BOP基因的克隆及鉴定.docx

1、BOP基因的克隆及鉴定BOP基因的克隆及鉴定D存在下，依靠于DNA聚合酶的酶促合成反应。DNA聚合酶以单链DNA为模板，借助一小段双链DNA来启动合成，通过一个或两个人工合成的寡核苷酸引物与单链DNA模板中的一段互补序列结合，形成部分双链。在适宜的温度和环境下，DNA聚合酶将脱氧单核苷酸加到引物3-OH末端，并以此为起始点，沿模板53方向延伸，合成一条新的DNA互补链。 PCR反应的基本成分包括：模板DNA(待扩增DNA)、引物、4种脱氧核苷酸(dNTPs)、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的自然复制过程，其特异性依靠于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反

2、应步骤构成：模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作预备；模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的适温延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保存复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保存复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保存复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟

3、， 23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。21.3 感受态细胞 感受态细胞（competent cell）：理化方法诱导细胞，使其处于最适摄取和容纳外来DNA的生理状态。主要原理就是通过处理使细胞的通透性变大，直观的说，使得细胞膜表面出现一些孔洞，便于外源基因或载体进入感受态细胞。由于细胞膜的流动性，这种孔洞会被细胞自身所修复。将构建好的载体转入感受态细胞进行表达，不仅可以检验重组载体是否构建成功，最主要的是感受态细胞作为重组载体的宿主可以进行后续实验，如蛋白质表达纯化等工作。21.4 酶切鉴定 实验在重组质粒构建，重组质粒pUC18-bop采用BamH I、Hand 双酶切鉴定，在对双

4、酶切产物进行1琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像图中可以看到所得条带都不是很清晰，有拖尾现象出现。这可能由于未待胶完全凝固时加样了；重组质粒条带有明显拖带出现，这与质粒提取，提纯操作有关！但可以看出其分子量同bop基因分子量（1200bp左右）一至。酶切能进一步证实bop基因的成功克隆。但就实验设计来看，为更清晰看到双酶切前后及PCR扩增片段与bop基因区别，笔者建议将克隆载体pUC18质粒，PCR扩增产物，酶切后的克隆载体及目的基因在一块琼脂糖凝胶上电泳。【2】2实验材料与仪器2.1实验材料2.1.1 生物材料大肠杆菌（Escherichia coli）DH5,克隆载体pUC 18由武汉大学东湖分校生

5、物技术实验室保存，含bop基因的pUC 19质粒的大肠杆菌由武汉大学东湖分校金卫华老师提供。2.1.2 生化材料T4DNA连接酶，BamH I及Hind核酸内切酶等均购自大连Takara公司，氨苄青霉素（Amp）购自上海生工公司，Marker购自Fermentas公司，电泳用琼脂糖及细菌培养用琼脂均购自晶美公司。DNA回收试剂盒购自MBI公司。2.2主要实验试剂2.2.1 LB液体培养基：精确称取胰化蛋白胨lg，酵母提取物0.5g，NaCI lg放入烧杯内，加蒸馏水充分溶解后定容至100mL，121高压下蒸汽灭菌20min。储存于4备用。2.2.2 LB固体培养基：取配置好的未高压蒸汽灭菌的L

6、B液体培养基50ml加入细菌培养用琼脂(BactoAgar)0.5g，混匀后121高压蒸汽灭菌20min。储存于4备用。2.2.3 碱性裂解液：精确称取葡萄糖0.495g，Tris碱0.0303g，二水乙二胺四乙酸二钠0.146g与小烧杯中，用蒸馏水充分溶解后定容至50ml。2.2.4 碱性裂解液：精确移取0.2mol/L的NaOH 20L，1的SDS 20L，加蒸馏水160L混匀。(注意:0.2mol/L的NaOH和1的SDS分开配,临时混合用)2.2.5 碱性裂解液：精确移取5mol/L的乙酸钾30ml，冰乙酸5.8ml，加入蒸馏水并定容至50ml。2.2.6 上样缓冲液：精确称取溴酚蓝2

7、.5mg，加入60甘油0.6ml，50EDTA0.5g，摇匀后加蒸馏水至1ml。2.2.7 0.1molL CaCl2 ：精确称取1.19无水CaCl2定容至100ml，121，121高压蒸汽灭菌20分钟，4C保存。2.2.8 灭菌蒸馏水：蒸馏水水分装后121高压蒸汽灭菌后，4保存备用。2.3主要实验仪器洁净工作台（等级：100级，上海博迅实业有限公司医疗设备）高速离心机（D-37520，sigma） 电子天平（JY2002，上海衡平仪器仪表厂） 分析天平（AUY120,SHIMADZU） 数显鼓风干燥箱（GZX-9240 MBE，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）MJ-300BS-霉菌培养箱（

8、上海新苗医疗器械制造有限公司）超速离心机（D-78532 Tuttlingen，Hettich） 微量加样枪 凝胶成像系 PCR仪 恒温振荡器（CHA-S，国华企业） 稳压稳流电泳仪（JY-600PJ，北京君意东方）调速多用振荡器（HY-4，国华电器有限公司）美的电冰箱（美的集团电冰箱制造有限公司）3实验方法3.1菌种活化（1） LB培养基的配置称取蛋白胨1g、氯化钠1g、酵母提取物0.5g放于烧杯中，加适量蒸馏水搅拌溶化并定容至100ml。完全溶解后，分装到两个三角瓶中，每个三角瓶中各50ml。向其中一个三角瓶中加入1.2g琼脂粉后，塞上棉塞，并用报纸和棉线扎紧瓶口。（2）灭菌 将枪头、50

9、mlLB固体培养基、50mlLB液体培养基、装有牙签的培养皿、10支试管、四个培养皿放入灭菌锅121灭菌20min.（3）无菌接种在无菌操作台中，取出LB固体培养基，待其温度降至50左右（不烫手）,加入50L氨苄青霉素.混匀后，倒三个平板。培养基凝固后，分别划线接种含PUC18 、PUC19质粒的大肠杆菌菌种，编号1、2。平板倒置放在37培养箱中培养过夜。（4） 挑单菌落 在无菌操作台中，取出LB液体培养基，待其温度降至50左右（不烫手）,加入50L氨苄青霉素.充分混匀后，分装于10支试管中，每支试管各5ml。用镊子取无菌牙签挑取1、2平板上的单菌落，接种于于5ml LB含氨卞青霉素（0.1g

10、/ml）的液体培养基内，37，250rpm，恒温摇床振荡增殖培养过夜。3.2 SDS碱裂解法制备质粒 （1） 细菌收集用微量移液枪各取1mL两种菌液至1.5ml EP管内做好标记，6 000 rpm离心3min，弃尽上清液。再次取样1mL菌液至同一EP管内，重复离心，留沉淀。（2）细菌裂解向上述沉淀中加入100L冰预冷的碱裂解液，强烈振荡混匀（用移液枪吹打）至菌悬液完全浑浊；加入200L新配置的碱裂解液于菌悬液中，盖严管盖，轻轻颠倒混匀4-5次，但切勿振荡，冰浴约5min，至瓶盖下出现粘稠丝状物为止；再加入150L预冷的溶液，盖严管盖，温和振荡数次，冰浴5min。（3）提取质粒10 000rp

11、m 室温离心5min，取上清至一个新的无菌的1.5mL EP管中。（4）质粒纯化向上述上清中加入等体积酚氯仿(1:1)，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；将酚氯仿的混合物换成等体积的氯仿，振荡混匀，10000rpm离心5min，上清转移至另一个EP管中；向上述上清中加入等体积的异丙醇，轻微振荡后摇匀，室温静置5min；10000rpm离心10min，去上清，向EP管中加入70%酒精200l，盖紧管口，颠倒几次，10 000rpm离心2min，弃去上清液，在50烘箱中烘干至沉淀变透明。重复以上操作，再制备等量两种菌种的纯化质粒各一支，分别标记PUC18 、PUC1

12、9。（5） 纯化质粒DNA 将同种纯化质粒的两管混合，加入50L蒸馏水，并加入2L 的去除了DNA酶的RNA酶，-20冰箱保存备用。3.3 质粒DNA琼脂糖凝胶电泳检测（1） 配胶称取琼脂糖0.25g放入三角瓶，加25ml电泳缓冲液，在电炉上充分加热溶解。滴加一小滴EB（溴化乙锭）溶液，使溶胶成微红色，摇匀。（2） 制胶在室温下冷却至65左右，向放好梳子和挡板的槽内到胶，厚度约0.3cm左右。待胶体凝固后，小心拔出梳子，将电泳胶放到电泳槽的平台上，加电泳缓冲液使其刚好浸没胶面。（3）加样分别取获得的质粒DNA 10L在塑料手套与2L含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液，混匀后取10l上样。同时取5L D

13、NA Marker上样。（4）电泳以上样槽一端为负极接通电源，调节电压至100V,约20min后，根据溴酚蓝指示剂的迁移位置，决定是否终止电泳。（5）紫外观察切断电源，取出凝胶，置于紫外透视仪上观察实验结果并拍照。3.4 DNA酶切（1）取一离心管，分别加入： 5L无菌水、2L10xBuffer、 11L质粒DNA 、1LBamH I 、1L Hand ，总体积共20L。（2）混匀后，离心5秒，37酶切过夜。3.5酶切后产物回收纯化（1）配胶称取琼脂糖0.3g放入三角瓶，加30ml电泳缓冲液，在电炉上充分加热溶解。滴加一小滴EB（溴化乙锭）溶液，使溶胶成微红色，摇匀。（2）制胶在室温下冷却至6

14、5左右，向放好梳子和挡板的槽内到胶，厚度约0.3cm左右。待胶体凝固后，小心拔出梳子，将电泳胶放到电泳槽的平台上，加电2L泳缓冲液使其刚好浸没胶面。（3）加样分别取获得的质粒DNA 20L在塑料手套与4L含溴酚蓝指示剂的上样缓冲液，混匀后上样。同时取5L DNA Marker上样。（4）电泳以上样槽一端为负极接通电源，调节电压至100V,约20min左右。3.6 酶切载体pUC 18 与bop基因的连接反应（1）取一离心管，分别加入：2L酶切pUC 18、15L酶切外源基因片段、1L T4 连接酶、2L10T4 连接酶 Buffer，总体积共20L。（2）混匀后，离心5秒，置于16恒温水浴箱内

15、静置过夜。3.7 CaCl2制备感受态细胞(1) 活化菌种 从接有大肠杆菌DH5的LB平板上挑取单菌落，接种到含5ml LB培养基的无菌试管中，37，250rpm恒温摇床中震荡过夜。 (2)扩大培养 取1L菌液转移到装有5ml LB培养基的试管中(1：50)，37，250rpm恒温摇床培养3h 。(3) 将活化好的菌种与冰水混合物中放置10min，取1ml菌液置于1.5ml无菌离心管中，4 4000rpm离心5min，倒掉上清。(4) 在上述沉淀中加入800L冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（已灭菌），用移液器吹打悬浮菌体。(5)重复上述两个步骤，6000rpm离心5min，去上清，收集菌

16、体，再加入100L冰预冷的0.1mol/L的Call2（已灭菌），重悬细胞，于-20冰箱放置备用。2.2.8质粒DNA的转化（1）从-20冰箱中取出感受态细胞(2001)，移取501置于空离心管中，再加入20l连接产物，温和混匀.(2)先室温静置30min，再冰浴静置lO-30min，然后，42静置水浴热激90s，立即移置冰浴中，放置30min使之冷却。（3）分别取100l转化菌液均匀涂布于3个事先制备好的氨苄青霉素（0.1g/ml）LB琼脂平板上，并以501感受态细胞涂布3个平板作为对照组。 （4）将平板正向放置在37恒温培养箱1h，直到表面液体都渗到培养基后再倒置培养过夜后观察。3.8 P

17、CR扩增目的基因（1）依次向PCR反应管中加入无菌水20.5l、10xPCR buffer 2.5l、20mmolL 4种dNTP混合液 0.5l 、20molL正向引物 0.5l 、20molL负向引物 0.5l、1.2lTapDNA聚合酶 0.5l、模板DNA 1l,总体积25l.（以上试剂均事先在冰箱中冷藏保存）（2）充分混匀后，将PCR反应管放置在PCR仪的加热板上。（3）梯度PCR按下列条件扩增：先95变性5 min，再按如下参数循环30次：94变性30s，60退火30 s，72延伸1min30s 。最后，72保温5min.（4）PCR回收产物检测按照2.2.3称取琼脂糖0.2g放入

18、三角瓶，加20ml电泳缓冲液配胶、制胶，取10lPCR产物和2l 6x1000 loading buffer混合液10l上样，同时取5L DNA Marker上样。观察电泳后结果并拍照。34 结果与讨论4.1 实验结果4.1.1 pUC18和pUC19-bop质粒DNA电泳鉴定提取含pUC18和pUC19-bop两种质粒DNA，蒸馏水溶解，RNA消化酶处理，经1琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。与DNA Marker相比较，两种质粒DNA在1200bp到2000bp之间均有一条清晰明亮DNA条带 (图1)。 1 2 3 4 5 6 7 M bp 2000 1000 0 图1 pUC18质粒D

19、NA琼脂糖凝胶电泳鉴定M：DL2000Marker；17：pUC18质粒DNA；4.1.2 pUC19-bop质粒PCR扩增产物电泳鉴定从pUC19-bop质粒经PCR特异性扩增目的基因bop，经1琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。与DNA Marker相比较，在1000bp到2000bp之间有一条明显特异性条带，与预期大小1200bp相符，初步确定此处为PCR扩增得到的含bop基因片段；在100bp处有条带出现，初步推断此处PCR扩增体系中的引物（图2）。 1 2 3 4 5 6 7 8 M bp 2000 1200 0图2 bop基因的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果M：DL2000Ma

20、rker；18：PCR扩增产物4.1.3 克隆载体pUC18酶切产物电泳鉴定将克隆载体pUC18Hand 酶切，经1琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。与DNA Marker相比较，孔上样孔在2000bp之上有一条带，与预期大2656bp相符，可以初步确定此处为此处为pUC18经Hand 酶切后质粒DNA；（图3）。电泳条带清晰，无拖尾和污染出现，说明经酶切的克隆载体pUC18及目的片段可用于下一步于载体连接。 2000图3 克隆载体pUC18及bop基因片段琼脂糖凝胶电泳结果M：DL2000Marker；2条光带为酶切后的pUC18；4.1.4 重组质粒的制备及抗性筛选目的片段和pUC18

21、Hand酶切后，用T4DNA连接酶16静置过夜后，转化到大肠杆菌DH5感受态细胞。转化产物在Amp+的LB平板上（设计空白、阳性和阴性对照组）37培养过夜，只有转化质粒在Amp+的LB培养基上有菌落形成。图4导入重组质粒的感受态细胞 图5感受态细胞 4.1.5 重组质粒的PCR鉴定挑取阳性重组转化子白色菌落，在含有0.1g/ml氨苄青霉素的5m1 LB液体培养基培养过夜，小量提取质粒DNA，另取小量菌液做PCR扩增反应，将提取到的重组质粒DNA及PCR扩增产物经1琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像系统成像。结果发现，重组质粒1、3孔在大于2000bp上均有清晰的DNA条带，同预期大小基本相符，可判断b

22、op基因在pUC18克隆载体中克隆成功。PCR扩增产物在2孔得到了1200bp左右的特异目的条带，与bop基因片段大小相符(6)。图6 重组质粒的PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果M：DL2000Marker；1,3,5,7,8：重组质粒DNA；2,4,6：重组质粒的PCR产物结论本实验以含pUC18和pUC19bop两种质粒为生物材料，根据分子生物学基因重组技术构建了pUC18bop重组质粒，经检测构建成功，为后续进一步对bop基因的实验研究奠定了基础。通过本实验可得到以下结论：1. 实验采取SDS碱裂解法提取pUC18和pUC19bop两种质粒DNA，经1琼脂糖凝胶电泳可确定为两种质粒DNA

23、；2设计PCR聚合酶链反应上下游引物碱基序列，经PCR扩增将产物进行1琼脂糖凝胶电泳，得到PCR扩增产物分子量与预期大小一致，可确定成功扩增含bop基因目的片段；3载体和目的片段分别经限制性内切酶BamH I和Hind 双酶切后，经1琼脂糖凝胶电泳初步鉴定示所得载体及bop基因分子量大小与预期结果一致；4将载体和bop基因用T4 DNA连接酶连接，重组质粒转化入大肠杆菌DH5并通过氨苄青霉素成功筛选出抗性转化子；5. 提取阳性重组转化子质粒进行特异性PCR鉴定及酶切鉴定，在1琼脂糖凝胶电泳结果中证实重组构建成功。参考文献12010年科学出版社图书2中国百科网3李凌,吴敏等.br基因的克隆及表达J.浙江大学学报,2001,35(3):2332364宋景娇,王友亮,曹军卫.bop基因及其上游启动子的克隆与表达J.武汉大学学报(理学版),2005,51(2):2152185王志昇等. PRRSV陕西分离株ORF5基因克隆、序列分析及原核表达J.西北农业学报,2010,19(8):16