固定化载体对苹果酒发酵的影响.docx

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固定化载体对苹果酒发酵的影响

固定化载体对苹果酒发酵的影响

05级生物科学：

赵颖指导老师：

谢天柱

摘要：

针对海藻酸钠载体强度低、易分离的缺点。

采用不同固定化载体壳聚糖、卡拉胶、壳聚糖与卡拉胶的混合物对苹果酒发酵的载体进行了改进。

发酵过程中,使用天然抗氧化剂茶多酚,观察对苹果酒发酵的影响。

结果表明,壳聚糖与卡拉胶的混合体作为固定化载体,在苹果酒发酵中具有良好效果。

试验明确了酿制苹果酒使用的最佳固定化载体材料及其组合。

关键词：

壳聚糖卡拉胶发酵苹果酒固定化酵母

TheInfluenceofTheFossilizationCarriertoTheAppleWine

Author:

ZhaoYingInstructor:

XieTianzhu

（TianshuiNnormalUuniversitySchoolofLifescienceandChemistryGansuTianshui741001）

Abstract:

Theintensityofsodiumalginatebeadsislowandalsoitiseasytoseparate,soweadditalothercarrierstoimprovethestrengthofit.Weadoptethreedifferentfossilizations:

chitosan,carrageenanandthemixtureinthefermentativeprocessofapplewine.Wealsousenaturalantioxidantteapolyphenolandobservetheinfluenceoftheapplewine.Theresultshowedthatthegoodeffectionofthemixtureisbetterthanotherstoapplewine.Theexperimenthasbeenclearedthebestimmobilizedcarriertofermentingapplewine.

Keywords:

ChitosanCarrageenanFermentationApplewineStationaryyeast

我国是世界上盛产苹果的国家之一，苹果含有多种营养成分，经榨汁、发酵制成的苹果酒更多地保留了苹果原有的糖类、氨基酸、矿物质、维生素，较以粮食为主要原料的蒸馏酒具有更高的营养价值和更好的保健效果。

常饮用苹果酒，不仅能增进食欲、帮助消化、补充营养，还能防止肥胖症，有利于健康[1]。

利用丰富的苹果资源来加工生产苹果酒，不仅能为企业和果农创造良好的经济效益，也促进了地方经济的发展，获得了良好的社会效益。

随着科学技术的发展，新技术将越来越多地应用于苹果酒的研发及测定。

现代苹果酒发酵工艺是将活性酵母细胞固定，连续化生产苹果酒。

固定化酵母与将酵母直接加入发酵醪的做法相比，具有酵母启动快、发酵时间缩短、发酵平稳、酵母能长期保持高活力、便于分离和回收等突出优点，使得苹果酒风味及澄清效果得到良好体现[4]。

海藻酸钠作为固定化酵母的载体之一，具有制备方法简单、条件温和、无毒、不被绝大多数微生物分解、成本低廉等优点，成为广泛使用的载体材料，但海藻酸钙凝胶在含多价阴离子的溶液以及高浓度电解质溶液中不稳定，钙离子易脱落，凝胶变软，甚至溶解，又限制了它的应用，同时也对苹果酒的理化性质产生一定的影响[5-16]，如感官、残糖、酒精度等。

因此，对固定化载体材料的改进和优化已成为关注的焦点。

本文拟通过采用不同固定化载体—壳聚糖、卡拉胶、壳聚糖与卡拉胶的混合体，用于苹果酒发酵，并对发酵后的残糖、酒精度、透光率理化指标进行测定，优化和改进苹果酒发酵的技术。

1试验材料

1.1菌种

菌种：

采用“安琪”葡萄酒用高活性干酵母，湖北安琪酵母股份有限公司生产。

1.2试剂

冰醋酸、

、无水乙醇、

、

、柠檬酸钠、偏重亚硫酸钠均为分析纯；海藻酸钠、壳聚糖（

，相对分子质量

）均为化学纯；卡拉胶（相对分子质量105～106为化学纯）、砂糖（市售商品），茶多酚（含量为50%，天水维康生物工程有限公司生产）。

1.3液体培养基

配置含糖5%的糖水（也可采用果汁），121℃下灭菌30

。

苹果汁发酵醪:

将浓缩苹果汁稀释到含糖量22

调节酸度至5.0

（以苹果酸计），121℃下灭菌30

。

浓缩苹果汁:

购自天水长城果汁饮料有限公司，含总糖70.5

、总酸25

、透光率≥96%。

1.4主要仪器

阿贝折射仪（

型）、

计（

型）、比重式酒精计、722型分光光度计（上海欣茂）、恒温培养箱（

型）、全自动灭菌锅、电子分析天平（

）、10

注射器、双蒸水发生器、托盘天平、秒表、电热恒温水浴锅（

型），旋转蒸发仪ＲＥ５２－９９。

2实验方法

2.1酵母细胞固定化工艺流程

酵母细胞固定化工艺流程如下:

酿酒干酵母→活化→1.5%海藻酸钠→2.0%氯化钙溶液→凝胶→洗涤固化→成膜反应（0.1%壳聚糖、0.1%卡拉胶、混合）→处理载体表面→液化→双蒸水洗涤→固定化酵母（备用）。

2.2苹果酒酵母固定化载体制备

苹果酒酵母固定化载体的制备工艺包括壳聚糖纯化、卡拉胶溶液的配制[3，16]和载体制备。

2.2.1壳聚糖纯化

将1

壳聚糖溶于100

1%冰醋酸溶液中，充分溶解后滤除不溶物，加入10%

溶液调节

值至10，得到白色沉淀；将沉淀用蒸馏水洗涤数次，除去过量的

，浸没于85%乙醇和15%甲醇混合溶液中，室温下干燥得到黄色纯化壳聚糖。

2.2.2卡拉胶溶液的配制

用0.8%生理盐水配制0.1%卡拉胶溶液：

将0.1

的卡拉胶溶于100

的生理盐水中。

2.2.3载体的制备

酵母的活化—复水活化：

将42

干酵母加入800

38℃含糖5%的糖水（也可采用果汁），搅拌溶解。

15～30分钟后冷却至28～30℃即可使用。

酵母接种用量：

将活化后的酵母直接加入果汁中，接种量为原汁的0.03%～0.05%（酿造果汁在200升以下接种量为0.1%）[2]。

载体的形成：

在冷却后的酵母菌悬液中加入1.5%的海藻酸钠充分溶解混合，吸入10

注射器中，用

针头将混合液注射到水浴锅中20℃2.0%

溶液中，形成海藻酸钙微球，去掉上清液，用2.0%

溶液洗涤固化2

，再分别与壳聚糖溶液（将0.1

纯化的壳聚糖溶于100

%冰醋酸溶液中）、0.1%卡拉胶溶液、壳聚糖与卡拉胶的混合溶液充分混合进行成膜反应15

，0.15%海藻酸钠溶液处理载体表面5

，用0.055

柠檬酸钠液化（浸泡）10

，滤去处理液，双蒸水洗涤2次，加无菌水备用[1]。

2.3固定化酵母的发酵试验

将不同固定化载体固定的酵母分别置于2000mL浓度为22%、

为3.4的苹果汁发酵醪中，加入天然抗氧化剂茶多酚各处理重复2次，另加一组对照（不用包埋剂）。

20℃下进行发酵，定时记录发酵液糖度变化，待发酵完毕，过滤发酵液，回收固定化酵母，经生理盐水洗涤，用于下次发酵，仪器分析发酵液理化指标，感官品尝评价酒质和口感。

2.4　苹果酒各理化指标及测定方法

2.4.1残糖测定　采用阿贝折射仪测定。

2.4.2酒精度测定

酒精计法。

2.4.3透光率测定采用722型分光光度计测定。

2.4.4感官

葡萄酒、果酒通用分析方法。

3结果与讨论

3.1固定化酵母发酵试验

将不同固定化载体固定的酵母分别置于2000mL浓度为22%、

为3.4的苹果汁发酵醪中20℃下进行控温发酵，每天记录发酵液的糖度变化，经观察，在前20

内，固定化酵母颗粒均沉积在发酵容器底部；20

后，颗粒陆续漂浮于液面上，产生气泡。

第一天由于是酵母的繁殖期，所以发酵液表面有少量气泡产生。

在随后的6天内，表面有大量气泡产生，固定化酵母颗粒上下翻滚，发酵液糖度下降很快，酒味逐渐加重，液体由透亮变为混浊，为主发酵期。

如图1-

从第7天开始，发酵基本趋于平缓，酒味浓郁，发酵液外观平静，色泽淡黄，液体澄清，同时固定化颗粒逐渐沉积于容器底部，为发酵后期，发酵作用基本结束。

3.2不同试验处理和发酵天数对苹果酒理化指标效应的影响

3.2.1苹果酒的残糖

苹果酒不同处理残糖方差分析见表1

表1-不同试验处理和发酵天数对苹果酒残糖影响方差分析表

TestsofBetween-SubjectsEffects

DependentVariable:

残糖

变异来源

TypeIIISum

ofSquares

df

MeanSquare

F

Sig

不同试验处理（A）

发酵天数（B）

误差

总变异

11.574

5158.641

19.165

5189.379

20

10

200

230

.579

515.864

0.096

6.039

5383.538

.000

.000

由表1-结果表明在苹果酒发酵过程中，是否使用固定化载体对苹果酒残糖影响存在极显著差异，说明不同的固定化载体对苹果酒具有不同的发酵效果。

在工业生产中，我们可以选择最优的固定化载体；发酵天数之间对苹果酒残糖影响也存在极显著差异，说明在发酵过程中，每一天的残糖都在发生变化，由图-2可以看出发酵过程中残糖的变化。

发酵过程中糖度的变化曲线:

如图-2

由图2-表明：

控制发酵温度为20℃，进行恒温发酵过程中残糖的变化情况来看，用壳聚糖和卡拉胶的混合体作为固定化载体对残糖的影响较大，说明壳聚糖和卡拉胶混合可增强凝胶颗粒的韧性，减小了产物对酵母细胞的抑制作用，使发酵效果更好，醪液中残糖更低。

3.2.2苹果酒的酒精度

苹果酒不同处理酒精度方差分析见表5

表5-不对同试验处理和发酵天数苹果酒酒精度影响方差分析表

TestsofBetween-SubjectsEffects

DependentVariable:

酒精度

变异来源

TypeIIISum

ofSquares

df

MeanSquare

F

Sig

不同试验处理（A）

发酵天数（B）

误差

总变异

6.318

2179.656

19.689

2256.64

20

10

200

230

0.316

217.966

0.098

3.209

2214.056

.000

.000

由表2-结果可知，是否使用固定化载体对苹果酒酒精度的影响存在极显著差异，说明不同的固定化载体对苹果酒具有不同的发酵效果，在工业生产中，可以选择最优的固定化载体；发酵天数之间对苹果酒酒精度影响也存在极显著差异，这说明在发酵过程中，每一天生成的酒精量都在发生变化，图-3为发酵过程中酒精的变化曲线。

由图3-可以看出：

壳聚糖和卡拉胶混合体作为固定化载体，对酒精的含量有较大的影响，用卡拉胶作为固定化载体发酵的效果稍差于以壳聚糖作为固定化载体的发酵处理.

3.2.3苹果酒的透光率

苹果酒不同处理透光率方差分析见表4

表4-不同试验处理和发酵天数对苹果酒透光率影响方差分析表

TestsofBetween-SubjectsEffects

DependentVariable:

透光率

变异来源

TypeIIISum

ofSquares

df

MeanSquare

F

Sig

不同试验处理（A）

发酵天数（B）

误差

总变异

2728.257

75252.559

3530.319

81511.136

20

10

200

230

0.316

217.966

0.098

3.209

2214.056

.000

.000

由表2-结果可知，是否使用固定化载体对苹果酒透光率的影响存在极显著差异，说明不同的固定化载体对苹果酒具有不同的发酵效果。

发酵天数之间对苹果酒透光率的影响也存在极显著差异，其变化规律如图4：

前五天呈明显的下降趋势，说明随着可发酵糖的大量消耗，在由糖转化为酒精的过程中，伴随着大量的二氧化碳气体的产生，使透光率明显下降。

从第六天起至发酵基本结束的第十三天，透光率又呈明显的回升趋势，说明二氧化碳的生成量在逐渐减少，依这一变化，也可大致判断发酵的正常与否。

而我们所关注的是，当发酵结束后，透光率是否能够恢复到发酵前的状态。

本试验证实所预期的结果完全可以实现，这就为工业化生产提供了极大便利，使简化过滤成为可能。

3.3苹果酒各理化指标的多重比较

对苹果酒各理化指标在方差分析的基础上，采用

法进行多重比较，其显著性差异见下表-5。

表5不同载体和发酵天数对苹果酒各理化指标平均数差异显著性比较

（

法）

残糖

酒精度

透光率

不同载体

卡拉胶

对照

壳聚糖

混合

13.8a

13.6a

12.9b

12.6c

混合

壳聚糖

卡拉胶

对照

6.8a

6.6b

6.1c

5.9c

混合

壳聚糖

卡拉胶

对照

57.819a

50.529b

47.783c

40.291d

发酵天数

第一天

第二天

第三天

20.9a

20.1b

18.4c

第三天

第二天

第一天

3.2a

1.5b

0.4c

第三天

第一天

第二天

85.6a

85.8a

58.0b

表5-结果显示，以壳聚糖和卡拉胶的混合体为固定化载体用于酿制苹果酒在残糖、酒精度和透光率理化指标上有差异，说明壳聚糖和卡拉胶的混合体作为固定化载体对苹果酒发酵效果良好，可用于果酒酿造。

第一天与第三天的透光率没有差异，与第二天有明显差异。

3.4苹果酒感官指标测定

感官指标评定结果：

色泽:

呈金黄色或淡黄色；

澄清度:

外观澄清透明，无悬浮物，无沉淀物；

香味:

具有清晰，优雅，协调的苹果香与酒香；

滋味:

甘甜醇厚，酸甜协调，酒体丰满，余味绵长；

典型性:

具有苹果酒的典型风格。

4小结与讨论：

4.1使用不同固定化载体发酵苹果酒的试验结果表明：

以壳聚糖和卡拉胶混合体作为固定化载体比单一的固定化载体材料对苹果酒发酵有了明显的效果，糖类利用率高，酒精含量高。

具有清新，优雅，协调的苹果香与浓郁的酒香，酒体丰满，滋味醇厚，酸度适宜，谐调舒顺，口感良好。

酒体澄清透明，符合果酒标准。

4.2酵母固定化技术是20世纪70年代研究的新技术。

将固定化生长酵母细胞用于酒类发酵，与传统的发酵法相比有许多优点，在简化生产工艺和降低成本方面有巨大的潜力。

固定化酵母细胞发酵苹果酒省略了发酵后澄清过滤的步骤，可直接成为成品酒销售。

并且发酵后的酵母易于分离、酵母可以在较长的时间内保持酵母细胞的活性，洗涤后可重复使用，大大提高了酵母的利用率，降低成本，染菌机会少。

由于海藻酸钙凝胶易溶解，选用壳聚糖和卡拉胶的混合体作为载体可使固定化酵母颗粒更具有韧性，不易溶解，且发酵过程及产品质量稳定，便于实现自动化和连续化发酵苹果酒。

4.3传统苹果酒工艺是以苹果为原料，经清洗、破碎、榨汁、发酵、澄清、调配、过滤等工序制成的低度干型果酒，具有浓郁的苹果香与酒香。

但以浓缩苹果汁经发酵的苹果酒，果香不及直接以苹果为原料发酵的苹果酒，因为苹果芳香物质沸点较低，生产浓缩果汁的过程中容易挥发，由于作为了发酵原料的苹果汁香气已经不足，造成苹果酒香气亦不足。

所以，以浓缩果汁酿造苹果酒时，果香还需进一步加强。

4.4苹果酒发酵中，为了抑制空气中的氧更多地溶入果汁中，引起色泽褐变并使酒液风味劣化，失去果酒特有的果香、酒香和清新感，通常采用二氧化硫作为传统抗氧化剂，并能够抑制杂菌。

但因其是一种化学物质，不仅会影响果酒质量，还会对人体健康造成危害。

茶多酚是从茶叶碎末中提取的多酚类物质，为天然抗氧剂。

本试验中用茶多酚来代替二氧化硫作为抗氧化剂，对试验数据的分析证实茶多酚不会影响果酒品质，作为一种新型的天然抗氧化剂，有希望取代传统的二氧化硫。

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