BOP基因的克隆及鉴定.docx
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BOP基因的克隆及鉴定
BOP基因的克隆及鉴定
D
存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。
DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。
在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3´-OH末端，并以此为起始点，沿模板5´→3´方向延伸，合成一条新的DNA互补链。
PCR反应的基本成分包括：
模板DNA（待扩增DNA）、引物、4种脱氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。
类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的高温变性：
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作预备；②模板DNA与引物的低温退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的适温延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
[2]
1.3感受态细胞
感受态细胞（competentcell）：
理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。
主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。
由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。
将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。
[2]
1.4酶切鉴定
实验在重组质粒构建，重组质粒pUC18-bop采用BamHI、HandⅢ双酶切鉴定，在对双酶切产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图中可以看到所得条带都不是很清晰，有拖尾现象出现。
这可能由于未待胶完全凝固时加样了；重组质粒条带有明显拖带出现，这与质粒提取，提纯操作有关！
但可以看出其分子量同bop基因分子量（1200bp左右）一至。
酶切能进一步证实bop基因的成功克隆。
但就实验设计来看，为更清晰看到双酶切前后及PCR扩增片段与bop基因区别，笔者建议将克隆载体pUC18质粒，PCR扩增产物，酶切后的克隆载体及目的基因在一块琼脂糖凝胶上电泳。
【2】
2实验材料与仪器
2.1实验材料
2.1.1生物材料
大肠杆菌（Escherichiacoli）DH5α,克隆载体pUC18由武汉大学东湖分校生物技术实验室保存，含bop基因的pUC19质粒的大肠杆菌由武汉大学东湖分校金卫华老师提供。
2.1.2生化材料
T4DNA连接酶，BamHI及HindⅢ核酸内切酶等均购自大连Takara公司，氨苄青霉素（Amp）购自上海生工公司，Marker购自Fermentas公司，电泳用琼脂糖及细菌培养用琼脂均购自晶美公司。
DNA回收试剂盒购自MBI公司。
2.2主要实验试剂
2.2.1LB液体培养基：
精确称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCIlg放入烧杯内，加蒸馏水充分溶解后定容至100mL，121℃高压下蒸汽灭菌20min。
储存于4℃备用。
2.2.2LB固体培养基：
取配置好的未高压蒸汽灭菌的LB液体培养基50ml加入细菌培养用琼脂（Bacto－Agar）0.5g，混匀后121℃高压蒸汽灭菌20min。
储存于4℃备用。
2.2.3碱性裂解液Ⅰ：
精确称取葡萄糖0.495g，Tris碱0.0303g，二水乙二胺四乙酸二钠0.146g与小烧杯中，用蒸馏水充分溶解后定容至50ml。
2.2.4碱性裂解液Ⅱ：
精确移取0.2mol/L的NaOH20μL，1％的SDS20μL，加蒸馏水160μL混匀。
（注意:
0.2mol/L的NaOH和1％的SDS分开配,临时混合用）
2.2.5碱性裂解液Ⅲ：
精确移取5mol/L的乙酸钾30ml，冰乙酸5.8ml，加入蒸馏水并定容至50ml。
2.2.6上样缓冲液：
精确称取溴酚蓝2.5mg，加入60％甘油0.6ml，50％EDTA0.5g，摇匀后加蒸馏水至1ml。
2.2.70.1mol／LCaCl2：
精确称取1.19无水CaCl2定容至100ml，121℃，121℃高压蒸汽灭菌20分钟，4"C保存。
2.2.8灭菌蒸馏水：
蒸馏水水分装后121℃高压蒸汽灭菌后，4℃保存备用。
2.3主要实验仪器
洁净工作台（等级：
100级，上海博迅实业有限公司医疗设备）
高速离心机（D-37520，sigma）
电子天平（JY2002，上海衡平仪器仪表厂）
分析天平（AUY120,SHIMADZU）
数显鼓风干燥箱（GZX-9240MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）
MJ-300BS-Ⅱ霉菌培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）
超速离心机（D-78532Tuttlingen，Hettich）
微量加样枪
凝胶成像系
PCR仪
恒温振荡器（CHA-S，国华企业）
稳压稳流电泳仪（JY-600PJ，北京君意东方）
调速多用振荡器（HY-4，国华电器有限公司）
美的电冰箱（美的集团电冰箱制造有限公司）
3实验方法
3.1菌种活化
（1）LB培养基的配置
称取蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g放于烧杯中，加适量蒸馏水搅拌溶化并定容至100ml。
完全溶解后，分装到两个三角瓶中，每个三角瓶中各50ml。
向其中一个三角瓶中加入1.2g琼脂粉后，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。
（2）灭菌
将枪头、50mlLB固体培养基、50mlLB液体培养基、装有牙签的培养皿、10支试管、四个培养皿放入灭菌锅121℃灭菌20min.
（3）无菌接种
在无菌操作台中，取出LB固体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.混匀后，倒三个平板。
培养基凝固后，分别划线接种含PUC18、PUC19质粒的大肠杆菌菌种，编号1、2。
平板倒置放在37℃培养箱中培养过夜。
（4）挑单菌落
在无菌操作台中，取出LB液体培养基，待其温度降至50℃左右（不烫手）,加入50μL氨苄青霉素.充分混匀后，分装于10支试管中，每支试管各5ml。
用镊子取无菌牙签挑取1、2平板上的单菌落，接种于于5mlLB含氨卞青霉素（0.1g/ml）的液体培养基内，37℃，250rpm，恒温摇床振荡增殖培养过夜。
3.2SDS碱裂解法制备质粒
（1）细菌收集
用微量移液枪各取1mL两种菌液至1.5mlEP管内做好标记，6000rpm离心3min，弃尽上清液。
再次取样1mL菌液至同一EP管内，重复离心，留沉淀。
（2）细菌裂解
向上述沉淀中加入100μL冰预冷的碱裂解液Ⅰ，强烈振荡混匀（用移液枪吹打）至菌悬液完全浑浊；加入200μL新配置的碱裂解液Ⅱ于菌悬液中，盖严管盖，轻轻颠倒混匀4-5次，但切勿振荡，冰浴约5min，至瓶盖下出现粘稠丝状物为止；再加入150μL预冷的溶液Ⅲ，盖严管盖，温和振荡数次，冰浴5min。
（3）提取质粒
10000rpm室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5mLEP管中。
（4）质粒纯化
向上述上清中加入等体积酚氯仿（1:
1），振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；将酚氯仿的混合物换成等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；向上述上清中加入等体积的异丙醇，轻微振荡后摇匀，室温静置5min；10000rpm离心10min，去上清，向EP管中加入70%酒精200μl，盖紧管口，颠倒几次，10000rpm离心2min，弃去上清液，在50℃烘箱中烘干至沉淀变透明。
重复以上操作，再制备等量两种菌种的纯化质粒各一支，分别标记PUC18、PUC19。
（5）纯化质粒DNA
将同种纯化质粒的两管混合，加入50μL蒸馏水，并加入2μL的去除了DNA酶的RNA酶，-20℃冰箱保存备用。
3.3质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测
（1）配胶
称取琼脂糖0.25g放入三角瓶，加25ml电泳缓冲液，在电炉上充分加热溶解。
滴加一小滴EB（溴化乙锭）溶液，使溶胶成微红色，摇匀。
（2）制胶
在室温下冷却至65℃左右，向放好梳子和挡板的槽内到胶，厚度约0.3cm左右。
待胶体凝固后，小心拔出梳子，将电泳胶放到电泳槽的平台上，加电泳缓冲液使其刚好浸没胶面。
（3）加样
分别取获得的质粒DNA10μL在塑料手套与2μL含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液，混匀后取10μl上样。
同时取5μLDNAMarker上样。
（4）电泳
以上样槽一端为负极接通电源，调节电压至100V,约20min后，根据溴酚蓝指示剂的迁移位置，决定是否终止电泳。
（5）紫外观察
切断电源，取出凝胶，置于紫外透视仪上观察实验结果并拍照。
3.4DNA酶切
（1）取一离心管，分别加入：
5μL无菌水、2μL10xBuffer、11μL质粒DNA、1μLBamHI、1μLHandⅢ，总体积共20μL。
（2）混匀后，离心5秒，37℃酶切过夜。
3.5酶切后产物回收纯化
（1）配胶
称取琼脂糖0.3g放入三角瓶，加30ml电泳缓冲液，在电炉上充分加热溶解。
滴加一小滴EB（溴化乙锭）溶液，使溶胶成微红色，摇匀。
（2）制胶
在室温下冷却至65℃左右，向放好梳子和挡板的槽内到胶，厚度约0.3cm左右。
待胶体凝固后，小心拔出梳子，将电泳胶放到电泳槽的平台上，加电2μL泳缓冲液使其刚好浸没胶面。
（3）加样
分别取获得的质粒DNA20μL在塑料手套与4μL含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液，混匀后上样。
同时取5μLDNAMarker上样。
（4）电泳
以上样槽一端为负极接通电源，调节电压至100V,约20min左右。
3.6酶切载体pUC18与bop基因的连接反应
（1）取一离心管，分别加入：
2μL酶切pUC18、15μL酶切外源基因片段、1μLT4连接酶、2μL10×T4连接酶Buffer，总体积共20μL。
（2）混匀后，离心5秒，置于16℃恒温水浴箱内静置过夜。
3.7CaCl2制备感受态细胞
（1）活化菌种从接有大肠杆菌DH5α的LB平板上挑取单菌落，接种到含5mlLB培养基的无菌试管中，37℃，250rpm恒温摇床中震荡过夜。
（2）扩大培养取1μL菌液转移到装有5mlLB培养基的试管中（1：
50），37℃，250rpm恒温摇床培养3h。
（3）将活化好的菌种与冰水混合物中放置10min，取1ml菌液置于1.5ml无菌离心管中，4℃4000rpm离心5min，倒掉上清。
（4）在上述沉淀中加入800μL冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（已灭菌），用移液器吹打悬浮菌体。
（5）重复上述两个步骤，6000rpm离心5min，去上清，收集菌体，再加入100μL冰预冷的0.1mol/L的Call2（已灭菌），重悬细胞，于-20℃冰箱放置备用。
2.2.8质粒DNA的转化
（1）从-20℃冰箱中取出感受态细胞（200μ1），移取50μ1置于空离心管中，再加入20μl连接产物，温和混匀.
（2）先室温静置30min，再冰浴静置lO-30min，然后，42℃静置水浴热激90s，立即移置冰浴中，放置30min使之冷却。
（3）分别取100μl转化菌液均匀涂布于3个事先制备好的氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板上，并以50μ1感受态细胞涂布3个平板作为对照组。
（4）将平板正向放置在37℃恒温培养箱1h，直到表面液体都渗到培养基后再倒置培养过夜后观察。
3.8PCR扩增目的基因
（1）依次向PCR反应管中加入无菌水20.5μl、10xPCRbuffer2.5μl、20mmol／L4种dNTP混合液0.5μl、20μmol／L正向引物0.5μl、20μmol／L负向引物0.5μl、1.2μlTapDNA聚合酶0.5μl、模板DNA1μl,总体积25μl.（以上试剂均事先在冰箱中冷藏保存）
（2）充分混匀后，将PCR反应管放置在PCR仪的加热板上。
（3）梯度PCR按下列条件扩增：
先95℃变性5min，再按如下参数循环30次：
94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min30s。
最后，72℃保温5min.
（4）PCR回收产物检测
按照2.2.3称取琼脂糖0.2g放入三角瓶，加20ml电泳缓冲液配胶、制胶，取10μlPCR产物和2μl6x1000loadingbuffer混合液10μl上样，同时取5μLDNAMarker上样。
观察电泳后结果并拍照。
[3]
4结果与讨论
4.1实验结果
4.1.1pUC18和pUC19-bop质粒DNA电泳鉴定
提取含pUC18和pUC19-bop两种质粒DNA，蒸馏水溶解，RNA消化酶处理，经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。
与DNAMarker相比较，两种质粒DNA在1200bp到2000bp之间均有一条清晰明亮DNA条带（图1）。
1234567Mbp
2000
1000
0
图1pUC18质粒DNA琼脂糖凝胶电泳鉴定
M：
DL2000Marker；1~7：
pUC18质粒DNA；
4.1.2pUC19-bop质粒PCR扩增产物电泳鉴定
从pUC19-bop质粒经PCR特异性扩增目的基因bop，经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。
与DNAMarker相比较，在1000bp到2000bp之间有一条明显特异性条带，与预期大小1200bp相符，初步确定此处为PCR扩增得到的含bop基因片段；在100bp处有条带出现，初步推断此处PCR扩增体系中的引物（图2）。
12345678Mbp
2000
1200
0
图2bop基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
M：
DL2000Marker；1~8：
PCR扩增产物
4.1.3克隆载体pUC18酶切产物电泳鉴定
将克隆载体pUC18HandⅢ酶切，经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。
与DNAMarker相比较，孔上样孔在2000bp之上有一条带，与预期大2656bp相符，可以初步确定此处为此处为pUC18经HandⅢ酶切后质粒DNA；（图3）。
电泳条带清晰，无拖尾和污染出现，说明经酶切的克隆载体pUC18及目的片段可用于下一步于载体连接。
2000
图3克隆载体pUC18及bop基因片段琼脂糖凝胶电泳结果
M：
DL2000Marker；2条光带为酶切后的pUC18；
4.1.4重组质粒的制备及抗性筛选
目的片段和pUC18HandⅢ酶切后，用T4DNA连接酶16℃静置过夜后，转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞。
转化产物在Amp+的LB平板上（设计空白、阳性和阴性对照组）37℃培养过夜，只有转化质粒在Amp+的LB培养基上有菌落形成。
图4导入重组质粒的感受态细胞图5感受态细胞
4.1.5重组质粒的PCR鉴定
挑取阳性重组转化子白色菌落，在含有0.1g/ml氨苄青霉素的5m1LB液体培养基培养过夜，小量提取质粒DNA，另取小量菌液做PCR扩增反应，将提取到的重组质粒DNA及PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。
结果发现，重组质粒1、3孔在大于2000bp上均有清晰的DNA条带，同预期大小基本相符，可判断bop基因在pUC18克隆载体中克隆成功。
PCR扩增产物在2孔得到了1200bp左右的特异目的条带，与bop基因片段大小相符（6）。
图6重组质粒的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
M：
DL2000Marker；1,3,5,7,8：
重组质粒DNA；2,4,6：
重组质粒的PCR产物
结论
本实验以含pUC18和pUC19－bop两种质粒为生物材料，根据分子生物学基因重组技术构建了pUC18－bop重组质粒，经检测构建成功，为后续进一步对bop基因的实验研究奠定了基础。
通过本实验可得到以下结论：
1.实验采取SDS碱裂解法提取pUC18和pUC19－bop两种质粒DNA，经1％琼脂糖凝胶电泳可确定为两种质粒DNA；
2．设计PCR聚合酶链反应上下游引物碱基序列，经PCR扩增将产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，得到PCR扩增产物分子量与预期大小一致，可确定成功扩增含bop基因目的片段；
3．载体和目的片段分别经限制性内切酶BamHI和HindⅢ双酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳初步鉴定示所得载体及bop基因分子量大小与预期结果一致；
4．将载体和bop基因用T4DNA连接酶连接，重组质粒转化入大肠杆菌DH5α并通过氨苄青霉素成功筛选出抗性转化子；
5.提取阳性重组转化子质粒进行特异性PCR鉴定及酶切鉴定，在1％琼脂糖凝胶电泳结果中证实重组构建成功。
参考文献
[1]2010年科学出版社图书
[2]中国百科网
[3]李凌,吴敏等.br基因的克隆及表达[J].浙江大学学报,2001,35（3）:
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[5]王志昇等.PRRSV陕西分离株ORF5基因克隆、序列分析及原核表达[J].西北农业学报,2010,19（8）:
1～6
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