高效液相色谱法同时测定动物组织中16种苯并咪唑类药物残留百精.docx
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高效液相色谱法同时测定动物组织中16种苯并咪唑类药物残留百精
231
※分析检测食品科学
2011,Vol.32,No.02
高效液相色谱法同时测定动物组织中16种
苯并咪唑类药物残留
林海丹,林峰,张美金,谢守新,吴映璇,邵琳智,姚仰勋
（广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心,广东广州510623
摘 要:
建立同时测定动物组织中16种苯并咪唑类药物及其代谢物多残留的高效液相色谱分析方法。
试样经乙酸乙酯、50g/100mL氢氧化钾溶液、1g/100mLBHT溶液（20+0.15+1,V/V提取后,正己烷脱脂,MCX固相萃取柱净化,用高效液相色谱C18柱分离,乙腈-0.025mol/L乙酸铵作为流动相,流速为1.0mL/min,梯度洗脱,紫外检测波长为292nm,外标法峰面积定量。
16种苯并咪唑类药物在0.025~1.0mg/L质量浓度范围内线性良好,相关系数r均大于0.99,动物组织样品在10、50、100μg/kg添加水平的添加回收率在81.6%~110%之间,相对标准偏差为1.8%~13.1%（n=10,方法的定量限为10μg/kg。
方法灵敏度高、重现性好,适用于动物组织中苯并咪唑类药物多残留的检测。
关键词:
高效液相色谱;动物组织;苯并咪唑类药物
SimultaneousHPLCDeterminationof16BenzimidazolesResiduesinAnimalTissue
LINHai-dan,LINFeng,ZHANGMei-jin,XIEShou-xin,WUYing-xuan,SHAOLin-zhi,YAOYang-xun（InspectionandQuarantineTechnologyCenter,GuangdongEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Guangzhou510623,China
Abstract:
Ahighperformanceliquidchromatography（HPLCmethodwasdevelopedforthesimultaneousdeterminationof16benzimidazolesresiduesinanimaltissue.Animaltissuesampleswereextractedwithethylacetate-50%potassiumhydrox-ide-1%BHT（20:
0.15:
1,V/V,followedbytreatmentwithn-hexanefordefattingandfurtherclean-uponMCXsolidphase（SPEcartridge.ThechromatographicseparationwasperformedonaC18columnwithamobilephaseconsistingofacetonitrileand0.025mol/Lammoniumacetatesolutionataflowrateof1.0mL/minbygradientelution.Detectionwavelengthwassetat292nm,andthequantitationmethodusedwasexternalstandardmethod.Thecalibrationcurvesof16benzimidazolesexhibitedgoodlinearityoveraconcentrationrangefrom0.025to1.0mg/L,withcorrelationcoefficientsabove0.99.Theaveragerecoveriesfor16benzimidazolesinmeatandlivertissuesfromthreedifferentanimalspeciesrangedfrom81.6%to110%atspikelevelsof10,50μg/mLand100μg/mL,andtherelativestandarddeviationswerebetween1.8%and13.1%（n=10.Thelimitofquantificationwas10μg/kg.Thismethodissensitive,reproducibleandsuitableforthedeterminationofbenzimidazolesinanimaltissue.Keywords:
highperformanceliquidchromatography;animaltissue;benzimidazoles
中图分类号:
O657.72文献标识码:
A文章编号:
1002-6630（201102-0231-06
收稿日期:
2010-03-05
作者简介:
林海丹（1972—,女,高级工程师,硕士,主要从事食品中兽药残留和食品添加剂检测研究。
:
苯并咪唑类药物（benzimidazoles是一种驱虫药,对线虫、绦虫、吸虫都具有强的驱杀作用,在兽医临床上应有广泛。
苯并咪唑类药物的结构中均含有苯环和咪唑的C-4和C-5稠合而成的双环体系。
在苯并咪唑母核的C-2和C-5位置含有不同的取代基衍生出具有驱虫作用的药物。
根据C-2位取代基的不同将苯并咪唑类药物分为噻苯咪唑类和氨基甲酸酯两类。
常用的苯并咪唑类药
物包括阿苯咪唑、奥芬达唑、芬苯达唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、噻苯咪唑和丙氧苯咪唑。
由于一些苯并咪唑类药物及其代谢物在动物和靶动物安全评价实验中表现出致畸和致突变的作用,许多苯并咪唑类药物在体内很快代谢,一些代谢物,如亚砜化物、羟化产物等仍具有胚胎毒性,因此许多国家已将苯并咪唑类药物和其代谢物同时作为监控对象。
美国、日本等国家和组织
2011,Vol.32,No.02食品科学※分析检测232
都将苯并咪唑类药物列入限制使用的兽药药物中,并制订出各种苯并咪唑类驱虫药物（包括其某些代谢物在不同动物体内（包括肌肉、组织等的最高残留限量MRL,在不同的动物和不同的组织中最大残留限量从10μg/kg到5mg/kg不等,大多数限量是100μg/kg。
欧盟和我国规定阿苯达唑的残留标识物是阿苯达唑以及其代谢物阿苯达唑-2-氨基砜、阿苯达唑亚砜和阿苯达唑砜;奥芬达唑、芬苯达唑的残留标识物是它们的代谢物奥芬达唑砜;氟苯咪唑的残留标识物事其代谢物是2-氨基氟苯咪唑;甲苯咪唑的残留标识物是其等效物;丙氧苯咪唑的残留标识物是其原形;噻苯咪唑的残留标识物是噻苯咪唑及其代谢物5-羟基噻苯咪唑。
目前,国内外报道的动物组织中苯并咪唑类药物残留分析的方法主要涉及有高效液相色谱和液相色谱串联质谱法[1-10]。
国内的研究主要以原药为目标物,有关代谢物的研究多数只涉及一两种组分的分析方法。
Balizs[11]报道了15种苯并咪唑类药物及其代谢物的LC-MS/MS方法,但其大多数目标物的回收率偏低。
本研究旨在建立目前我国有规定最大残留量的16种苯并咪唑类药物及其代谢物多残留的液相色谱方法,对16种苯并咪唑类药物残留分析的提取方法、净化方法和色谱条件进行系统的研究,为动物组织中该类药物的残留监控提供了可靠的技术支持。
1材料与方法
1.1材料与试剂
动物组织送检样品。
甲醇、乙腈（HPLC级美国Tedia公司;正己烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基甲酰胺（DMF、氢氧化钾、盐酸、浓氨水（25%~28%、乙酸铵、无水硫酸钠（均为分析纯广州分析试剂厂;2,6-二叔丁基对甲酚（BHT,纯度99%德国Sigma公司;Mill-Q超纯水。
标准品:
奥芬达唑（Oxfendazole,CAS号53716-50-0、芬苯达唑（Fenbendazole,CAS号43210-67-9、阿苯达唑（albendazole,CAS号54965-21-8、阿苯达唑-2-氨基砜（Albendazole-2-aminosulfone,CAS号80983-34-2、阿苯达唑亚砜（Albendazolesulfoxide,CAS号54029-12-8、阿苯达唑砜（Albendazolesulfone,CAS号75184-71-3、甲苯咪唑（Mebendazole,CAS号31431-39-7、丙氧苯咪唑（Oxibendazole,CAS号20559-55-1、噻苯咪唑（Thiabendazole,CAS号148-79-8、5-羟基噻苯咪唑（Thiabendazole-5-hydroxy,CAS号948-71-0、噻苯咪唑酯（Cambendazole,CAS号26097-80-3、氟苯咪唑（Flubendazole,CAS号31430-15-6德国Dr.Ehrenstofer公司;氨基甲苯咪唑（Mebendazole-amine,CAS号52329-60-9、羟基甲苯咪唑（5-Hydroxymebendazole,CAS号60254-95-7、2-氨基氟苯咪唑（2-Aminoflubendazole,CAS号82050-13-3德国Witega公司;奥芬达唑砜（Oxfendazolesulfone,CAS号54029-20-8英国EdinburghPharmaceuticalProcesses公司;标准品含量均在98%以上。
1.2仪器与设备
高效液相色谱系统（配有Waters515泵,717自动进样器,2487双通道紫外检测器及Empower色谱工作站美国Waters公司;T25匀浆机、MS3涡旋振荡器德国IKA公司;3-16PK离心机德国Sigma公司;Labrota4003减压旋转蒸发仪德国Heidolph公司;Mill-Q超纯水器美国Millipore公司。
标准品用乙腈-水（2:
8,V/V配成适当浓度的混合标准工作溶液。
1.3样品前处理
称取5g样品,于50mL离心管中,加入20mL乙酸乙酯、0.15mL50g/100mL氢氧化钾溶液和1mL1g/100mLBHT溶液置超声波水浴中振荡5min,加入1g无水硫酸钠,均质器上匀质提取30s,4000r/min离心5min,清液转移至100mL梨形瓶中;另取一离心管,加入20mL乙酸乙酯、0.15mL50g/100mL氢氧化钾溶液和1mL1g/100mLBHT溶液洗涤均质器刀头;用玻棒捣碎离心管中的沉淀,加入上述洗涤均质器刀头的洗刀头液溶液,在涡漩振荡器上振荡2min,置超声波水浴中振荡5min,4000r/min离心5min,清液合并至100mL梨形瓶中,38℃减压旋转蒸发至干。
上述残渣立即用1.5mL乙腈溶解,涡旋混匀,超声5min,加入1.5mL0.1mol/L盐酸,涡旋混匀,转移到15mL离心管,加5mL正己烷洗涤梨形瓶,合并转移到离心管中,涡旋混匀,4000r/min离心5min,弃上层正己烷层,加入3mL正己烷重复操作一次。
脱脂后的样液加入3mL0.1mol/L盐酸,涡旋混匀,注入已预先用处理的5mL甲醇活化、5mL0.1mol/L盐酸平衡MCX固相萃取柱,依次用5mL0.1mol/L盐酸、5mL甲醇淋洗,15mL浓氨水-乙腈（1:
9,V/V溶液洗脱,洗脱液38℃减压旋转蒸发至干,残渣加入0.5mL乙腈,置超声波水浴中振荡2min溶解残渣,加入1.5mL0.025mol/L乙酸铵涡旋混匀,过0.45μm有机滤膜,供液相色谱测定。
1.4色谱条件
色谱柱:
DiscoveryC18柱（250mm×4.6mm,5μm;流动相:
乙腈-0.025mol/L乙酸铵,梯度洗脱;乙腈:
20%~55%（30min内线性增加,55%保持2min,55%~20%（0.1min内线性递减,20%保持8min;流速:
1.0mL/min;柱温:
35℃;进样量:
40μL;检测波长:
292nm。
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2结果与分析
2.1提取条件的优化
2.1.1提取溶液的优化
苯并咪唑类药物（BZs分子基本上是中等极性分子,其水溶度很小,考虑到乙酸乙酯和二氯甲烷的极性与BZs接近,对BZs溶解能力较强,分别对乙酸乙酯、二氯甲烷提取BZs的提取效率进行实验。
实验表明二氯甲烷提取BZs,回收率低于50%;乙酸乙酯的提取效率较理想。
BZs是弱碱性化合物,pH值对具有弱碱性的物质的溶解性或分配系数影响很大,调节pH值使待测组分在水相中处于中性分子状态,或达到两性分子的等电点,水溶性降低,易被有机溶剂萃取。
基于以上原理考虑用碱性乙酸乙酯提取BZs,实验表明回收率有较大提高。
因此确定碱性乙酸乙酯作为提取溶液。
2.1.2提取溶液pH值的优化
考察碱性乙酸乙酯的提取效率。
分别以20mL乙酸乙酯不加碱液、加0.5mL50g/100mLKOH、0.2mL50g/100mLKOH、0.4mL50g/100mLKOH作对比实验考察提取溶剂pH值对苯并咪唑药物在动物组织中的提取效率,实验结果表明提取溶剂pH值对阿苯哒唑、丙氧苯咪唑的提取效率无明显影响,随着pH值增大,其他苯并咪唑药物的提取效率提高,但pH值太高（较高碱液浓度,0.4mL50g/100mLKOH时,噻苯咪唑酯、芬苯达唑、氟苯咪唑、甲苯咪唑、奥芬达唑砜、噻苯咪唑、5-羟基噻苯咪唑提取效率下降一半,阿苯达唑-2-氨基砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜的提取回收率下降至10%以下。
综合考虑选择提取溶剂每20mL乙酸乙酯加入0.15mL50g/100mL的氢氧化钾。
2.1.3抗氧化剂对提取效率的影响
部分苯并咪唑类药物在样品前处理过程中易发生氧化反应而致损失,实验在样品提取中加入抗氧化剂以保护分析物,分别考察不同质量浓度的BHT溶液,实验结果表明加入1g/100mLBHT可明显提高奥芬达唑、奥芬达唑砜、阿苯达唑亚砜、阿苯达唑砜的提取效率,对噻苯咪唑、甲苯咪唑的回收率也有好的影响。
2.2净化条件的优化
样品用碱性乙酸乙酯提取,由于乙酸乙酯属于中等极性溶剂,有可能提取出类脂物,因此提取浓缩后需去除类脂物。
采用乙腈-正己烷液液分配脱脂。
乙腈与正己烷有一些互溶性,会产生轻度乳化,考虑加水以增加乙腈相比重,避免乳化现象,兼顾到苯并咪唑类药物的弱碱性,其在酸性溶液中溶解度大,因此最后采用乙腈-0.1mol/LHCl-正己烷液液分配脱脂。
单纯的液液分配法很难确保色谱分析时不出现基质干扰。
固相萃取是一项样品前处理的新技术。
考虑到BZs的弱碱性,选择WatersOasisMCX固相萃取柱进行实验,该固相萃取柱为阳离子交换-反相吸附剂,对碱性物质有高选择性,获得本底更干净的提取物。
兼顾到动物样品成分复杂,特别是动物肝脏样品,为防止样品过载导致回收率下降,选用大体积高容量的150mg/6cc的MCX柱。
对固定萃取柱的活化、样品上柱、洗涤和洗脱条件进一步实验。
以0.1mol/L盐酸溶液稀释样品液,使分析组分带正电荷而被固相萃取柱保留。
洗涤是除去不需要的组分或杂质,经筛选实验确定以5mL0.1mol/L盐酸溶液和5mL甲醇溶液作为洗涤溶剂除去干扰物而苯并咪唑药物仍有高回收率。
调节洗脱溶剂pH值为碱性以使苯并咪唑类药物保持非离子状态或反离子状态不被保留从而从柱子上洗脱下来。
采用氨水-乙腈溶液作为洗脱溶剂。
实验中依次增加氨水含量的乙腈溶剂体系进行洗脱实验,实验结果表明采用浓氨水-乙腈溶液（1:
9,V/V为洗脱溶液可使苯并咪唑类药物充分洗脱,同时浓氨水-乙腈溶液（1:
9,V/V洗脱液的体积淋洗实验,结果表明大于12mL时可以淋洗完全。
最后选择15mL浓氨水-乙腈溶液（1:
9,V/V作为洗脱溶剂。
2.3色谱条件的优化
1.5-羟基噻苯咪唑;2.阿苯达唑-2-氨基砜;3.阿苯达唑亚砜;4.噻苯咪唑;5.阿苯达唑砜;6.奥芬达唑;7.氨基甲苯咪唑;8.羟基甲苯咪唑;9.2-氨基氟苯咪唑;10.噻苯咪唑酯;11.奥芬达唑砜;12.丙氧苯咪唑;13.甲苯咪唑;14.氟苯咪唑;15.阿苯达唑;16.芬苯达唑。
图116种苯并咪唑类药物标准的液相色谱图
Fig.1HPLCchromatogramsof16bemzimidolesstandards0.004
0.002
0.000
1
A
U
时间/min
0510********
23
4
5
6
7
8
9
101113
12
1415
16
对于残留分析,由于各组分性质有别,为得到适宜的保留值和最佳峰形需采用梯度洗脱。
BZs属有机碱化合物,水溶性极小。
反相HPLC分析时硅胶基键合相表面残余的酸性硅醇基能强烈吸附BZs,导致保留时间过长、峰拖尾或变形。
为降低游离硅醇基的二次吸附作用和增加Bzs在流动相中的溶解性,需采用调节pH（离子增强法和较高的比例的有机溶剂等方法优化流动相。
经筛选采用离子增强流动相体系,以乙腈-0.025mol/L乙酸铵溶液进行梯度洗脱,分别考察CloversilC18、OR
2011,Vol.32,No.02
食品科学
※分析检测
234名称线性方程相关系数名称线性方程相关系数5-羟基噻苯咪唑y=1.30×105
x-288
0.99982-氨基氟苯达唑y=7.38×104
x-177
0.9999阿苯达唑-2-氨基砜y=1.47×105x-241
0.9998噻苯咪唑酯y=1.08×105
x-316
0.9999阿苯达唑亚砜y=1.42×105x-2020.9998奥砜达唑砜y=1.23×105x-2950.9998噻苯达唑y=2.49×105
x-788
0.9998丙氧苯咪唑y=5.49×104
x-157
0.9999阿苯达唑砜y=1.30×105x-221
0.9998甲苯咪唑y=1.14×105
x-418
0.9999奥砜达唑y=1.41×105x-275
0.9998氟苯咪唑y=9.19×104
x-386
0.9999氨基甲苯咪唑y=8.62×104x-3060.9999阿苯达唑y=7.85×104x-3860.9999羟基甲苯咪唑
y=1.45×105
x-273
0.9998
芬苯达唑
y=1.22×105x-955
0.9999
表116种苯并咪唑类药物的线性方程和相关系数
Table1Linearequationsandcorrelationcoefficientof16benzimidazoles
名称加入量/猪肉猪肝鸡肉鸡肝牛肉牛肝（μg/kg回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%回收率/%RDS/%5-羟基噻苯咪唑
5092.94.991.16.289.34.092.37.192.75.287.14.910095.61.988.86.493.22.592.310.789.75.186.15.11095.36.798.54.081.57.491.26.094.96.696.26.8阿苯达唑-2-氨基砜
5099.34.390.05.187.24.588.36.499.45.31013.11001071.894.86.296.75.397.04.096.65.897.55.31096.29.71023.5966.298.46.71105.790.38.0阿苯达唑亚砜
501014.896.85.391.75.191.96.61015.898.22.11001093.21014.999.55.696.94.599.56.297.03.91097.712.196.86.511010.81065.11055.394.04.8噻苯达唑
501025.11025.097.02.998.45.81025.195.94.01001073.11054.61026.81022.599.06.798.64.21092.16.289.26.298.39.391.24.699.85.590.07.5阿苯达唑砜
5099.24.095.86.0984.294.97.397.24.193.14.51001053.099.26.21036.096.14.496.38.196.13.61098.28.61002.995.75.31024.21007.296.25.9奥砜达唑
501013.595.55.693.64.094.17.098.95.095.53.71001062.61015.799.59.896.93.998.27.595.85.41089.89.095.47.983.57.298.312.596.09.383.96.1氨基甲苯咪唑
5093.94.889.66.5914.094.38.695.23.589.14.9100103392.15.499.98.898.15.397.54.790.27.61096.78.191.16.71006.196.53.61014.51002.9羟基甲苯咪唑
5098.86.092.66.699.44.796.64.996.63.493.23.91001052.595.37.51028.496.23.898.13.194.45.81099.51183.64.985.38.693.64.899.36.688.65.42-氨基氟苯达唑
5097.77.392.35.892.63.889.86.393.85.486.57.81001023.992.14.396.26.193.93.292.94.790.65.91099.18.389.07.296.83.198.59.81044.294.25.1噻苯咪唑酯
5098.45.199.95.599.03.21025.296.97.393.54.21001052.31034.91018.41062.496.85.191.67.21097.9
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