RedET重组及其在生物医学中的应用解析只是分享.docx

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RedET重组及其在生物医学中的应用解析只是分享

21卷3期2005年5月

生　物　工　程　学　报

ChineseJournalofBiotechnologyVol.21　No.3

May　2005

RedΠET重组及其在生物医学中的应用

RedΠETRecombinationanditsBiomedical王军平

13

张友明

2

WANGJun2Ping13and　ZHANGYou2Ming2

11,重庆　40003821基因桥研究室,11StateKeyLaboratoryof,andInjury,InstituteofCombinedInjury,CollegeofPreventiveMedicine,TheThirdMilitaryMedical

University,Chongqing　400038,21GeneBridgeGmbH,Dresden01307,Germany

αβ系统而建立的DNA工程平台—摘　要　通过应用Rac噬菌体的RecEΠRecT和λ噬菌体的RedΠRed——RedΠET重组,是一种不依赖于限制性内切酶的分子克隆新技术。

运用该技术能够介导PCR产物或寡核苷酸对目标基因进行剪切、插入、融合及突变等多种操作,在生物医学领域里具有广阔的应用前景,尤其在基因组功能研究中对BACs、PACs和细菌染色体的打靶修饰以及基因敲除动物DNA靶分子的快速构建等方面最有效。

随着RedΠET重组的推广与应用,该技术本身也在不断被改进,在工作效率得到显著提高的同时,其操作也变得更加简单、省时、省力。

结合自身的一些研究结果,对RedΠET重组的技术特点、发展现状和在生物医学中的应用进行了详细阐述。

关键词　RedΠET重组,DNA修饰,BACs,噬菌体

中图分类号　Q78　　文献标识码　A　　文章编号100023061（20050320502205

Abstract　RedΠETrecombination,apowerfulhomologousrecombinationsystembasedontheRedoperonofλphageorRecEΠRecTfromRacphage,providesaninnovativeapproachforDNAengineering.Deletion,insertionandmutationcanbequicklyandpreciselyperformedonthetargetgenemediatedbyRedΠETrecombinationwithPCRderivedDNAfragmentsoroligonucleoti2des.Thistechnicalplatformhasextensiveapplicationsinbiomedicalfieldincludingbacterialartificialchromosomemodification,geneknock2outconstructionandgeneticmodificationofE.colistrainsaswellassomeotherkindsofmicroorganisms.Recently,RedΠETrecombinationwasimprovedinseveralaspectssothatitbecomesmorepowerfulandmaneuverable.ThecharacteristicanddevelopmentofRedΠETrecombinationanditsbiomedicalapplicationsweredescribedinthisreview.Keywords　RedΠETrecombination,DNAmodification,bacterialartificialchromosomes,phage

　　随着包括人类基因组计划在内的各种基因组测序工程的实施与完成,以序列信息为基础的基因组功能研究随即成为生命科学领域的又一重大课题[1]。

相对于测序工程,基因组的功能研究就更加复杂和困难。

对于某一特定基因,要想彻底了解其生物学作用,往往需要对包含基因完整信息的基

因组DNA进行克隆、删除、突变等多种修饰,从而为后续的表达和功能研究奠定基础。

一般情况下,一个完整的哺乳动物基因包括内含子、外显子以及启动子等调控元件在内的全长DNA序列都在几十甚至上百个kb,另外,还有很多基因是以基因簇形式存在。

这种包含完整基因信息的基因组DNA

Received:

December29,2004;Accepted:

March4,2005.

ThisworkwassupportedbygrantsfromTheNationalNaturalSciencesFoundationofChina（No.30230360andTheTMMUFoundationforreturnee.

3Correspondingauthor.Tel:

86223268752283;E2mail:

wangjunp@yahoo.com

国家自然科学基金资助项目（No.30230360,第三军医大学留学回国人员启动资金资助。

王军平等:

RedΠET重组及其在生物医学中的应用

通常是经过建库方式被装载于BACs（bacterialartificialchro2

mosomes或PACs（P1artificialchromosomes等大容量载体

503

PCR将同源臂直接加在供体打靶片段的两侧。

经RecEΠRecT

介导,两端带有同源臂的供体分子就能直接插入到受体DNA靶分子的同源区部位。

通过改变同源臂的区域和它们中间的打靶序列,人们就可以达到对DNA靶分子进行插入、剪切等多种目的。

同理,如果将50bp的同源臂放在线性质粒载体的两端,通过该系统还可直接克隆或亚克隆DNA靶分子。

由于同源臂可以人为选择,和DNA分子大小的限制,ET克隆可以对任意大的

DNA中[2,3]。

对如此大的DNA分子,此时很难应用PCR和限制酶等传统分子克隆技术对其进行修饰。

另外,由于限制性内切酶和PCR都是在体外（invitro对DNA分子进行操作,所以碱基的无谓突变也常常困扰着实验的正常进行。

正是在这种情况下,一种基于噬菌体同源重组系统的

RedΠET重组技术应运而生,通过该技术可以简单、快速地对

任意大的DNA分子进行各种修饰,由于重组反应的整个过程都是在大肠杆菌细胞内部完成,因此就不存在碱基突变的危险,从而为基因功能研究提供了一个有效的前期操作平台。

本文结合我们自己的工作经验,对RedΠET原理、种另外,。

正因如此,

被国际同行专

家誉为分子生物技术领域的一场革命。

之后,包括Stewart研究小组在内的多个实验室又相继α和Redβ蛋白组合也具有与RecEΠ发现λ噬菌体的RedRecT类似的同源重组功能[9-12]。

值得一提的是,无论是RecEΠαβ所介导的同源重组,只有在recBCD2的大RecT还是RedΠRed肠杆菌中才能充分发挥作用。

其原因是recBCD作为大肠杆菌内非常强效的核酸外切酶,能够快速降解外源线性DNA分子,包括PCR产物和寡核苷酸[13]。

在应用RecEΠRecT和αβ实施同源重组时将recBCD的主要抑制分子—λRedΠRed——γ进行共表达,可使同源重组在噬菌体的Gam蛋白（Red

recBCD的大肠杆菌中同样发挥作用。

不同的实验室对

+

1　RedΠET,它是生物体用于纠正自身（DNA复制过程中产生或由外界因

素诱导所致DNA突变的一种内在机制,由体内的同源重组酶介导完成。

同源重组酶的作用机理不同于限制性内切酶,它不受酶切位点限制,只要供体和受体DNA分子间具有一段相同的碱基序列（即所谓的同源臂两者就能发生重组或替换（图1。

αβ所介导同源重组的命名也各不相RecEΠRecT和RedΠRed同。

除了上述的ET克隆外,还有ET和GET重组（GET

[14]

λ重组（λrecombination[11]、recombination、重组遗传工程

（Recombinogenicengineering[15]以及重组工程（Recombineer2

[16]

αβ所介导的同源重组ing等。

因为RecEΠRecT和RedΠRed

图1　同源重组示意图

Fig.1　ThesketchmapofhomologousrecombinationHA:

homologyarmA;HB:

homologyarmB.

可以相互通用,为了统一概念,最近Stewart将它们统称为

RedΠET重组（RedΠETrecombination。

在这里Red是指λ噬菌

αβγ,ET则代表了Rac噬菌体的Red蛋白组合（RedΠRedΠRed

[17]

体的RecEΠRecT。

同源重组酶有多种,不同的酶在进行同源重组时所需同源臂大小也不同,其中最为人们熟知的是大肠杆菌RecA系统。

应用RecA介导的同源重组,人们已经实现了多种形式的DNA修饰[4,5]。

近些年,有研究者又利用该系统对载有基因组DNA的BACs和PACs进行了成功修饰,为基因敲除、转基因等研究中上游靶分子的构建提供了一条有效途径[6,7]。

然而,由RecA介导的同源重组所需同源臂长度通常在1kb左右,这样长的同源臂要加载到供体打靶分子的两侧并不容

易,而且同源重组过程一般要经过重组（Recombination和拆分（Resolution两轮筛选,操作相对费时、费力,从而使其应用受到很大程度的限制。

1998年Stewart研究小组报道了另一种可在大肠杆菌中

2　RedΠET重组的作用机理及其应用方式

事实上,在RedΠET重组出现之前人们对RecE、RecT、α和Redβ这四种蛋白质就有研究,只不过所关注的是它Red

们与DNA双链断裂修复（Doublestrandbreakrepair,DSBR的α实际上都具有典型的5′关系。

研究揭示RecE和Red→3′核酸外切酶活性,它们能够由5′末端向3′末端酶切双链DNA

（包括PCR产物,使DNA分子的3′末端变成单链悬突（3′

[18,19]

β,体外结合实验和ssDNAoverhang。

对于RecT和Red

电子显微镜观察发现它们其实是一种具有退火（Annealing和链侵入（Strandinvasion功能的单链结合蛋白质[20,21]。

为此,人们推测RedΠET重组的作用机理可能是:

带有同源臂的α作用而使其两端形成单供体DNA分子首先经RecE或Red

β的引导下,供体分子的同源臂链悬突,然后在RecT或Red

单链悬突即可与受体分子的同源臂部分发生结合,最终导致供体与受体DNA分子发生重组和替换[22]（图2。

应用的同源重组技术,它是通过诱导表达Rac噬菌体的

RecE和RecT蛋白组合来介导实施重组反应,当时将这种技

术命名为ET克隆（ETcloning[8]。

与RecA介导同源重组不同的是ET克隆所需同源臂仅为35～50bp,且同源重组效率更高。

35～50bp的同源臂意义非同寻常,人们就可以通过

504

ChineseJournalofBiotechnology　生物工程学报　2005,Vol121,No13

并且这种修复效率的高低与所选用核苷酸链的性质有关,应用与受体DNA分子滞后链（Laggingstrand互补的寡核苷酸效果更好。

由于寡核苷酸可以体外快速合成,所以寡核苷酸修复的成功应用使RedΠET重组更加引起人们的重视。

RedΠET重组最初所使用的依托质粒是ColE1来源的

γ和pBAD2ETg和pBAD2gba,在这两个质粒中RecEΠRecTΠRedαβγ被置于PBAD,同源重组酶的表达RedΠRedΠRed受L2阿拉伯多糖诱导调控,9,,25]。

在以后的应用中人们逐渐发现,,。

为此,最近我们对RedΠET的依托,构建了低拷贝、温度敏感型pSC1012BAD2

gbaA质粒。

这种pSC101来源的质粒在每个细胞中拷贝数为

图2　Fig.2　TheofΠrecombination

3～5个,于30℃复制,37℃以上复制终止。

在实验过程中通

过简单、合理的改变宿主菌培养温度,就可使此依托质粒在行使完RedΠET重组功能后自动地从宿主细胞中消失。

这样就容易获得比较纯的修饰后重组体。

除了对依托质粒的类型进行优化外,我们还将RecA引进了RedΠET重组系统。

之所以引入RecA是因为常用工程菌都是RecA缺失突变的大肠杆菌,RecA缺失突变的目的是使外源质粒DNA尤其是

BAC复制稳定。

但RecA的缺失也会带来其它影响,研究表

RedΠET:

一是构建含

γ和Redαβγ的诱导表达型依托质有RecEΠRecTΠRedΠRedΠRed粒,通过共转染使依托质粒与受体和供体DNA分子进入同一细胞内,经诱导表达后即可发生重组反应

+

[8,9,23]

。

另外一

种方式是筛选和构建具有RedΠET重组功能的大肠杆菌菌株,如Zhang等通过对sbcA（RecEΠRecT大肠杆菌JC8679染色体上某些限制Π调节元件及内源性Lac操纵子进行突变缺失,获得了一株重组功能型工程菌—YZ2000[9];Yu等则是将突变失活的λ噬菌体整合到大肠杆菌的染色体中而构建了具有同源重组功能的DY330、DY380等菌株

[10,24]

明当RecA缺失时大肠杆菌接受外源DNA转化的效率将会显著降低[27]。

为此,在新的依托质粒中我们将RecA与αβγ一起置于PBAD启动子之后,使其与Red同源RedΠRedΠRed重组酶共同表达。

实验结果证实,RecA的瞬时表达可以通过促进外源DNA的转化而显著提高RedΠET的同源重组效率,使得低拷贝型的依托质粒具有高效的同源重组功能。

此外,人们对RedΠET重组介导非抗性基因打靶修饰时所使用的反向筛选系统也进行了多次改进。

在尝试了SacB2

Neo

[8,23]

。

这两种使

用方式各有利弊:

由于依托质粒的拷贝数要显著高于染色体的单一拷贝,所以前者提供重组酶蛋白的表达量和重组效率显著高于后者

[25]

;除了重组效率,应用依托质粒在BACs、

PACs或细菌染色体的修饰方面具有优势,因为依托质粒可

和TetR[28]后,Jamsai等[29]通过合理应用限制性内切

以随意转化宿主菌;但是,当受体DNA结构比较稳定,能够进行反复转化时,应用第二种方式相对简单、省时

[24]

酶Ⅰ2SceⅠ显著提高了反向筛选系统的严密性;我们则是选用了只有114kb的rpsL2Neo作为反向Π正向筛选标记基因,一方面便于PCR扩增以加载同源臂,另一方面又可采用卡那霉素和链霉素进行正、反向筛选,从而使RedΠET重组的操作过程更加简单、易行[17]。

;另外,

应用依托质粒时要涉及到重组结束后依托质粒的清除问题。

3　RedΠET重组的发展与改进

RedΠET重组技术的建立,让人们实现了以PCR产物作

为供体分子对目的基因的打靶修饰。

虽然这已经使同源重组的操作和应用向前迈出了历史性的一步,但是在某些情况下并不需要以PCR产物作为供体分子,所需的是仅仅包含两个同源臂的寡核苷酸短链,如点突变或蛋白标签的插入等。

为此,RedΠET重组建立后不久,人们即开始尝试应用体外直接合成的寡核苷酸来实施对目标DNA分子的修饰。

令人惊喜的是,研究发现70～100bp长（两侧各带35～50bp同源臂的双链和单链寡核苷酸,同样可以作为打靶分子来对

BAC进行点突变和插入等修饰Zhang等

[17]

[25,26]

4　RedΠET重组在生物医学中的应用

由于RedΠET重组在DNA修饰方面具有常规分子克隆技术无法比拟的优越性,通过选择同源臂的位置以及改变两个同源臂之间的打靶序列,人们可以达到对DNA靶分子进行插入、融合、剪切、敲除和突变等多种目的（图3,所以该技术在生物医学领域里具有广阔的应用前景和很高的实用价值。

目前,RedΠET重组在生物医学领域里应用最广泛的还是对载有基因组DNA的BACs、PACs进行修饰,为基因功能和表达研究提供有效的前期操作平台。

在具体应用过程中,当目的BACs或PACs仅需要删除某部分基因序列时,就可以通过RedΠET重组介导带有同源臂的抗性标记基因插入并替

α。

考虑到RecE和Red

对单链寡核苷酸可能不起作用,所以在上述发现的基础上

β的依托质粒,发现又构建了只表达RecT和Red

应用这种质粒进行单链寡核苷酸修复时也具有很高的效率,

王军平等:

RedΠET重组及其在生物医学中的应用

505

导实施大肠杆菌染色体的各种遗传修饰。

与常规转座子法相比,RedΠET重组介导的染色体修饰不仅高效、快速,而且还能准确定位。

应用这种重组技术人们对大肠杆菌染色体上的多个基因如arcB、cyaA、recA、ptsG等进行了敲除、替换等修饰,有目的地改良了一些生物工程菌株[11,30]。

除了工程菌外,一些致病大肠杆菌的遗传修饰也在引起人们的重视,如Murphy等[31]就通过该技术病大肠杆菌EHEC和

图3　RedΠET重组在DNA工程中的应用范例

Fig.3　TheapplicationsofRedΠETrecombinationinDNA

engineering

EPEC,为制备肠道感染病疫

。

不仅如此,借助合适此外,随着多种生物基因组DNABAC文库的构建和测序工作的实施与完成,人们应用RedΠET重组还可对病毒、噬菌体以及其它模式生物的基因组DNA进行有目的修饰[33],从而加速生物体的基因功能研究。

正是由于RedΠET重组在DNA修饰方面的独特优势,基于该技术的DNA工程操作已经开始向生物制药领域拓展,尤其对于那些通过常规分子克隆很难实现的生物工程药物的研制。

如运用这种重组技术对载有聚酮合成酶基因簇的柯氏质粒进行重排、突变、替换等修饰,从而去创造生成新的抗生素[34]。

最近,Eustaquio等[35]就利用此方法在对新生霉素基因簇进行替换修饰后获得了一种新的“杂合抗生素”。

换目的基因序列,这种BACs或PACs的一步法修饰在一周内即可完成[23,24]。

当需要在目的BACs或PACs一非筛选性基因（如LacZ、EGFP酸序列（如点突变、时,力,RedΠET重组才能达到修饰目的[17,25,,29]（图4。

5　结语

总之,作为生物工程领域里的一项革新性技术,RedΠET重组能够准确、快速地对目标DNA分子,尤其是基因组DNA大分子进行各种人为修饰,它的出现使以往通过传统分子克

图4　应用RedΠET重组介导BAC修饰的操作示意图

Fig.4　ThesketchmapofBACmodificationmediated

byRedΠETrecombination

csm:

counter2selectablemarker;sm:

selectablemarker;HA:

homologyarmA;HB:

homologyarmB;Cm:

chloramphenicol.

隆技术无法完成的多种DNA操作得以实现。

随着后基因组时代的到来,RedΠET重组的发展和应用将会显著推动基因组功能的研究进展。

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在对BACs或PACs修饰的基础上,运用RedΠET重组还可以进行基因敲除动物上游靶分子的快速构建。

基本实施方案有两种,其一是首先应用RedΠET重组从目标BAC或PAC上亚克隆目的基因序列（含左右长短臂至打靶质粒载体中,然后再应用RedΠET重组将带有原核与真核双启动子的pGKneo定点插入并删除目的基因序列;另外一种实施方式是,首先对目标BAC或PAC进行修饰,即将带有原核与真核双启动子的pGKneo定点插入并删除目的基因序列,然后再通过RedΠET重组进行亚克隆。

两种方案都是仅需两次简单的RedΠET重组即能完成基因敲除靶分子的构建。

同理,对于条件性敲除DNA靶分子的构建则需再多进行一步RedΠ

ET重组和Cre重组过程。

与传统PCR扩增和酶切连接法相

89（18:

8794-8797

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