姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响.docx

1、姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响姜黄素对肿瘤坏死因子诱导单核细胞趋化蛋白的影响各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢【摘要】目的:观察姜黄素对肿瘤坏死因子?（TNF?）引起的血管内皮细胞分泌单核细胞趋化因子?1(MCP?1)的影响.方法：采用原代培养方法获得人脐静脉内皮细胞（HUVEC），随机分为对照组、TNF?刺激组和TNF?姜黄素组.先用TNF?刺激血管内皮细胞，再加入不同浓度的姜黄素(,25,50和100mg/L)共同孵育1h与单纯TNF?刺激作对照，采用MTT法、ELISA法和RT?PCR法检测姜黄素对细胞及其上清液中MCP?1蛋白表达的影响.结果:HUV

2、EC经TNF?刺激后，其MCP?1表达为，与对照组相比明显增强（P）；再与不同浓度姜黄素共同孵育1h后，MCP?1在细胞中的表达分别为：,和，与单纯给予TNF?刺激相比明显减弱（P），且随着浓度升高有递增的趋势.结论:姜黄素通过抑制炎症因子MCP?1的表达调节血管内皮细胞的炎症反应，从而发挥保护血管内皮细胞，防止动脉粥样硬化的作用.0引言研究表明，单核细胞的趋化主要由单核细胞趋化蛋白?1（MCP?1）来实现,多种物质及细胞因子都可以诱导MCP?1的表达1.肿瘤坏死因子?通过诱导内皮细胞而产生MCP?1,吸引单核细胞迁入动脉内膜而参与动脉粥样硬化的发生和发展.中药姜黄的有效成分姜黄素具有抗炎、抗

3、动脉粥样硬化的作用，但目前的研究主要围绕其对脂质过氧化的抑制及对细胞间黏附分子?1、血管细胞黏附分子?1和P?选择素等炎性因子的表达的抑制作用等方面2-3,而对血管内皮细胞中MCP?1表达影响的研究尚少见报道.本实验通过在离体状态下以肿瘤坏死因子?为诱导因子，观察姜黄素对MCP?1的影响，旨在进一步阐明其保护内皮细胞，抗动脉粥样硬化的作用机制.1材料和方法材料新生儿脐带由第四军医大学唐都医院妇产科提供；倒置显微镜（日本Olympas公司）；M199培养基、胰蛋白酶和型胶原酶（美国Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青生物公司）；姜黄素，TNF?（美国Sigma公司）；噻唑蓝（北京华美公司）；兔

4、抗人MCP?1mAb，ELISA试剂盒（北京中山试剂公司）；因子多克隆抗体（武汉博士德公司）；RT?PCR试剂盒（大连宝生物有限公司）；PCR所用引物由上海生工公司合成.方法人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的培养及鉴定无菌条件下，取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带约30cm，用PBS反复冲洗脐静脉至无血水流出，止血钳夹住脐带一端，注入/L型胶原酶10mL后夹住另一端，在50mL/LCO2孵育箱中消化30min后收集消化液，1000r/min离心8min后收集细胞，加入含80g/L胎牛血清的M199培养液，接种于25mL培养瓶中，在37，50mL/LCO2孵育箱中待细胞生长至融合状态用/L胰蛋白酶和/

5、L乙二胺四乙酸混合液消化传代，实验采用第3代细胞，采用SP免疫组织化学染色法3检测人第因子相关抗原.噻唑蓝（MTT）法观察姜黄素对内皮细胞的作用将对数生长期的细胞按密度为104/L接种于96孔板中，每孔加100L细胞悬液，当细胞贴壁后进行药物干预并在37，50mL/LCO2孵箱中继续培养.实验分为对照组：M199培养液；TNF?刺激组：M199培养液中加入终浓度为10g/L的TNF?；TNF?姜黄素刺激组：先加入浓度为10g/L的TNF?孵育细胞，再分别加入终浓度为,25,50和100mg/L的姜黄素,各组均在37条件下孵育1h，每组设4个复孔.实验终止前每孔加入MTT10L继续培养4h，终止

6、培养.吸弃培养液，每孔加入二甲基亚砜100L，振荡10min,置酶联免疫检测仪上测定570nm波长处的A值，计算细胞增殖抑制率.计算公式：细胞生长抑制率（）（1-试验组A值/对照组A值）100姜黄素对内皮细胞中MCP?1表达的影响法检测实验分组同主要步骤:在含有兔抗人MCP?1mAb包被的酶标板上,分别加入MCP?1500,250,125，,和0ng/L标准品和14稀释的待测细胞上清液各,37孵育1h；洗板后每孔加入辣根过氧化物酶标记的工作液,37孵育1h；清洗后加入邻苯二胺底物液,置暗处反应10min,每孔加入终止液终止显色反应.在酶联免疫检测仪上492nm波长处测各孔A值,每组6个样本,每

7、个样本均设定复孔.半定量RT?PCR检测实验分组同按Trizol法提取细胞总RNA.逆转录合成cDNA，MCP?1基因引物：上游5CTCATAGCAGCCACCTTCAT3(20bp)，下游5TCACAGCTTCTTTGGGACAC3(20bp)；?ctin引物：上游5gggACCTgACTAACTACCTC3，下游5CAgTgATCTCCTTCTgCATC3；PCR扩增条件：94温育2min，94变性45s，57复性45s，72延伸1min，共35个循环，末次循环72延伸10min.反应结束后15g/L琼脂糖凝胶电泳后测灰度值.用目的基因与?actin基因扩增片段的灰度值之比计算表达水平.统

8、计学处理：实验数据均以xs表示,采用统计软件进行方差处理，采用LSD法进行检验,P为差异具有统计学意义.2结果的鉴定相差显微镜下观察细胞大部分贴壁，呈单层扁平梭形相互嵌合或多角形细胞集落，排列呈“铺路石”样（图1A）.经SP染色法后镜下可见细胞胞质丰富，并呈棕黄色染色颗粒，为阳性反应，证实细胞来源于HUVEC细胞（图1B）.A：倒置显微镜下100;B：倒置显微镜下经因子染色20.图1原代培养的HUVEC细胞及鉴定（略）黄素对TNF?损伤后内皮细胞的影响MTT检测显示,TNF?刺激组中细胞的抑制率为（）%,明显高于对照组（16）%，(P）；TNF?姜黄素（,25,50和100mg/L）各浓度组抑

9、制率分别为（）%,（21）%,（）%和（）%,与TNF?刺激组相比较内皮细胞的损伤明显减轻（P）.姜黄素对TNF?损伤状态下内皮细胞MCP?1表达的影响姜黄素对MCP?1蛋白表达的影响细胞经TNF?刺激后与对照组（）相比，MCP?1表达明显增加（，P）；HUVEC细胞先经TNF?刺激后再加入,25,50和100mg/L不同浓度姜黄素继续作用1h后，与对照组相比较，可明显抑制TNF?介导的MCP?1表达（,P）且呈现出浓度依赖趋势，但与对照组相比在低浓度时仍明显增高，说明姜黄素有部分逆转TNF?对细胞的损伤作用.黄素对MCP?1mRNA表达水平的影响HUVEC细胞经不同浓度姜黄素和TNF?分别干

10、预后?actin基因的表达产物几乎保持不变，但目的基因表达产物在TNF?组中明显增多，在姜黄素组中随着浓度的升高逐渐减少（图2）.计算结果显示，TNF?刺激组（）与对照组（）相比较MCP?1表达水平明显升高（P）；而TNF?+姜黄素（,25,50和100mg/L）各浓度组与对照组相比MCP?1表达水平虽仍有升高，但较TNF?刺激组明显降低（,，P）.M：markerDL2000；1：对照组；2：TNF?刺激组；37：依次为姜黄素,25,50和100mg/L不同浓度组.图2各组MCP?1mRNA表达RT?PCR扩增产物电泳结果（略）3讨论姜黄素为姜科姜黄属植物姜黄的主要有效成分，本实验以内皮细胞

11、损伤为基础，从MCP?1的角度，在分子水平继续探讨姜黄素保护内皮细胞的机制4.MCP?1作为一种趋化因子,在致炎因子TNF?作用下可诱导其表达5，MCP?1表达升高后可引起单核细胞和内皮细胞表达黏附分子、促进炎症因子的释放，从而介导血管内皮细胞的损伤6，不仅能够促进单核细胞在粥样斑块处的浸润,而且能促进血管壁平滑肌细胞的增殖,对动脉粥样硬化的形成起到重要的作用8.目前，可抑制细胞中MCP?1高表达的药物主要有胰岛素、噻唑烷二酮衍生物、二甲双胍、血管紧张素转移酶抑制剂和血管紧张素受体拮抗剂、他汀类药物等9，而传统中药姜黄素与它们相比则具有毒副作用小，使用安全的优点.本实验结果显示，常规培养的HU

12、VEC细胞能分泌少量MCP?1，在TNF?（10g/L）刺激后，MCP?1分泌显著增加（）%，与文献报道一致7-8，当用不同浓度的姜黄素作用于损伤细胞后，与TNF?刺激组相比能明显下调MCP?1mRNA的水平（P）；同时ELISA法也显示，当姜黄素浓度达到100mg/L时，MCP?1蛋白表达为,与TNF?刺激组比较,差异具有统计学意义（P），并且随着姜黄素浓度的升高这种保护作用逐渐增强.我们的实验结果表明姜黄素可以抑制MCP?1的表达，且具有浓度依赖趋势.因此，我们认为姜黄素抑制MCP?1的部分机制是从MCP?1转录水平上实现的，姜黄素所致的MCP?1mRNA表达下调可减少TNF?对HUVEC细胞造成的损伤.核转录因子?kB（NF?kB）可能是介导MCP?1表达和产生的最重要核转录因子，MCP?1表达增加常与NF?B的活化相关10.而姜黄素是否也通过直接或间接阻断NF?kB的信号传导途径，抑制其活化，进一步减少MCP?1的表达，从而起到保护血管内皮的作用还有待更深入的研究.各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢