凋亡的基本信息.docx

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凋亡的基本信息

一、细胞凋亡概述

*细胞凋亡（apoptosis）:

乃一种由基因控制的细胞自主性死亡方式。

*ced1-9（主要为3、4、9）调控凋亡

美丽线虫ced3基因

1090————————→959个细胞

（一）细胞凋亡的形态学特点

（二）细胞凋亡的生化改变

1．胞内Ca2+浓度增高

*胞内Ca2+浓度增高可能是凋亡的启动因素之一。

2．内源性核酸内切酶激活

Ca2+/Mg2+依赖性内源性核酸内切酶激活

→DNA核小体连接处被水解

→形成180～200bp（X）片段

3．生物大分子的合成

*凋亡的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质合成。

4．线粒体结构破坏与功能障碍

（三）细胞凋亡的诱导剂和抑制剂

（四）细胞凋亡常用检测方法

1．形态学方法

*仅定性、定位；组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下,难以判断结果。

2．电泳法

*凋亡细胞基因组DNA电泳可见“梯状”（ladder）条带；

*定性及定量；无法显示组织细胞形态结构,不能反映凋亡细胞与周围组织关系。

3．免疫学方法

*裂解的DNA片段含组蛋白，可用抗组蛋白抗体及抗DNA抗体与之反应。

*该法可定性、定量，但不能定位。

4．流式细胞术

*可对典型的凋亡进行定性和定量，可间接判断凋亡细胞所处的周期时相；

*不典型凋亡或当混有大量坏死细胞时可影响结果。

5．末端转移标记技术

*DNA被切割后的片段均含有3-OH末端

→加入标记的核苷酸

*特异性强，可进行定位及定量；耗费大，混有较多坏死细胞时可影响结果。

二、细胞凋亡的分子机制

（一）死亡受体途径及其信号传递

1．死亡受体（deathreceptor,DR）

*与相应配体结合后可诱导细胞凋亡的一类跨膜受体。

（1）成员

1）FasL/Fas（CD95/APO-1）

2）TNF-α/TNFRI

3）TRAIL（TNF-relatedapoptosisinducingligand）（Apo-2L）/R4,R5（DDcontainreceptor）

4）APO-3L（TWEAK）/DR3（APO-3）

（2）共同的结构特点

1）均属TNFR家族成员；

2）胞外区N端含2-4个富含半胱氨酸的结构域（cysteinerichdomain,CRD）；

3）胞内区含1个由60-80个aa组成的死亡结构域（deathdomain,DD）,其可与胞浆死亡结构域蛋白（DDprotein，DDP）中的DD同源结合，启动并传递凋亡信号。

*DDP：

分子中含DD的凋亡信号蛋白。

包括TRADD、FADD、RIP、CRADD、MADD等。

2．Cas蛋白酶级联反应

（1）天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶

（cysteinproteasewithasparticacidspecificity,Caspase）：

指半胱氨酸在酶的活性中心、而其底物分解作用位点都在天冬氨酸羧基端肽键、与ced-3同源的一类蛋白酶。

1）家族成员分类

*ICE亚类（1、4、5、13、14），参与促炎因子成熟等，在凋亡中起次要作用;

*凋亡启动亚类（2、8、9、10）：

参与启动凋亡效应Cas，以Cas8为代表。

*凋亡效应亚类（3、6、7）：

可剪切细胞结构蛋白，介导凋亡。

Cas-3与ced-3具有最大同源性；在体内分布最广、活性最强；可被Fas/FasL途径、颗粒酶或凋亡启动Cas亚类激活；活化的Cas3也可活化其他亚类Cas成员。

2）作用特点

*不同Cas合成、活化具有组织特异性；

*不同Cas具有特异性底物；

*不同Cas参与级联反应的不同环节；

*不同Cas在特定亚细胞区行使功能；

（2）Cas级联反应（DR-转接蛋白途径）

[DRL-DR-转接蛋白（adaptor）-Cas]

DRL+DR→DR的DD聚集

→FADD（FasassociatedproteinwithDD）募集

→通过FADDN端的DED（deatheffectdomain）与pro-Cas-8的N端结合

→pro-Cas-8自身水解

→Cas-8

→依此水解其他pro-Cas

→Cas-3活化→细胞凋亡

（3）Cas活化的终末效应→细胞凋亡

1）降解细胞骨架（膜、核蛋白）；

2）剪切凋亡抑制因子（bcl-2等）；

3）剪切RNA和DNA功能相关蛋白；

4）降解细胞基因组DNA

3．不同死亡受体的信号转导途径

（1）Fas/FasL

1）Fas（Apo-1或CD95）

*胞浆区含有deathdomain；

*表达于多种细胞（尤其活化T）表面；

*FasL/抗Fas抗体与Fas结合后，可诱导Fas+细胞凋亡。

2）FasL

*主要表达于激活的T细胞表面。

3）可溶性Fas和sFasL

*sFas可同膜型Fas竞争与FasL结合，调节Fas功能。

*sFasL可以自分泌或旁分泌形式作用于自身或旁邻活化Fas+细胞，介导凋亡。

4）胞内信号传导

FasL与靶细胞表面Fas结合

→Fas三聚体化（及DD多聚化）

→FADD氨基端DD与Fas的DD结合

FADD羧基端DED与Cas8的DED结合

→形成deathinducingsignalcomplex

（DISC，Fas/FADD/pro-Caspase-8或10）

→激活下游的pro-Caspase

→细胞凋亡

（2）TNFL/TNF

TNF与TNFR1结合

→TRADD（TNFR1associatedDDprotein）聚集

→TRADD与FADD结合

→启动胞内信号传递

（3）TRAIL/DR4（APO-2）

1）TRAIL与DR4结合→DR4三聚化

→FADD途径→细胞凋亡

2）TRAIL与TRID（decoyR,DcR1）结合

（TRAILreceptorwithoutanintercellulardomain）

→无信号传递→不发生凋亡

3）正常细胞表达TRID

→免遭TRAIL致凋亡效应

（二）线粒体途径

1．γ射线或神经酰胺等

→破坏线粒体内电子传递和能量代谢

→细胞凋亡

2．释放Cas活化因子

1）UX、Bax表达↑→细胞色素C释放

*cytochromeC与凋亡促进因子结合

（ApoptoticProteaseActivatingFactor-1）

→Apaf-1分子构象改变

→结合pro-Cas-9

→Cas-9活化

→水解pro-Cas-3

→Cas-3活化→细胞凋亡

*→呼吸链中断、ATP↓、氧自由基↑

→细胞凋亡

2）释放DPF（deathpromotingfactor）

→激活pro-Cas-9

→激活Cas-3

*直接释放pro-Cas-3

→参与细胞凋亡信号传导

3）释放氧自由基

*呼吸链将电子向分子氧传递

→产生氧自由基

→细胞不可逆损伤→凋亡

3．线粒体膜渗透性改变

→线粒体内高渗状态

→细胞骨架蛋白受压→凋亡

三、细胞凋亡的胞内调控机制

（一）bcl-2家族

*抑制凋亡的bcl-2家族成员

Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bfl-1、Brag-1、Mcl-1、A1

*促凋亡的bcl-2家族成员

Bax、Bak、Bok、BCL-XS、Bad、Bid、Bik、Blk、Hrk

*均含至少一种共有结构域（BH1、BH2）

（Bcl-2homolougsdomain）

促凋亡的Bcl-2成员均含BH1-BH3。

1．Bcl-2（B-celllymphoma-2）

*表达：

线粒体膜

*作用机制

1）促进线粒体释放deathpromoyingfactor,DPF

（cytochromeC、apoptosis-inducedfactor、pro-Cas）

→抗凋亡

2）拮抗Bax

→维持线粒体结构完整性

3）抑制线粒体释放细胞色素C

2．Bax（bcl-2associatedXprotein）

*Bax超表达

→在线粒体膜形成多聚体

→影响线粒体完整性

*Bax形成同源二聚体

→抑制Bcl-2→诱导凋亡

*Bax与Bcl-2形成异源二聚体

→促进细胞生长

*胞内Bax与Bcl-2蛋白比例

→调控凋亡的发生。

3．bcl-x

*长寿细胞中的bcl-xL（协同bcl-2）;

*短寿细胞中的bcl-xS（抑制bcl-2）。

（二）其他参与调控凋亡的基因

1．野生型P53

→cdk-interactingprotein表达↑

→CDK2活性↓

→抑制细胞进入DNA合成期

→DNA受损的细胞停滞于G1期

↓↓

细胞启动细胞修复无效

自身修复机制↓p53

介导细胞发生凋亡

2．ICE基因（Caspase-1）

*使无活性前体IL-1转为活性IL-1

*ICE（ced-3类似物）过度表达

→激活PKCδ

→蛋白裂解、DNA断裂

→细胞凋亡

3．c-myc

c-myc表达

→细胞进入细胞周期

→存在其他GF→细胞存活、增殖

无其他GF→细胞凋亡

四、细胞凋亡与免疫

（一）细胞凋亡与T细胞

1．T细胞在胸腺的分化发育

（1）阳性选择

胸腺皮质CD4+CD8+T细胞

与间质细胞MHCI、II非多态区接触

↓↓

结合不能结合

↓↓

分化为单阳性细胞凋亡

（2）阴性选择

自身反应性胸腺细胞SP

→与DC表面自身肽-MHC高亲和力结合

→触发TCR信号传递→细胞凋亡

（3）机制

*Fas稳定表达于DP/DN表面

→参与这些细胞的清除

*皮质细胞明显缺乏bcl-2；

bcl-2→促进胸腺细胞分化为成熟型

*胸腺微环境CK与其他信号分子

→共同调控胸腺细胞的凋亡过程

*依据胸腺细胞成熟状态、其他信号的存在→激素促进或抑制胸腺细胞凋亡

2．成熟T细胞增殖和死亡

（1）成熟T细胞增殖

*IL-2、-4、-7等

→抑制T细胞凋亡；促进增殖

（2）激活T细胞的死亡

1）活化T细胞表面高表达Fas/FasL

→AICD→外周成熟T细胞凋亡

→限制T细胞克隆过度扩增

2）机制

*T细胞膜内陷或折叠

→膜表面FasL与自身T细胞Fas结合

*FasL+T细胞与邻近Fas+T细胞作用；

*T细胞分泌sFas

→作用于远处Fas+T细胞

（二）细胞凋亡与B细胞

1．凋亡与骨髓中B细胞发育

*B细胞发育中膜Ig表达障碍

→B细胞凋亡

*pre-B和未成熟B细胞低表达bcl-2

→对糖皮质激素诱导的凋亡敏感

*自身抗原与SmIgM+不成熟B细胞结合

→BCR交联→凋亡

→自身反应性B细胞克隆被消除

2．凋亡与成熟B细胞

*生发中心BCR与抗原高亲和力结合

→B细胞存活，反之凋亡

*B细胞表面CD40交联

→有效防止B细胞凋亡

→分化为浆细胞或记忆细胞

*自身反应B细胞CD40L信号↓

→接受自身抗原刺激后发生凋亡

（三）细胞凋亡与淋巴细胞的胞毒作用

1．效应细胞与靶细胞结合

→Ca2+内流

→胞内电子致密颗粒极化

→颗粒外吐

→释放“颗粒酶”（Gzm）

（穿孔素形成跨膜管状结构）

→GzmB进入靶细胞

→直接激活Caspase

→靶细胞凋亡

2．激活的T细胞表面高表达FasL

→参与CTL胞毒作用

五、细胞凋亡与疾病

（一）凋亡与疾病的发生

1．细胞凋亡与自身免疫病

（1）机制

1）自身反应性免疫细胞凋亡受阻

*MRL/Lpr鼠Fas*C3H/gld鼠FasL

基因插入突变基因点突变

↓↓

Fas蛋白低表达FasL分子结构异常

↓↓

自身反应性T细胞逃避阴性选择

2）凋亡促使产生致病性自身抗原

（具潜在免疫原性的细胞组分聚集）

→异常自身免疫应答

3）微环境异常→Th1/Th2凋亡失衡

→Th1/Th2细胞偏移→AID

4）自身Ab→进入体细胞结合相应靶Ag

→干扰细胞正常功能→体细胞凋亡

5）基因缺陷或环境因子→DNA甲基化↓

*阻止细胞对致凋亡信号的反应性

→自身反应性T/B细胞产生和寿命↑

*含低甲基化DNA的核小体释放

→刺激自身反应性B细胞产生自身Ab

6）器官特异性AID靶细胞高表达Fas

*致病因子

→局部（β细胞、甲状腺上皮细胞）炎症

→高表达Fas

→CTL通过Fas/FasL杀伤之

（2）举例

A．类风湿关节炎

1）病理改变

病变关节滑膜细胞凋亡障碍

→细胞增生

2）机制

*关节液中IL-1和TGF-β1↑

→滑膜细胞Fas表达↓

*关节液中sFas表达↑

抑制Fas/FasL途径

*滑膜细胞Bcl-2、Bcl-XL表达↑

→细胞凋亡域值↑

*关节滑液中单个核细胞FasL↓

*关节滑液T细胞对凋亡产生抗性

（TCR的CDR3缺乏数个保守的aa序列）

3）诱导凋亡治疗AR

*FasL的重组载体转染关节组织；

*应用抗Fas抗体促使Fas交联。

B．SLE

1）Fas系统功能紊乱

*T/B细胞Fas表达↓；

*T/B细胞Fas的DD突变；

*sFas分泌↑；

*FasL分子结构异常；

2）T/B细胞DNA甲基化↓

→凋亡受阻

低甲基化DNA诱生自身抗体

3）组织细胞凋亡释放大量核小体

→诱导抗核抗体产生

2．细胞凋亡与病毒感染

（1）细胞凋亡与宿主抗病毒免疫机制

*抗病毒应答→病毒感染细胞凋亡

→清除入侵的病毒

*病毒感染

→激活免疫细胞→产生TNF、p53蛋白→病毒感染细胞凋亡

*病毒感染

→宿主细胞信号传递系统紊乱

→感染细胞凋亡

*CTL识别病毒感染细胞

→介导靶细胞凋亡导。

（2）举例

1）细胞凋亡与AIDS

*HIVgp120与靶细胞CD4分子结合

→激活钙通道

→胞内Ca2+浓度增高

*gp160

→靶细胞表面CD4分子交联

→HIV感染的T细胞Fas表达增加

*AIDS患者体内II型CK升高

→提高Th1对凋亡敏感性

*HIV感染

→CD8+T细胞慢性激活→发生凋亡

2）细胞凋亡与病毒性肝炎

*HCV感染肝细胞病毒刺激CTL

↓↓

高表达Fas高表达FasL

↓↓

CTL导致大量肝细胞凋亡

→暴发性肝功能衰竭

*HBV、HCV感染

→刺激免疫细胞产生TNF-α↑

→肝细胞凋亡或坏死

3．细胞凋亡与肿瘤的发生

*bcl-2过度表达

→细胞生理性死亡减少→肿瘤发生

*恶性实体瘤细胞Fas表达明显↓

FasL表达明显↑

*造血系统肿瘤中可溶性Fas水平增高

→与膜表面Fas竞争性结合FasL

*Rb和p53基因功能缺陷

→细胞周期和凋亡失调

→细胞无限制生长和恶变

Rb功能正常Rb功能缺陷

↓↓

p53不必显示其功能p53被激活

→诱发凋亡

→防止细胞恶变

*经典多药耐药基因（MDR）表达

→药物代谢加快、靶细胞改变

→瘤细胞DNA受损得以修复→抗药

*凋亡相关基因突变

→加速肿瘤进展、降低抗瘤疗效

4．凋亡与移植

（1）免疫赦免区组织高表达FasL;

（2）Fas/FasL途径参与移植排斥；

（二）凋亡与疾病的治疗

1．调节Cas活性

*转染活化Cas基因→治疗AML等肿瘤

*选择性Cas（尤其Cas3）抑制剂

→神经退行性变

2．细胞因子调控凋亡

（1）调控PMN凋亡

→控制炎症损或炎症消长

*TNF-α→促进PMN凋亡

*GM-CSF、IL-2、IL-6、IFN-γ

→抑制PMN凋亡

（2）调控Th细胞偏移

*IL-12、IL-2→防止Th1细胞凋亡

→治疗AISD、肿瘤

（3）细胞因子拮抗

*拮抗IL-4等→肺部Eos凋亡

→防治支气管哮喘

3．转染TRAIL用于肿瘤治疗

*TRAIL途径选择性诱导肿瘤细胞凋亡

（肿瘤细胞表达DR4/5，不表达TRID）

*正常细胞表达TRID

→对TRAIL不敏感

4．自杀基因治疗中的旁观者效应

*转染自杀基因（suicidegene）

→转染细胞死亡

→旁邻未转染细胞被杀伤

*机制

旁邻细胞摄取凋亡小体；

肿瘤细胞凋亡→局部抗瘤免疫效应↑

5．调控凋亡相关基因表达

（1）调控Fas/FasL表达

*Cys、FK506→FasL转录↓

→移植物细胞凋亡↓

*sFas、抗Fas抗体、反义核酸

*转染Fas基因

（2）转染bcl-2、P53→抗瘤

6．诱导分化剂（维A酸、As2O3）

→诱导凋亡或部分分化后凋亡

→治疗肿瘤（白血病等）

7．激素撤退→性激素敏感肿瘤凋亡

*切除睾丸/给予雌激素→前列腺癌

*切除卵巢/拮抗雌激素→乳腺癌

8．Wee转基因疗法

（1）Wee的生物学作用

*参与调控细胞周期

→使细胞停留于G2期

→有利于DNA受损细胞的修复

*参与颗粒酶所致受损DNA的修复过程

→阻断致凋亡因子导致的靶细胞凋亡

（2）Wee转基因疗法应用实例

*转染胰岛β细胞

→修复颗粒酶所致DNA损伤

→阻断CTL所致胰岛β细胞凋亡

→防治Ⅰ型糖尿病

（及其他CTL所致器官特异性AID）

9．化疗、放疗诱导肿瘤细胞凋亡