姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响.docx

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姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响

姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响

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　　【摘要】目的:

观察姜黄素对肿瘤坏死因子?

α（TNF?

α）引起的血管内皮细胞分泌单核细胞趋化因子?

1（MCP?

1）的影响.方法：

采用原代培养方法获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC），随机分为对照组、TNF?

α刺激组和TNF?

α＋姜黄素组.先用TNF?

α刺激血管内皮细胞，再加入不同浓度的姜黄素（,,25,50和100mg/L）共同孵育1h与单纯TNF?

α刺激作对照，采用MTT法、ELISA法和RT?

PCR法检测姜黄素对细胞及其上清液中MCP?

1蛋白表达的影响.结果:

HUVEC经TNF?

α刺激后，其MCP?

1表达为±，与对照组±相比明显增强（P<）；再与不同浓度姜黄素共同孵育1h后，MCP?

1在细胞中的表达分别为：

±,±,±和±，与单纯给予TNF?

α刺激相比明显减弱（P<），且随着浓度升高有递增的趋势.结论:

姜黄素通过抑制炎症因子MCP?

1的表达调节血管内皮细胞的炎症反应，从而发挥保护血管内皮细胞，防止动脉粥样硬化的作用.

　　0引言

　　研究表明，单核细胞的趋化主要由单核细胞趋化蛋白?

1（MCP?

1）来实现,多种物质及细胞因子都可以诱导MCP?

1的表达［1］.肿瘤坏死因子?

α通过诱导内皮细胞而产生MCP?

1,吸引单核细胞迁入动脉内膜而参与动脉粥样硬化的发生和发展.中药姜黄的有效成分姜黄素具有抗炎、抗动脉粥样硬化的作用，但目前的研究主要围绕其对脂质过氧化的抑制及对细胞间黏附分子?

1、血管细胞黏附分子?

1和P?

选择素等炎性因子的表达的抑制作用等方面［2-3］,而对血管内皮细胞中MCP?

1表达影响的研究尚少见报道.本实验通过在离体状态下以肿瘤坏死因子?

α为诱导因子，观察姜黄素对MCP?

1的影响，旨在进一步阐明其保护内皮细胞，抗动脉粥样硬化的作用机制.

　　1材料和方法

　　材料新生儿脐带由第四军医大学唐都医院妇产科提供；倒置显微镜（日本Olympas公司）；M199培养基、胰蛋白酶和Ⅰ型胶原酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；姜黄素，TNF?

α（美国Sigma公司）；噻唑蓝（北京华美公司）；兔抗人MCP?

1mAb，ELISA试剂盒（北京中山试剂公司）；Ⅷ因子多克隆抗体（武汉博士德公司）；RT?

PCR试剂盒（大连宝生物有限公司）；PCR所用引物由上海生工公司合成.

　　方法

　　人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养及鉴定无菌条件下，取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带约30cm，用PBS反复冲洗脐静脉至无血水流出，止血钳夹住脐带一端，注入/LⅠ型胶原酶10mL后夹住另一端，在50mL/LCO2孵育箱中消化30min后收集消化液，1000r/min离心8min后收集细胞，加入含80g/L胎牛血清的M199培养液，接种于25mL培养瓶中，在37℃，50mL/LCO2孵育箱中待细胞生长至融合状态用/L胰蛋白酶和/L乙二胺四乙酸混合液消化传代，实验采用第3代细胞，采用SP免疫组织化学染色法［3］检测人第Ⅷ因子相关抗原.

　　噻唑蓝（MTT）法观察姜黄素对内皮细胞的作用将对数生长期的细胞按密度为×104/L接种于96孔板中，每孔加100μL细胞悬液，当细胞贴壁后进行药物干预并在37℃，50mL/LCO2孵箱中继续培养.实验分为对照组：

M199培养液；TNF?

α刺激组：

M199培养液中加入终浓度为10μg/L的TNF?

α；TNF?

α＋姜黄素刺激组：

先加入浓度为10μg/L的TNF?

α孵育细胞，再分别加入终浓度为,,25,50和100mg/L的姜黄素,各组均在37℃条件下孵育1h，每组设4个复孔.实验终止前每孔加入MTT10μL继续培养4h，终止培养.吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜100μL，振荡10min,置酶联免疫检测仪上测定570nm波长处的A值，计算细胞增殖抑制率.计算公式：

细胞生长抑制率（％）＝（1-试验组A值/对照组A值）×100％

　　姜黄素对内皮细胞中MCP?

1表达的影响

　　法检测实验分组同主要步骤:

在含有兔抗人MCP?

1mAb包被的酶标板上,分别加入MCP?

1500,250,125，，，,和0ng/L标准品和1∶4稀释的待测细胞上清液各,37℃孵育1h；洗板后每孔加入辣根过氧化物酶标记的工作液,37℃孵育1h；清洗后加入邻苯二胺底物液,置暗处反应10min,每孔加入终止液终止显色反应.在酶联免疫检测仪上492nm波长处测各孔A值,每组6个样本,每个样本均设定复孔.

　　半定量RT?

PCR检测实验分组同按Trizol法提取细胞总RNA.逆转录合成cDNA，MCP?

1基因引物：

上游5′CTCATAGCAGCCACCTTCAT3′（20bp），下游5′TCACAGCTTCTTTGGGACAC3′（20bp）；β?

αctin引物：

上游5′gggACCTgACTAACTACCTC3′，下游5′CAgTgATCTCCTTCTgCATC3′；PCR扩增条件：

94℃温育2min，94℃变性45s，57℃复性45s，72℃延伸1min，共35个循环，末次循环72℃延伸10min.反应结束后15g/L琼脂糖凝胶电泳后测灰度值.用目的基因与β?

actin基因扩增片段的灰度值之比计算表达水平.

　　统计学处理：

实验数据均以x±s表示,采用统计软件进行方差处理，采用LSD法进行检验,P＜为差异具有统计学意义.

　　2结果

　　的鉴定相差显微镜下观察细胞大部分贴壁，呈单层扁平梭形相互嵌合或多角形细胞集落，排列呈“铺路石”样（图1A）.经SP染色法后镜下可见细胞胞质丰富，并呈棕黄色染色颗粒，为阳性反应，证实细胞来源于HUVEC细胞（图1B）.

　　A：

倒置显微镜下×100;B：

倒置显微镜下经Ⅷ因子染色×20.

　　图1原代培养的HUVEC细胞及鉴定（略）

　　黄素对TNF?

α损伤后内皮细胞的影响MTT检测显示,TNF?

α刺激组中细胞的抑制率为（±）%,明显高于对照组（16±）%，（P<）；TNF?

α＋姜黄素（,25,50和100mg/L）各浓度组抑制率分别为（±）%,（21±）%,（±）%和（±）%,与TNF?

α刺激组相比较内皮细胞的损伤明显减轻（P<）.

　　姜黄素对TNF?

α损伤状态下内皮细胞MCP?

1表达的影响

　　姜黄素对MCP?

1蛋白表达的影响细胞经TNF?

α刺激后与对照组（±）相比，MCP?

1表达明显增加（±，P<）；HUVEC细胞先经TNF?

α刺激后再加入,25,50和100mg/L不同浓度姜黄素继续作用1h后，与对照组相比较，可明显抑制TNF?

α介导的MCP?

1表达（±,±,±,±,P<）且呈现出浓度依赖趋势，但与对照组相比在低浓度时仍明显增高，说明姜黄素有部分逆转TNF?

α对细胞的损伤作用.

　　黄素对MCP?

1mRNA表达水平的影响HUVEC细胞经不同浓度姜黄素和TNF?

α分别干预后β?

actin基因的表达产物几乎保持不变，但目的基因表达产物在TNF?

α组中明显增多，在姜黄素组中随着浓度的升高逐渐减少（图2）.计算结果显示，TNF?

α刺激组（±）与对照组（±）相比较MCP?

1表达水平明显升高（P<）；而TNF?

α+姜黄素（,25,50和100mg/L）各浓度组与对照组相比MCP?

1表达水平虽仍有升高，但较TNF?

α刺激组明显降低（±,±,±，±，P<）.

　　M：

markerDL2000；1：

对照组；2：

TNF?

α刺激组；3～7：

依次为姜黄素,,25,50和100mg/L不同浓度组.

　　图2各组MCP?

1mRNA表达RT?

PCR扩增产物电泳结果（略）

　　3讨论

　　姜黄素为姜科姜黄属植物姜黄的主要有效成分，本实验以内皮细胞损伤为基础，从MCP?

1的角度，在分子水平继续探讨姜黄素保护内皮细胞的机制［4］.MCP?

1作为一种趋化因子,在致炎因子TNF?

α作用下可诱导其表达［5］，MCP?

1表达升高后可引起单核细胞和内皮细胞表达黏附分子、促进炎症因子的释放，从而介导血管内皮细胞的损伤［6］，不仅能够促进单核细胞在粥样斑块处的浸润,而且能促进血管壁平滑肌细胞的增殖,对动脉粥样硬化的形成起到重要的作用［8］.目前，可抑制细胞中MCP?

1高表达的药物主要有胰岛素、噻唑烷二酮衍生物、二甲双胍、血管紧张素转移酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物等［9］，而传统中药姜黄素与它们相比则具有毒副作用小，使用安全的优点.

　　本实验结果显示，常规培养的HUVEC细胞能分泌少量MCP?

1，在TNF?

α（10μg/L）刺激后，MCP?

1分泌显著增加（±）%，与文献报道一致［7-8］，当用不同浓度的姜黄素作用于损伤细胞后，与TNF?

α刺激组相比能明显下调MCP?

1mRNA的水平（P<）；同时ELISA法也显示，当姜黄素浓度达到100mg/L时，MCP?

1蛋白表达为±,与TNF?

α刺激组±比较,差异具有统计学意义（P<），并且随着姜黄素浓度的升高这种保护作用逐渐增强.我们的实验结果表明姜黄素可以抑制MCP?

1的表达，且具有浓度依赖趋势.因此，我们认为姜黄素抑制MCP?

1的部分机制是从MCP?

1转录水平上实现的，姜黄素所致的MCP?

1mRNA表达下调可减少TNF?

α对HUVEC细胞造成的损伤.核转录因子?

kB（NF?

kB）可能是介导MCP?

1表达和产生的最重要核转录因子，MCP?

1表达增加常与NF?

κB的活化相关［10］.而姜黄素是否也通过直接或间接阻断NF?

kB的信号传导途径，抑制其活化，进一步减少MCP?

1的表达，从而起到保护血管内皮的作用还有待更深入的研究.

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