋白浓度增高

（1）蛋白质合成增加

（2）血浆浓缩血清白蛋白测定血清白蛋白测定血清白蛋白测定法主要有色氨酸含量法、染料结合法、电泳法、免疫化学法和电化学测定法，但目前国内最常用的是染料结合法中的溴甲酚绿法。

血清白蛋白测定（血清白蛋白测定（BCG法）法）【目的与要求目的与要求】1.掌握BCG法测定血清白蛋白的原理和方法及影响因素、条件控制；2.熟悉微量加样的基本技能；3.了解血清白蛋白各种测定方法的优缺点。

血清白蛋白测定（血清白蛋白测定（BCG法）法）【原理原理】血清白蛋白在pH4.2的缓冲液中带正电荷，在有非离子型表面活性剂存在时，可与带负电荷的染料溴甲酚绿（bromocresolgreen，BCG）结合形成蓝绿色复合物，在波长630nm处有吸收峰，其颜色深浅与白蛋白浓度成正比例，与同样处理的白蛋白标准比较，可求得血清中白蛋白含量。

【试剂试剂】10.5mol/L琥珀酸缓冲贮存液（pH4.0）210mmol/LBCG贮存液3叠氮钠贮存液4聚氧化乙烯月桂醚（Brij-35）贮存液5BCG试剂660g/L白蛋白标准液7.仪器分光光度计。

【操作步骤操作步骤】n取试管3支，标明空白管（B）、标准管（S）、测定管（U）n【操作步骤操作步骤】n按表操作。

加入物（ml）空白管（B）标准管（S）测定管（U）血清-0.01蛋白标准液-0.01-蒸馏水0.01-BCG试剂3.03.03.0【操作步骤操作步骤】在波长630nm处用空白管调零，用定量加液器加BCG试剂，与测定管血清混合后，立即在303s内，读取吸光度。

4.手工操作参数：

手工操作参数：

波长630nm，光径1cm；温度：

室温（18-26）；模式：

终点法；反应时间：

30s，样本量：

0.02ml，试剂量：

4ml计算结果计算结果血清白蛋白（g/L）=AA测定测定xC标准（g/L）-AA标准标准参考范围参考范围正常成人血清白蛋白参考范围:

3555g/L。

*注意注意:

如标本因严重高脂血症而混浊，需加做标本空白管（取血清0.02ml，加入琥珀酸缓冲贮存液4.0ml），用琥珀酸缓冲贮存液调零，测定标本空白管吸光度。

用测定管吸光度减去标本空白管吸光度后，再计算结果。

【注意事项注意事项】1.BCG是一种pH指示剂，变色域为pH3.8（显黄色）5.4（显蓝绿色），受酸、碱影响较大，故所用的器材必须无酸、碱污染，BCG工作液的pH必须精确度监测，务必使其保持在pH4.150.05限度内。

【注意事项注意事项】2.BCG与球蛋白的反应强度与环境温度有关（温度升高，呈色加速加深）。

BCG工作液中的表面活性剂虽有延缓BCG与球蛋白的非特异性反应的作用，但亦将测定标本与标准液置于同一温度下操作，以抵消温度的干扰作用。

【注意事项注意事项】3.Brij-35是非离子型表面活性剂，其浓度大小对结果测定有影响，浓度越大，吸光度越低，但显色稳定。

Brij-35也可用其他表面活性剂代替，如吐温-20或吐温-80，终浓度为2ml/L，灵敏度和线性范围不变。

【注意事项注意事项】4.实验证明，BCG不但与白蛋白呈色，而且与血清中多种蛋白质成分呈色，其中以1-球蛋白、运铁蛋白、结合珠蛋白更为显著，其反应速度较白蛋白稍慢。

由于在30s内呈色对白蛋白特异，故BCG与血清混合后，在30s读取吸光度，可明显减少非特异性呈色反应。

为了减少本法基质效应的影响，最好用参考血清作标准。

【方法学评价方法学评价】1.本法操作简便、快速，胆红素和一般脂血对测定无明显干扰。

【方法学评价方法学评价】2.血红蛋白和BCG产生与白蛋白相等的颜色强度，血红蛋白在1g/L以下无明显干扰，2g/L使吸光度增高3.2%，3g/L使吸光度增高7.4%，4g/L使吸光度增高7.7%，5g/L使吸光度增高8.8%，所以溶血标本不宜做BCG法白蛋白测定。

【方法学评价方法学评价】3.本法既可手工操作，也能自动化分析，是目前国内测定血清白蛋白的最常用方法。

本法线性范围为1060g/L，RCV4%。

但该法与溴甲酚紫法比较，对血清白蛋白特异性稍差。

三、三、A/G比值计算比值计算1.用双缩脲法测定血清标本中总蛋白浓度，用溴甲溴甲酚绿法测定血清白蛋白酚绿法测定血清白蛋白浓度,2.总蛋白浓度减去血清白蛋白浓度即为球蛋白浓度3.求得血清白蛋白、球蛋白比值（A/G比值）。

4.参考范围A/G1【临床意义临床意义】1.血清白蛋白浓度降低2.血清白蛋白浓度增高脱水3.A/G4.先天性Alb缺乏症【思考题思考题】1.阐述BCG法测定血清白蛋白的影响因素及条件控制？

2.BCG与血清混合后，为什么要在30s读取吸光度？

生化实验报告书写生化实验报告书写n目的n原理n操作步骤n结果（计算）n注意事项n思考题答案