抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定.docx

1、抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定抗李斯特菌溶血素单克隆抗体的制备及初步鉴定【摘要】 目的: 研制抗李斯特菌溶血素(LLO)的单克隆抗体(mAb)。方法: 通过诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX 6p 1 hly), 以SDS PAGE分离菌体蛋白, 切割目的蛋白LLO GST条带, 研磨粉碎后免疫BALB/c小鼠, 取免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合。利用亲和层析法纯化目的蛋白, 作为检测抗原进行杂交瘤细胞的筛选。采用间接ELISA法测定腹水效价, Dot ELISA、 Western blot分析mAb的特异性。结果: 获得3株稳定分泌抗LLO mAb的杂交瘤细胞株3B6、 4D1

2、、 5D10, 其Ig亚类均为IgG1。3B6、 4D1、 5D10腹水的ELISA效价分别为12105、 12105、 11105。Western blot试验中, 3株mAb均能与融合蛋白LLO GST发生反应出现特异性条带, 而与纯化蛋白GST不反应。在Dot ELISA试验中, 3株mAb均能与表达LLO的细菌发生特异性反应。结果表明, mAb 3B6、 4D1、 5D10是针对LLO的特异性mAb。结论: 成功地制备了抗LLO的mAb, 为进一步研究LLO的生物学特性、 产单核细胞李斯特菌的致病机制, 以及建立产单核细胞李斯特菌(LM)快速检测技术奠定了基础。【关键词】 李斯特菌溶血

3、素 产单核细胞李斯特菌 单克隆抗体Abstract AIM: To prepare the monoclonal antibodies (mAbs) against listeriolysin O (LLO), which is the major virulence factor of Listeria monocytogenes. METHODS: The BALB/c mice were immunized with the SDS PAGE product of BL21(pGEX 6p 1 hly). The purified LLO GST protein was used as

4、antigen for detection. mAbs against LLO were prepared by using the lymphocyte hybridoma technique. The specificity of mAbs was characterized by Dot ELISA and Western blot. RESULTS: Three hybridoma cell lines named 3B6, 4D1 and 5D10 secreting mAbs against LLO were obtained. The immunoglobulin subclas

5、ses of the mAbs were IgG1. The ELISA titer of the ascitic fluids of 3B6, 4D1 and 5D10 was 1200000, 1200000 and 1100000, respectively. Western blot analysis confirmed the three mAbs reacted on fusion protein LLO GST but didnt react on protein GST. Dot ELISA proved the three mAbs only react on the bac

6、teria expressing LLO. CONCLUSION: The successful preparation of three mAbs specific to protein LLO lays a foundation for further study of the biological characteristics of LLO and the pathogenesis of Listeria monocytogenes.Keywordslisteriolysin O; Listeria monocytogenes; monoclonal antibody产单核细胞李斯特菌

7、(Listeria monocytogenes, LM)是一种胞内生长、 兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌, 是李斯特菌属中致病性最强的一种。LM是一种重要的食源性病原菌, 能引起人兽共患李斯特菌病1。在动物中, 对多种畜禽均有较高的致死率; 在人类, 主要表现为脑膜炎、 流产以及免疫缺陷患者和新生儿的中枢神经系统的感染2, 3。近年来, 欧美许多国家均有过李斯特菌病暴发的报道, 因此对LM的研究具有重要的公共卫生意义。LM的致病性由多种毒力因子决定, 包括李斯特菌溶血素(listeriolysin O, 简称LLO)、 ActA蛋白、 侵染性蛋白p60、 内化素和磷脂酶C等, 其中LLO是由LM特有

8、的毒力标志基因hly编码的分泌蛋白, 是LM的主要毒力因子。LLO是一种能结合胆固醇, 可被巯基活化的细胞溶解素, 相对分子质量(Mr)为60000。LLO能够溶解宿主细胞吞噬体膜, 使LM能够逃离噬菌体中的杀菌物质, 从而在胞质中增殖。另外LLO还能在感染细胞内诱导信号转导, 这一特性已被应用于疫苗研究中。关于李斯特菌属特异性单克隆抗体(mAb)的研制已有报道, 但是特异性针对LM LLO的mAb国内尚未见报道。本研究中采用割胶免疫的方式研制针对LM特异性毒力因子LLO的mAb, 为进一步研究LLO的生物学活性、 致病性和免疫机制, 建立快速检测LM的方法创造条件。1 材料和方法材料 重组大

9、肠杆菌BL21(pGEX 6p 1 hly)、 BL21(pGEX 6p 1 actA)、 BL21(DE3)(pET actA)、 BL21(DE3)(pET)、 BL21(pGEX 6p 1)均为本室构建、 保存。其中重组菌BL21(pGEX 6p 1 hly)携带hly基因, 表达融合蛋白LLO GST; 重组菌BL21(DE3)(pET actA)、 BL21(pGEX 6p 1 actA)携带actA基因。产单核细胞李斯特菌分离株LM03032002、 LM03032001、LM03040701、LM03032102、LM03061801、LM03041602、 LMNJ1191、

10、鸡白痢沙门氏菌由本室保存。高糖型DMEM粉、 细胞融合用PEG、 辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗鼠IgG和IgM抗体、 鼠源mAb亚类试剂盒、 氨基喋呤(A)、 次黄嘌呤(H)、 胸腺嘧啶核苷(T)均为Sigma公司产品; Redipack GST purification module为Amersham Bioscience公司产品; 其余试剂均为国产分析纯; 小鼠骨髓瘤细胞系Sp2/0 Ag 14为本室保存; 68周龄雌性BALB/c小鼠购自扬州大学比较医学中心。方法亲和层析法纯化融合蛋白 在30、 IPTG浓度为 mmol/L的条件下, 诱导重组大肠杆菌BL21(pGEX 6p 1 h

11、ly) 5 h, 离心收获菌体, 用磷酸盐缓冲液悬浮沉淀, 超声波破碎菌体, 离心收集上清, 经Redipack GST purification module亲和层析柱分离纯化收集目的蛋白LLO GST。溶血试验验证该纯化蛋白的生物学活性, 分光光度计测定蛋白含量, -70保存。免疫原的制备 重组大肠杆菌BL21(pGEX 6p 1 hly)诱导表达后, 离心收集沉淀, 以磷酸盐缓冲液洗涤、 悬浮, 加入等量的上样缓冲液, 沸水浴5 min, 进行SDS PAGE电泳, 确定目的蛋白的位置, 切取目的条带, 液氮冷冻后研磨粉碎, 作为免疫原。杂交瘤细胞系的建立 (1)动物免疫: 将胶块粉末溶

12、于PBS, 腹腔注射68周龄雌性BALB/c小鼠, 100 g/只。共免疫3次, 免疫间隔为2周。第3次免疫2周后, 尾静脉注射纯化蛋白LLO GST 7 g/只, 3 d后取其脾脏融合。(2)细胞融合、 筛选及克隆化: 具体方法参照文献, 对加强免疫的小鼠摘眼球采血, 分离血清作为阳性对照, 无菌摘取免疫鼠脾脏, 与处在对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0在PEG4000的作用下融合。其后用HAT培养基悬浮, 并加入小鼠腹腔巨噬细胞作为滋养细胞, 分装96孔板, 置37、 60 mL/L CO2培养箱中培养。5 d后加入新鲜HAT培养基, 10 d后改用HT培养基进行培养, 定期观察, 适时

13、换液和检测。 阳性细胞克隆的筛选采用间接ELISA法。为避免产生针对融合蛋白GST的抗体, 采用双筛法, 即分别以纯化蛋白LLO GST和GST蛋白包被进行筛选。筛选到的阳性细胞克隆采用有限稀释法进行3次亚克隆, 直至所有细胞孔上清ELISA 值均为阳性, 扩大培养,建株冻存。(3)腹水的制备812周龄BALB/c小鼠腹腔注射 mL的液体石蜡, 710 d后腹腔注射对数生长期的杂交瘤细胞, 5105个/只。5 d后注意观察, 收集腹水, 离心收集上清, 加入甘油, -20保存。mAb的鉴定 (1)mAb亚类的鉴定: 采用双向免疫扩散法鉴定抗体的亚类: 用10 mg/L的琼脂糖制板, 打孔器打出

14、梅花形孔, 中央孔加入10 L亚类试剂, 周围孔加入10 L稀释后的腹水样品, 37湿盒过夜, 次日观察结果。(2)mAb腹水效价测定: 以常规间接ELISA测定腹水抗体效价。(3)Western blot鉴定mAb的特异性: 参照文献方法, 以120 g/L的分离胶对纯化的LLO GST融合蛋白、 GST蛋白和诱导后的重组大肠杆菌BL21(pGEX 6p 1)全菌蛋白进行SDS PAGE分析, 通过电转印, 将蛋白从胶上转移至NC膜上。4封闭过夜, 充分洗涤, 加入稀释后的腹水, 室温作用2 h, 充分洗涤, 加入工作浓度的HRP标记的羊抗鼠IgG和IgM抗体, 作用1 h, 洗涤后DAB显

15、色液显色, 拍照记录结果。(4)Dot ELISA鉴定mAb的特异性: 以Dot ELISA鉴定mAb的特异性。选择BL21(pGEX 6p 1)、 BL21(DE3)(pET)、 BL21(pGEX 6p 1 hly)、 BL21(DE3)(pET actA)、 BL21(pGEX 6p 1 actA)、 鸡白痢沙门氏菌、 产单核细胞李斯特菌分离株LM03032002、LM03032001、LM03040701、LM03032102、LM03061801、 LM03041602、 LMNJ1191, 分别挑取单菌落接种含相应抗生素的液体LB或BHI培养基, 置37摇床培养过夜, 离心收集菌体

16、用PBS悬浮, 超声波裂解后离心取上清。剪取一定大小的硝酸纤维素膜(NC), 用去离子水浸透, 晾干, 各取菌液5 L点于NC膜上, 37干燥30 min, 用含100 mL/L小牛血清的PBST封闭, 4过夜; PBST洗涤3次, 5 min/次; 再浸入工作浓度的mAb溶液中, 37孵育2 h, PBST洗涤3次, 5 min/次; 转入工作浓度的HRP标记 羊抗鼠Ig(G+M)抗体溶液中, 37孵育1 h, PBST洗涤3次, 5 min/次; 以DAB显色液显色。2 结果融合蛋白LLO GST的纯化 SDS PAGE分析显示, 与未携带hly基因的阴性菌BL21(pGEX 6p 1)相

17、比, 重组菌BL21(pGEX 6p 1 hly)在Mr为82000处明显多了一条带, 与亲和层析法提纯的融合蛋白LLO GST大小一致。在重组菌BL21(pGEX 6p 1 hly)裂解上清和沉淀中均发现目的条带, 说明表达产物以包涵体和可溶性蛋白2种形式存在。图1 融合蛋白的SDS PAGE 分析Fig 1 SDS PAGE analysis of expressed productM: Protein marker; 1: BL21(pGEX 6p 1 hly) induced by IPTG; 2: BL21(pGEX 6p 1) induced by IPTG; 3: Cracked

18、 supernatant of BL21(pGEX 6p 1 hly) induced by IPTG; 4: Cracked deposit of BL21(pGEX 6p 1 hly) induced by IPTG; 5: LLO GST protein purified by Glutathione Sepharose 4B.mAb杂交瘤细胞株的建立 以间接ELISA法筛选到3株稳定分泌LLO mAb的杂交瘤细胞株, 分别命名为3B6、 4D1、 5D10。对杂交瘤细胞进行多次冻存复苏和长期传代培养, 其分泌抗体的能力和稳定性均无改变。mAb生物学特性的鉴定 间接ELISA实验结果表明

19、, mAb 3B6、 4D1、 5D10的腹水效价分别为12105、 12105、 11105; 琼脂双扩散试验结果显示, 3株mAb的亚类均为IgG1。mAb特异性鉴定Western blot分析 Western blot分析显示, 3株mAb与纯化蛋白LLO GST有特异性结合, 在Mr为82000处出现特异性条带。与不表达LLO蛋白的空载体转化菌BL21(pGEX 6p 1)无交叉反应; 与融合蛋白GST也无反应。这表明, 所获得的3株mAb均为针对LLO的特异性mAb。其中mAb 4D1的Western blot分析结果见图2。图2 mAb 4D1 Western blot的分析结果F

20、ig 2 Western blot analysis of mAb 4D1M: Protein marker; 1: BL21(pGEX 6p 1) whole proteins; 2: Purified fusion protein LLO GST; 3: Purified protein GST.mAb反应谱测定结果 在Dot ELISA试验中, mAb 3B6、 4D1、 5D10与菌株的反应谱测定结果见表1。3株mAb均能与重组菌BL21(pGEX 6p 1 hly)反应, 并与产单核细胞LM分离株LM03032002、 LM03032001、 LM03040701、 LM030321

21、02、 LM03061801、 LM03041602、 LMNJ1191反应, 而与不表达LLO的菌株没有反应性。反应谱的测定结果表明, 3株LLO mAb具有良好的特异性。表1 LLO mAb与细菌的反应谱Tab 1 The reactivities of monoclonal antibodies with different bacteria3 讨论 产单核细胞LM为革兰氏阳性兼性厌氧杆菌, 可引起人和动物的李斯特菌病。20世纪80年代以来, LM在美国、 加拿大、 德国、 瑞士、 意大利等国曾多次暴发流行, 其食源性病人日益增多。在我国, LM也已成为食品污染物监测网中检测的病原菌之一

22、。由于易受LM污染的食物种类很多, 而且其引起的食物中毒危害日益严重, 国际各官方组织及研究机构对LM给予极大关注。因此建立快速简便低成本的检测方法具有很大的现实意义。利用抗原 抗体的特异性反应来检测病原菌, 简单方便, 成本低, 不需要特殊仪器, 适合于大量检测。但是目前国内所报道的抗体均是李斯特菌属特异性mAb, 不能区分出LM和属内其他非致病性的菌株, 这给LM的特异性检测带来了很大的困难, 本研究通过制备LM特异毒力因子LLO的mAb, 为特异性检测LM奠定基础。 LM是典型的胞内寄生细菌, 可在MHC 阳性专职巨噬细胞和MHC 阴性非专职巨噬细胞中增殖。其特殊的生活方式是许多毒力因子

23、共同作用的结果。1986年Gillard等发现李斯特菌溶血素LLO的致病性以来, 已有许多证据证实LLO在LM致病中的关键作用10。LLO的作用是溶解宿主细胞吞噬体膜, 使细菌进入胞质增殖。作为LM的主要毒力因子, LLO对于LM在宿主细胞内存活非常重要, LLO的缺失将使LM的毒力几乎完全丧失。鉴于LLO具有溶解吞噬体膜的特殊功能, 已被运用于不能逃离吞噬体的减毒活疫苗中, 能较好地诱导机体的CTL效应。本研究中纯化了具有生物活性的蛋白, 成功研制出针对LLO的特异性mAb, 这些结果为进一步研究LLO的致病性、 免疫机制提供帮助, 并且为建立快速检测LM的方法提供技术支持。在重组菌表达时,

24、 摸索了较多条件, 尝试不同的诱导温度, 诱导剂的浓度, 培养方式等, 但发现对目的蛋白的表达量均无显着的影响, 表达水平仍较低, 这可能是由LLO本身的特性所造成的。LLO对于温度和pH要求较为严格, 在pH7的情况下; 或者是温度30时, LLO的结构极易变性11, 而正常条件下培养基均为碱性, 这可能是造成表达水平低的一个原因。溶血试验、 动物试验证明纯化蛋白LLO GST具有较强的生物学活性, 微量注射即能致死小鼠。因此我们尝试了割胶免疫的方式, 可以降低毒性, 提高免疫剂量, 降低成本, 另外胶块本身可起到佐剂的作用, 短期内就可以产生较好的免疫效果。【参考文献】 1 Fiedler

25、 F, Seger J, Schrettenbrunner A, et al. The biochemistry of murein and cell wall teichoic acids in the genus of ListeriaJ. Syst Appl Microbiol, 1984, 5(33): 360-376. Altimira J, Prats N, Lopez S, et al. Repeated oral dosing with Listeria monocytogenes in mice as a model of central nervous system lis

26、teriosis in manJ. Comp Pathol, 1999, 121(2): 117-125.Vazquez Boland J, Kuhn M, Berche P, et al. Listeria pathogenesis and molecular virulence determinantsJ. Clin Microbiol Rev, 2001, 14(3): 54-640.Cossart P. Molecular and cellular basis of the infection by Listeria monocytogenes: an overviewJ. Int J

27、 Med Microbiol, 2002, 291(6-7): 401-409.殷月兰, 焦新安, 潘志明, 等. 李斯特菌溶血素基因的原核表达及其生物学活性J. 微生物学报, 2004, 44(6): 752-755.周晓辉, 焦新安. 李斯特菌细胞溶解素在疫苗研制中的应用J. 中华微生物学与免疫学杂志, 2003, 23(5): 405-406.范红结, 焦新安, 刘秀梵, 等. 高度特异的李斯特菌单抗试剂的研制及鉴定J. 中国兽医科技, 1996, 10(26): 20-21.刘秀梵. 单克隆抗体在农业上的应用M. 合肥: 安徽科学技术出版社, 1994: 11-50.杜雪梅, 唐 丽, 柳晓兰, 等. 抗人LSECtin单克隆抗体的制备与初步鉴定J. 细胞与分子免疫学杂志, 2006, 22(4): 517-520.10 张晓峰, 程 洁, 方维焕, 等. 抗李斯特菌病免疫机理研究进展J. 中国人兽共患病杂志, 2003, 19(5): 113-115.11 Daniel W, Elizabeth M, Rodney K, et al. Molecular basis of listeriolysin O pH dependenceJ. PNAS, 2005, 35(8): 12537-12542.