抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定.docx

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抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定

抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定

【摘要】　　目的:

研制抗李斯特菌溶血素（LLO）的单克隆抗体（mAb）。

方法:

通过诱导重组大肠杆菌BL21（pGEX6p1hly）,以SDSPAGE分离菌体蛋白,切割目的蛋白LLOGST条带,研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。

利用亲和层析法纯化目的蛋白,作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选。

采用间接ELISA法测定腹水效价,DotELISA、Westernblot分析mAb的特异性。

结果:

获得3株稳定分泌抗LLOmAb的杂交瘤细胞株3B6、4D1、5D10,其Ig亚类均为IgG1。

3B6、4D1、5D10腹水的ELISA效价分别为1∶2×105、1∶2×105、1∶1×105。

Westernblot试验中,3株mAb均能与融合蛋白LLOGST发生反应出现特异性条带,而与纯化蛋白GST不反应。

在DotELISA试验中,3株mAb均能与表达LLO的细菌发生特异性反应。

结果表明,mAb3B6、4D1、5D10是针对LLO的特异性mAb。

结论:

成功地制备了抗LLO的mAb,为进一步研究LLO的生物学特性、产单核细胞李斯特菌的致病机制,以及建立产单核细胞李斯特菌（LM）快速检测技术奠定了基础。

【关键词】李斯特菌溶血素产单核细胞李斯特菌单克隆抗体

　　[Abstract]AIM:

Topreparethemonoclonalantibodies（mAbs）againstlisteriolysinO（LLO）,whichisthemajorvirulencefactorofListeriamonocytogenes.METHODS:

TheBALB/cmicewereimmunizedwiththeSDSPAGEproductofBL21（pGEX6p1hly）.ThepurifiedLLOGSTproteinwasusedasantigenfordetection.mAbsagainstLLOwerepreparedbyusingthelymphocytehybridomatechnique.ThespecificityofmAbswascharacterizedbyDotELISAandWesternblot.RESULTS:

Threehybridomacelllinesnamed3B6,4D1and5D10secretingmAbsagainstLLOwereobtained.TheimmunoglobulinsubclassesofthemAbswereIgG1.TheELISAtiteroftheasciticfluidsof3B6,4D1and5D10was1∶200000,1∶200000and1∶100000,respectively.WesternblotanalysisconfirmedthethreemAbsreactedonfusionproteinLLOGSTbutdidn’treactonproteinGST.DotELISAprovedthethreemAbsonlyreactonthebacteriaexpressingLLO.CONCLUSION:

ThesuccessfulpreparationofthreemAbsspecifictoproteinLLOlaysafoundationforfurtherstudyofthebiologicalcharacteristicsofLLOandthepathogenesisofListeriamonocytogenes.

　　[Keywords]listeriolysinO;Listeriamonocytogenes;monoclonalantibody

　　产单核细胞李斯特菌（Listeriamonocytogenes,LM）是一种胞内生长、兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌,是李斯特菌属中致病性最强的一种。

LM是一种重要的食源性病原菌,能引起人兽共患李斯特菌病[1]。

在动物中,对多种畜禽均有较高的致死率;在人类,主要表现为脑膜炎、流产以及免疫缺陷患者和新生儿的中枢神经系统的感染[2,3]。

近年来,欧美许多国家均有过李斯特菌病暴发的报道,因此对LM的研究具有重要的公共卫生意义。

LM的致病性由多种毒力因子决定,包括李斯特菌溶血素（listeriolysinO,简称LLO）、ActA蛋白、侵染性蛋白p60、内化素和磷脂酶C等,其中LLO是由LM特有的毒力标志基因hly编码的分泌蛋白,是LM的主要毒力因子。

LLO是一种能结合胆固醇,可被巯基活化的细胞溶解素,相对分子质量（Mr）为60000。

LLO能够溶解宿主细胞吞噬体膜,使LM能够逃离噬菌体中的杀菌物质,从而在胞质中增殖。

另外LLO还能在感染细胞内诱导信号转导,这一特性已被应用于疫苗研究中。

关于李斯特菌属特异性单克隆抗体（mAb）的研制已有报道,但是特异性针对LMLLO的mAb国内尚未见报道。

本研究中采用割胶免疫的方式研制针对LM特异性毒力因子LLO的mAb,为进一步研究LLO的生物学活性、致病性和免疫机制,建立快速检测LM的方法创造条件。

　　1材料和方法

　　材料重组大肠杆菌BL21（pGEX6p1hly）、BL21（pGEX6p1actA）、BL21（DE3）（pETactA）、BL21（DE3）（pET）、BL21（pGEX6p1）均为本室构建、保存。

其中重组菌BL21（pGEX6p1hly）携带hly基因,表达融合蛋白LLOGST;重组菌BL21（DE3）（pETactA）、BL21（pGEX6p1actA）携带actA基因。

产单核细胞李斯特菌分离株LM03032002、LM03032001、LM03040701、LM03032102、LM03061801、LM03041602、LMNJ1191、鸡白痢沙门氏菌由本室保存。

高糖型DMEM粉、细胞融合用PEG、辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠IgG和IgM抗体、鼠源mAb亚类试剂盒、氨基喋呤（A）、次黄嘌呤（H）、胸腺嘧啶核苷（T）均为Sigma公司产品;RedipackGSTpurificationmodule为AmershamBioscience公司产品;其余试剂均为国产分析纯;小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0Ag14为本室保存;6～8周龄雌性BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。

　　方法

　　亲和层析法纯化融合蛋白在30℃、IPTG浓度为mmol/L的条件下,诱导重组大肠杆菌BL21（pGEX6p1hly）5h,离心收获菌体,用磷酸盐缓冲液悬浮沉淀,超声波破碎菌体,离心收集上清,经RedipackGSTpurificationmodule亲和层析柱分离纯化收集目的蛋白LLOGST。

溶血试验验证该纯化蛋白的生物学活性,分光光度计测定蛋白含量,-70℃保存。

　　免疫原的制备重组大肠杆菌BL21（pGEX6p1hly）诱导表达后,离心收集沉淀,以磷酸盐缓冲液洗涤、悬浮,加入等量的上样缓冲液,沸水浴5min,进行SDSPAGE电泳,确定目的蛋白的位置,切取目的条带,液氮冷冻后研磨粉碎,作为免疫原。

　　杂交瘤细胞系的建立

（1）动物免疫:

将胶块粉末溶于PBS,腹腔注射6～8周龄雌性BALB/c小鼠,100μg/只。

共免疫3次,免疫间隔为2周。

第3次免疫2周后,尾静脉注射纯化蛋白LLOGST7μg/只,3d后取其脾脏融合。

（2）细胞融合、筛选及克隆化:

具体方法参照文献,对加强免疫的小鼠摘眼球采血,分离血清作为阳性对照,无菌摘取免疫鼠脾脏,与处在对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0在PEG4000的作用下融合。

其后用HAT培养基悬浮,并加入小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞,分装96孔板,置37℃、60mL/LCO2培养箱中培养。

5d后加入新鲜HAT培养基,10d后改用HT培养基进行培养,定期观察,适时换液和检测。

阳性细胞克隆的筛选采用间接ELISA法。

为避免产生针对融合蛋白GST的抗体,采用双筛法,即分别以纯化蛋白LLOGST和GST蛋白包被进行筛选。

筛选到的阳性细胞克隆采用有限稀释法进行3次亚克隆,直至所有细胞孔上清ELISA值均为阳性,扩大培养,建株冻存。

（3）腹水的制备8～12周龄BALB/c小鼠腹腔注射～mL的液体石蜡,7～10d后腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞,5×105个/只。

5d后注意观察,收集腹水,离心收集上清,加入甘油,-20℃保存。

　　mAb的鉴定

（1）mAb亚类的鉴定:

采用双向免疫扩散法鉴定抗体的亚类:

用10mg/L的琼脂糖制板,打孔器打出梅花形孔,中央孔加入10μL亚类试剂,周围孔加入10μL稀释后的腹水样品,37℃湿盒过夜,次日观察结果。

（2）mAb腹水效价测定:

以常规间接ELISA测定腹水抗体效价。

（3）Westernblot鉴定mAb的特异性:

参照文献方法,以120g/L的分离胶对纯化的LLOGST融合蛋白、GST蛋白和诱导后的重组大肠杆菌BL21（pGEX6p1）全菌蛋白进行SDSPAGE分析,通过电转印,将蛋白从胶上转移至NC膜上。

4℃封闭过夜,充分洗涤,加入稀释后的腹水,室温作用2h,充分洗涤,加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG和IgM抗体,作用1h,洗涤后DAB显色液显色,拍照记录结果。

（4）DotELISA鉴定mAb的特异性:

以DotELISA鉴定mAb的特异性。

选择BL21（pGEX6p1）、BL21（DE3）（pET）、BL21（pGEX6p1hly）、BL21（DE3）（pETactA）、BL21（pGEX6p1actA）、鸡白痢沙门氏菌、产单核细胞李斯特菌分离株LM03032002、LM03032001、LM03040701、LM03032102、LM03061801、LM03041602、LMNJ1191,分别挑取单菌落接种含相应抗生素的液体LB或BHI培养基,置37℃摇床培养过夜,离心收集菌体用PBS悬浮,超声波裂解后离心取上清。

剪取一定大小的硝酸纤维素膜（NC）,用去离子水浸透,晾干,各取菌液5μL点于NC膜上,37℃干燥30min,用含100mL/L小牛血清的PBST封闭,4℃过夜;PBST洗涤3次,5min/次;再浸入工作浓度的mAb溶液中,37℃孵育2h,PBST洗涤3次,5min/次;转入工作浓度的HRP标记羊抗鼠Ig（G+M）抗体溶液中,37℃孵育1h,PBST洗涤3次,5min/次;以DAB显色液显色。

　　2结果

　　融合蛋白LLOGST的纯化SDSPAGE分析显示,与未携带hly基因的阴性菌BL21（pGEX6p1）相比,重组菌BL21（pGEX6p1hly）在Mr为82000处明显多了一条带,与亲和层析法提纯的融合蛋白LLOGST大小一致。

在重组菌BL21（pGEX6p1hly）裂解上清和沉淀中均发现目的条带,说明表达产物以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在。

　　图1融合蛋白的SDSPAGE分析

　　Fig1SDSPAGEanalysisofexpressedproduct

　　M:

Proteinmarker;1:

BL21（pGEX6p1hly）inducedbyIPTG;2:

BL21（pGEX6p1）inducedbyIPTG;3:

CrackedsupernatantofBL21（pGEX6p1hly）inducedbyIPTG;4:

CrackeddepositofBL21（pGEX6p1hly）inducedbyIPTG;5:

LLOGSTproteinpurifiedbyGlutathioneSepharose4B.

　　mAb杂交瘤细胞株的建立以间接ELISA法筛选到3株稳定分泌LLOmAb的杂交瘤细胞株,分别命名为3B6、4D1、5D10。

对杂交瘤细胞进行多次冻存复苏和长期传代培养,其分泌抗体的能力和稳定性均无改变。

　　mAb生物学特性的鉴定间接ELISA实验结果表明,mAb3B6、4D1、5D10的腹水效价分别为1∶2×105、1∶2×105、1∶1×105;琼脂双扩散试验结果显示,3株mAb的亚类均为IgG1。

　　mAb特异性鉴定

　　Westernblot分析Westernblot分析显示,3株mAb与纯化蛋白LLOGST有特异性结合,在Mr为82000处出现特异性条带。

与不表达LLO蛋白的空载体转化菌BL21（pGEX6p1）无交叉反应;与融合蛋白GST也无反应。

这表明,所获得的3株mAb均为针对LLO的特异性mAb。

其中mAb4D1的Westernblot分析结果见图2。

　　图2mAb4D1Westernblot的分析结果

　　Fig2WesternblotanalysisofmAb4D1

　　M:

Proteinmarker;1:

BL21（pGEX6p1）wholeproteins;2:

PurifiedfusionproteinLLOGST;3:

PurifiedproteinGST.

　　mAb反应谱测定结果在DotELISA试验中,mAb3B6、4D1、5D10与菌株的反应谱测定结果见表1。

3株mAb均能与重组菌BL21（pGEX6p1hly）反应,并与产单核细胞LM分离株LM03032002、LM03032001、LM03040701、LM03032102、LM03061801、LM03041602、LMNJ1191反应,而与不表达LLO的菌株没有反应性。

反应谱的测定结果表明,3株LLOmAb具有良好的特异性。

　　表1LLOmAb与细菌的反应谱

　　Tab1Thereactivitiesofmonoclonalantibodieswithdifferentbacteria

　　3讨论

　　产单核细胞LM为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌,可引起人和动物的李斯特菌病。

20世纪80年代以来,LM在美国、加拿大、德国、瑞士、意大利等国曾多次暴发流行,其食源性病人日益增多。

在我国,LM也已成为食品污染物监测网中检测的病原菌之一。

由于易受LM污染的食物种类很多,而且其引起的食物中毒危害日益严重,国际各官方组织及研究机构对LM给予极大关注。

因此建立快速简便低成本的检测方法具有很大的现实意义。

利用抗原抗体的特异性反应来检测病原菌,简单方便,成本低,不需要特殊仪器,适合于大量检测。

但是目前国内所报道的抗体均是李斯特菌属特异性mAb,不能区分出LM和属内其他非致病性的菌株,这给LM的特异性检测带来了很大的困难,本研究通过制备LM特异毒力因子LLO的mAb,为特异性检测LM奠定基础。

　　LM是典型的胞内寄生细菌,可在MHCⅡ阳性专职巨噬细胞和MHCⅡ阴性非专职巨噬细胞中增殖。

其特殊的生活方式是许多毒力因子共同作用的结果。

1986年Gillard等发现李斯特菌溶血素LLO的致病性以来,已有许多证据证实LLO在LM致病中的关键作用[10]。

LLO的作用是溶解宿主细胞吞噬体膜,使细菌进入胞质增殖。

作为LM的主要毒力因子,LLO对于LM在宿主细胞内存活非常重要,LLO的缺失将使LM的毒力几乎完全丧失。

鉴于LLO具有溶解吞噬体膜的特殊功能,已被运用于不能逃离吞噬体的减毒活疫苗中,能较好地诱导机体的CTL效应。

本研究中纯化了具有生物活性的蛋白,成功研制出针对LLO的特异性mAb,这些结果为进一步研究LLO的致病性、免疫机制提供帮助,并且为建立快速检测LM的方法提供技术支持。

在重组菌表达时,摸索了较多条件,尝试不同的诱导温度,诱导剂的浓度,培养方式等,但发现对目的蛋白的表达量均无显着的影响,表达水平仍较低,这可能是由LLO本身的特性所造成的。

LLO对于温度和pH要求较为严格,在pH≥7的情况下;或者是温度30℃时,LLO的结构极易变性[11],而正常条件下培养基均为碱性,这可能是造成表达水平低的一个原因。

溶血试验、动物试验证明纯化蛋白LLOGST具有较强的生物学活性,微量注射即能致死小鼠。

因此我们尝试了割胶免疫的方式,可以降低毒性,提高免疫剂量,降低成本,另外胶块本身可起到佐剂的作用,短期内就可以产生较好的免疫效果。

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