凋亡的基本信息.docx

1、凋亡的基本信息一、细胞凋亡概述* 细胞凋亡(apoptosis):乃一种由基因控制的细胞自主性死亡方式。* ced1-9（主要为3、4、9）调控凋亡美丽线虫ced3基因1090959个细胞(一)细胞凋亡的形态学特点(二)细胞凋亡的生化改变1胞内Ca2+浓度增高* 胞内Ca2+浓度增高可能是凋亡的启动因素之一。 2内源性核酸内切酶激活Ca2+/Mg2+依赖性内源性核酸内切酶激活DNA核小体连接处被水解形成180200bp（X）片段 3生物大分子的合成* 凋亡的发生一般依赖于新的RNA和蛋白质合成。4线粒体结构破坏与功能障碍(三)细胞凋亡的诱导剂和抑制剂(四)细胞凋亡常用检测方法1形态学方法* 仅

2、定性、定位；组织成分及细胞死亡类型复杂的情况下,难以判断结果。2电泳法* 凋亡细胞基因组DNA电泳可见“梯状”(ladder)条带；* 定性及定量；无法显示组织细胞形态结构,不能反映凋亡细胞与周围组织关系。3免疫学方法* 裂解的DNA片段含组蛋白，可用抗组蛋白抗体及抗DNA抗体与之反应。* 该法可定性、定量，但不能定位。4流式细胞术* 可对典型的凋亡进行定性和定量，可间接判断凋亡细胞所处的周期时相；* 不典型凋亡或当混有大量坏死细胞时可影响结果。5末端转移标记技术* DNA被切割后的片段均含有3-OH末端加入标记的核苷酸* 特异性强，可进行定位及定量；耗费大，混有较多坏死细胞时可影响结果。 二

3、、细胞凋亡的分子机制（一）死亡受体途径及其信号传递1死亡受体(death receptor,DR)* 与相应配体结合后可诱导细胞凋亡的一类跨膜受体。（1）成员1）FasL/Fas（CD95/APO-1）2）TNF-/TNFRI3）TRAIL（TNF-related apoptosis inducing ligand）（Apo-2L）/ R4,R5（DD contain receptor）4）APO-3L（TWEAK）/DR3（APO-3） （2）共同的结构特点1）均属TNFR家族成员；2）胞外区N端含2-4个富含半胱氨酸的结构域（cysteine rich domain,CRD）；3）胞内区含

4、1个由60-80个aa组成的死亡结构域（death domain,DD）,其可与胞浆死亡结构域蛋白（DD protein，DDP）中的DD同源结合，启动并传递凋亡信号。* DDP：分子中含DD的凋亡信号蛋白。包括TRADD、FADD、RIP、CRADD、MADD等。 2Cas蛋白酶级联反应（1）天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶 （cystein protease with aspartic acid specificity,Caspase）：指半胱氨酸在酶的活性中心、而其底物分解作用位点都在天冬氨酸羧基端肽键、与ced-3同源的一类蛋白酶。1）家族成员分类* ICE亚类（1、4、5、13、14），

5、参与促炎因子成熟等，在凋亡中起次要作用;* 凋亡启动亚类（2、8、9、10）：参与启动凋亡效应Cas，以Cas8为代表。* 凋亡效应亚类（3、6、7）：可剪切细胞结构蛋白，介导凋亡。Cas-3与ced-3具有最大同源性；在体内分布最广、活性最强；可被Fas/FasL途径、颗粒酶或凋亡启动Cas亚类激活；活化的Cas3也可活化其他亚类Cas成员。 2）作用特点* 不同Cas合成、活化具有组织特异性；* 不同Cas具有特异性底物；* 不同Cas参与级联反应的不同环节；* 不同Cas在特定亚细胞区行使功能； （2）Cas级联反应（DR-转接蛋白途径）DRL-DR-转接蛋白（adaptor）-CasD

6、RL+DRDR的DD聚集FADD（Fas associated protein with DD）募集 通过FADD N端的DED（death effect domain）与pro-Cas-8的N端结合pro-Cas-8自身水解Cas-8依此水解其他pro-CasCas-3活化细胞凋亡 (3)Cas活化的终末效应细胞凋亡1）降解细胞骨架（膜、核蛋白）；2）剪切凋亡抑制因子（bcl-2等）；3）剪切RNA和DNA功能相关蛋白；4）降解细胞基因组DNA 3不同死亡受体的信号转导途径（1）Fas/FasL1）Fas（Apo-1或CD95）* 胞浆区含有death domain；* 表达于多种细胞(尤其

7、活化T)表面；* FasL/抗Fas抗体与Fas结合后，可诱导Fas+细胞凋亡。2）FasL* 主要表达于激活的T细胞表面。3）可溶性Fas和sFasL* sFas可同膜型Fas竞争与FasL结合，调节Fas功能。* sFasL可以自分泌或旁分泌形式作用于自身或旁邻活化Fas+细胞，介导凋亡。4）胞内信号传导FasL与靶细胞表面Fas结合Fas三聚体化（及DD多聚化）FADD氨基端DD与Fas的DD结合FADD羧基端DED与Cas8的DED结合形成death inducing signal complex（DISC，Fas/FADD/ pro-Caspase-8或10)激活下游的pro-Cas

8、pase细胞凋亡 （2）TNFL/TNFTNF与TNFR1结合TRADD（TNFR1 associated DD protein ）聚集TRADD与FADD结合启动胞内信号传递 （3）TRAIL/DR4（APO-2）1）TRAIL与DR4结合DR4三聚化FADD途径细胞凋亡2）TRAIL与TRID（decoy R,DcR1）结合（TRAIL receptor without an intercellular domain）无信号传递不发生凋亡3）正常细胞表达TRID免遭TRAIL致凋亡效应 （二）线粒体途径1射线或神经酰胺等破坏线粒体内电子传递和能量代谢细胞凋亡2释放Cas活化因子1）UX、B

9、ax表达细胞色素C释放* cytochrome C与凋亡促进因子结合（Apoptotic Protease Activating Factor-1）Apaf-1分子构象改变结合pro-Cas-9Cas-9活化水解pro-Cas-3Cas-3活化细胞凋亡* 呼吸链中断、ATP、氧自由基细胞凋亡2）释放DPF（death promoting factor）激活pro-Cas-9激活Cas-3* 直接释放pro-Cas-3参与细胞凋亡信号传导3）释放氧自由基* 呼吸链将电子向分子氧传递产生氧自由基细胞不可逆损伤凋亡 3线粒体膜渗透性改变线粒体内高渗状态细胞骨架蛋白受压凋亡 三、细胞凋亡的胞内调控机制

10、（一）bcl-2家族* 抑制凋亡的bcl-2家族成员Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、Bfl-1、Brag-1、Mcl-1、A1* 促凋亡的bcl-2家族成员Bax、Bak、Bok、BCL-XS、Bad、Bid、Bik、Blk、Hrk* 均含至少一种共有结构域（BH1、BH2）（Bcl-2 homolougs domain）促凋亡的Bcl-2成员均含BH1-BH3。1Bcl-2（B-cell lymphoma-2）* 表达：线粒体膜* 作用机制1）促进线粒体释放death promoying factor,DPF(cytochrome C、apoptosis-induced factor、

11、pro-Cas)抗凋亡2）拮抗Bax维持线粒体结构完整性3）抑制线粒体释放细胞色素C 2Bax(bcl-2 associated X protein）* Bax超表达在线粒体膜形成多聚体影响线粒体完整性* Bax形成同源二聚体抑制Bcl-2诱导凋亡* Bax与Bcl-2形成异源二聚体促进细胞生长* 胞内Bax与Bcl-2蛋白比例调控凋亡的发生。 3bcl-x* 长寿细胞中的bcl-xL（协同bcl-2）;* 短寿细胞中的bcl-xS（抑制bcl-2）。（二）其他参与调控凋亡的基因1野生型P53cdk-interacting protein表达CDK2活性抑制细胞进入DNA合成期DNA受损的细胞

12、停滞于G1期 细胞启动 细胞修复无效自身修复机制 p53介导细胞发生凋亡 2ICE基因（Caspase-1）* 使无活性前体IL-1转为活性IL-1* ICE（ced-3类似物）过度表达激活PKC蛋白裂解、DNA断裂细胞凋亡3c-mycc-myc表达细胞进入细胞周期存在其他GF细胞存活、增殖无其他GF细胞凋亡 四、细胞凋亡与免疫(一)细胞凋亡与T细胞1T细胞在胸腺的分化发育（1）阳性选择胸腺皮质CD4+CD8+T细胞与间质细胞MHCI、II非多态区接触 结合 不能结合 分化为单阳性细胞 凋亡（2）阴性选择自身反应性胸腺细胞SP与DC表面自身肽-MHC高亲和力结合触发TCR信号传递细胞凋亡（3）

13、机制* Fas稳定表达于DP/DN表面参与这些细胞的清除* 皮质细胞明显缺乏bcl-2；bcl-2促进胸腺细胞分化为成熟型* 胸腺微环境CK与其他信号分子共同调控胸腺细胞的凋亡过程* 依据胸腺细胞成熟状态、其他信号的存在激素促进或抑制胸腺细胞凋亡2成熟T细胞增殖和死亡（1）成熟T细胞增殖* IL-2、-4、-7等抑制T细胞凋亡；促进增殖（2）激活T细胞的死亡1）活化T细胞表面高表达Fas/FasLAICD外周成熟T细胞凋亡限制T细胞克隆过度扩增2）机制* T细胞膜内陷或折叠膜表面FasL与自身T细胞Fas结合* FasL+T细胞与邻近Fas+T细胞作用；* T细胞分泌sFas作用于远处Fas+

14、T细胞 (二)细胞凋亡与B细胞1凋亡与骨髓中B细胞发育* B细胞发育中膜Ig表达障碍B细胞凋亡* pre-B和未成熟B细胞低表达bcl-2对糖皮质激素诱导的凋亡敏感* 自身抗原与SmIgM+不成熟B细胞结合BCR交联凋亡自身反应性B细胞克隆被消除2凋亡与成熟B细胞* 生发中心BCR与抗原高亲和力结合B细胞存活，反之凋亡* B细胞表面CD40交联有效防止B细胞凋亡 分化为浆细胞或记忆细胞* 自身反应B细胞CD40L信号接受自身抗原刺激后发生凋亡 （三）细胞凋亡与淋巴细胞的胞毒作用1效应细胞与靶细胞结合Ca2+内流胞内电子致密颗粒极化颗粒外吐释放“颗粒酶”(Gzm)（穿孔素形成跨膜管状结构）Gzm

15、B进入靶细胞直接激活Caspase靶细胞凋亡2激活的T细胞表面高表达FasL参与CTL胞毒作用 五、细胞凋亡与疾病(一)凋亡与疾病的发生1细胞凋亡与自身免疫病（1）机制1）自身反应性免疫细胞凋亡受阻* MRL/Lpr鼠Fas * C3H/gld鼠FasL基因插入突变 基因点突变 Fas蛋白低表达 FasL分子结构异常 自身反应性T细胞逃避阴性选择2）凋亡促使产生致病性自身抗原（具潜在免疫原性的细胞组分聚集）异常自身免疫应答3）微环境异常Th1/Th2凋亡失衡Th1/Th2细胞偏移AID4）自身Ab进入体细胞结合相应靶Ag干扰细胞正常功能体细胞凋亡5）基因缺陷或环境因子DNA甲基化* 阻止细胞对

16、致凋亡信号的反应性自身反应性T/B细胞产生和寿命* 含低甲基化DNA的核小体释放刺激自身反应性B细胞产生自身Ab6)器官特异性AID靶细胞高表达Fas* 致病因子局部（细胞、甲状腺上皮细胞）炎症高表达FasCTL通过Fas/FasL杀伤之 （2）举例A类风湿关节炎1）病理改变病变关节滑膜细胞凋亡障碍细胞增生2）机制* 关节液中IL-1和TGF-1滑膜细胞Fas表达* 关节液中sFas表达抑制Fas/FasL途径* 滑膜细胞Bcl-2、Bcl-XL表达细胞凋亡域值* 关节滑液中单个核细胞FasL* 关节滑液T细胞对凋亡产生抗性（TCR的CDR3缺乏数个保守的aa序列）3）诱导凋亡治疗AR* Fa

17、sL的重组载体转染关节组织；* 应用抗Fas抗体促使Fas交联。BSLE1）Fas系统功能紊乱* T/B细胞Fas表达；* T/B细胞Fas的DD突变；* sFas分泌；* FasL分子结构异常；2）T/B细胞DNA甲基化凋亡受阻低甲基化DNA诱生自身抗体3）组织细胞凋亡释放大量核小体诱导抗核抗体产生 2细胞凋亡与病毒感染（1）细胞凋亡与宿主抗病毒免疫机制* 抗病毒应答病毒感染细胞凋亡清除入侵的病毒* 病毒感染激活免疫细胞产生TNF、p53蛋白病毒感染细胞凋亡* 病毒感染宿主细胞信号传递系统紊乱感染细胞凋亡* CTL识别病毒感染细胞介导靶细胞凋亡导。（2）举例1）细胞凋亡与AIDS* HIV

18、gp120与靶细胞CD4分子结合激活钙通道 胞内Ca2+浓度增高* gp160靶细胞表面CD4分子交联HIV感染的T细胞Fas表达增加* AIDS患者体内II型CK升高提高Th1对凋亡敏感性* HIV感染CD8+T细胞慢性激活发生凋亡 2）细胞凋亡与病毒性肝炎* HCV感染肝细胞 病毒刺激CTL 高表达Fas 高表达FasL CTL导致大量肝细胞凋亡暴发性肝功能衰竭* HBV、HCV感染刺激免疫细胞产生TNF-肝细胞凋亡或坏死3细胞凋亡与肿瘤的发生* bcl-2过度表达细胞生理性死亡减少肿瘤发生* 恶性实体瘤细胞Fas表达明显FasL表达明显* 造血系统肿瘤中可溶性Fas水平增高与膜表面Fas

19、竞争性结合FasL* Rb和p53基因功能缺陷细胞周期和凋亡失调细胞无限制生长和恶变Rb功能正常 Rb功能缺陷 p53不必显示其功能 p53被激活诱发凋亡防止细胞恶变* 经典多药耐药基因（MDR）表达药物代谢加快、靶细胞改变瘤细胞DNA受损得以修复抗药* 凋亡相关基因突变加速肿瘤进展、降低抗瘤疗效4凋亡与移植（1）免疫赦免区组织高表达FasL;（2）Fas/FasL途径参与移植排斥；（二）凋亡与疾病的治疗1调节Cas活性* 转染活化Cas基因治疗AML等肿瘤* 选择性Cas（尤其Cas3）抑制剂神经退行性变2细胞因子调控凋亡（1）调控PMN凋亡控制炎症损或炎症消长* TNF-促进PMN凋亡*

20、GM-CSF、IL-2、IL-6、IFN-抑制PMN凋亡（2）调控Th细胞偏移* IL-12、IL-2防止Th1细胞凋亡治疗AISD、肿瘤（3）细胞因子拮抗* 拮抗IL-4等肺部Eos凋亡防治支气管哮喘3转染TRAIL用于肿瘤治疗* TRAIL途径选择性诱导肿瘤细胞凋亡（肿瘤细胞表达DR4/5，不表达TRID）* 正常细胞表达TRID对TRAIL不敏感4自杀基因治疗中的旁观者效应* 转染自杀基因（suicide gene）转染细胞死亡旁邻未转染细胞被杀伤 * 机制旁邻细胞摄取凋亡小体；肿瘤细胞凋亡局部抗瘤免疫效应 5调控凋亡相关基因表达（1）调控Fas/FasL表达* Cys、FK506Fas

21、L转录移植物细胞凋亡* sFas、抗Fas抗体、反义核酸* 转染Fas基因（2）转染bcl-2、P53抗瘤 6诱导分化剂（维A酸、As2O3）诱导凋亡或部分分化后凋亡治疗肿瘤（白血病等） 7激素撤退性激素敏感肿瘤凋亡* 切除睾丸/给予雌激素前列腺癌* 切除卵巢/拮抗雌激素乳腺癌 8Wee转基因疗法（1）Wee的生物学作用* 参与调控细胞周期使细胞停留于G2期有利于DNA受损细胞的修复* 参与颗粒酶所致受损DNA的修复过程阻断致凋亡因子导致的靶细胞凋亡（2）Wee转基因疗法应用实例* 转染胰岛细胞修复颗粒酶所致DNA损伤阻断CTL所致胰岛细胞凋亡防治型糖尿病（及其他CTL所致器官特异性AID） 9化疗、放疗诱导肿瘤细胞凋亡