淀粉降解菌的分离与筛选实验与总结.doc

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第一章绪论

1.1简介

1.1.1淀粉

淀粉是葡萄糖的高聚体，通式是（C6H10O5）n，水解到二糖阶段为麦芽糖，化学式是（C12H22O11），完全水解后得到葡萄糖，化学式是（C6H12O6）。

淀粉有直链淀粉和支链淀粉两类。

淀粉是植物体中贮存的养分，贮存在种子和块茎中，各类植物中的淀粉含量都较高。

淀粉可分为直链淀粉（糖淀粉）和支链淀粉（胶淀粉）。

前者为无分支的螺旋结构；后者以24~30个葡萄糖残基以α-1,4-糖苷键首尾相连而成，在支链处为α-1,6-糖苷键。

直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色。

这并非是淀粉与碘发生了化学反应（reaction），而是产生相互作用（interaction），而是淀粉螺旋中央空穴恰能容下碘分子，通过范德华力，两者形成一种蓝黑色错合物。

实验证明，单独的碘分子不能使淀粉变蓝，实际上使淀粉变蓝的是碘分子离子。

本实验的检测方式则利用了直链淀粉遇碘呈蓝色的特点。

1.1.2淀粉废水的产生

淀粉是一种重要的化工原料，广泛应用于食品、化工、纺织、造纸、医药等行业。

而在淀粉生产中会排放大量废水属高浓度有机废水，其COD浓度几千甚至上万，BOD浓度也有几千，SS量也较高。

如将废水直接排放，不仅是水资源的巨大浪费，而且将造成严重的环境污染。

因此，国内外学者都在力求研究出一种快速、高效、低能耗的淀粉废水处理工艺。

1.1.3淀粉废水的处理方式

对于淀粉废水的治理，由于其污染物浓度高，危害大的特点，所以普通的化学治理方法难以达到很好的治理效果。

目前对于淀粉废水的处理研究广泛采用生物治理方式，其技术方案大致包括厌氧生物处理法和好氧生物处理法。

1.2国内外的研究进展

续前面所提到的厌氧生物处理法和好氧生物处理法，下面笔者将简单介绍两种方式的应用特点。

（1）厌氧生物法

厌氧法处理淀粉废水，其最终产物是以甲烷为主的可燃气体，可作为能源回收利用；剩余污泥量少且易于脱水浓缩，可作为肥料使用；处理工艺运转费用低。

在当前能源日益紧张的形势下，该方法作为一种低能耗，可回收资源的处理工艺日益受到世界各国的重视。

近年来，厌氧发酵法处理淀粉废水主要有升流式厌氧污泥床（UASB）、厌氧流化床（AFB）、厌氧接触法（ACP）、两相厌氧消化法（TPAD）和厌氧滤池（AF）等。

（2）好氧生物法

同厌氧生物法相比，好氧生物处理法具有处理能力强、出水水质好、占地少的优点，因此被当前各国广泛应用。

近几十年来，国内外对好氧生物处理法的净化机理和曝气原理进行了大量的实验研究，使好氧生物处理法在设计和运行方面有了很大的改进和革新，特别是在处理高浓度有机废水方面，取得了一定的成果。

但与厌氧法相比，好氧生物法在处理淀粉加工废水方面有许多不足之处，例如需要充氧、动力消耗大、无能量回收、微生物所需营养多和污泥量大等适合处理低浓度的有机废水。

而淀粉废水的COD一般较大，所以在淀粉废水的处理中单独应用的较少，主要是活性污泥法、接触氧化法、生物氧化塘法和SBR法。

在淀粉加工废水的处理中，好氧生物处理一般用作后续处理。

1.3实验目的与意义

1.3.1实验目的

（1）.掌握微生物分离和筛选的基本方法及技术

（2）.巩固微生物实验操作的能力

1.3.2实验意义

淀粉废水中的污染物浓度高，危害大，普通的化学治理方法又难以达到很好的治理效果，如果任其肆意泛滥，势必影响到生态环境和人民的身体健康，长远来看这更会影响到我国人口、经济、社会、资源、环境等各方面的可持续发展。

由此，淀粉废水问题俨然成为了一个大问题，如此对其治理也更加是任重而道远。

目前对于淀粉废水的处理研究广泛采用生物治理方式，但多种方案都有一定的欠缺之处，一直没有一个完善合理的办法来解决淀粉废水的问题。

所以我们有必要去深入学习并领悟对其处理的方案及过程。

微生物方法对环境污染的治理有着十分重要的作用及非常可观的前景，所以对于每一个环境工程专业的同学接触同微生物分离与筛选有关的实验都是有重要价值，无论是对于理论的理解，对专业的认识，还是对实践的把握都是有着深刻意义的。

第2章实验的材料与方法

2.1实验材料

2.1.1实验仪器

500ml烧杯*1，500ml锥形瓶*1，250ml锥形瓶*1，培养皿*10，试管*5，1ml移液管*1，10ml移液管*1，酒精灯*1，加热套*1，棉塞，棉绳，报纸若干。

2.1.2实验药品

活性污泥，（NH4）2SO45g，KH2PO45g，淀粉5g，蛋白胨1.5g，牛肉膏3g，琼脂8g，蒸馏水400ml，（盐酸，氢氧化钠适量）

2.2实验方法

2.2.1实验原理

淀粉酶能使淀粉分解成葡萄糖，而淀粉与碘液发生反应形成蓝色化合物，葡萄糖不与碘液发生反应形成蓝色化合物。

能分泌淀粉酶的菌落能在周围形成淀粉圈，从而通过碘液即可筛选出淀粉酶产生菌。

在活性污泥中的微生物通过初筛、复筛等过程可以达到分离的目的。

初筛是对所得的纯种进行检测。

由于淀粉酶是胞外酶，在分离培养基中加适量可溶淀粉通过平板透明圈法来检测淀粉酶产生菌。

筛选透明圈比值大的菌株接种到培养基中进行培养。

2.2.2实验步骤

1.固体淀粉培养基（周二）

固体培养基（NH4）2SO45g，KH2PO45g，淀粉5g，蛋白胨1.5g，牛肉膏3g，琼脂8g，蒸馏水400ml，pH7.0—7.5放于烧杯在加热套上加热，待瓶中颗粒完全融化后停止加热并倒入锥形瓶（500ml）然后用棉塞塞住瓶口，再用棉绳系好。

试管、培养皿、移液管、锥形瓶一同高压蒸汽灭菌。

2.培养（周三）

取5支试管（无菌），用移液管（无菌）吸取1mL活性污泥放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀后即为10-1，再用无菌移液管吸取10-1的菌悬液1mL放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀即为l0-2稀释液，照此方法分别制成l0-3～l0-5的稀释液。

将10-1～10-5稀释液1mL涂布于平板培养基表面。

用对应的移液管按浓度顺序依低到高分别往培养皿中各加1ml菌液，并标注对应的标签为10-1～10-5，在无菌条件下往各个培养皿中加入加热后适当温度的培养液，置于37℃的恒温培养箱中培养24h（可适当延长）。

3.初筛（周四）

制作两个平板，在长出的菌落中，找出独立菌株并滴加碘液，挑取有淀粉水解圈的单菌落，在两个平板进行划线并培养24h（37℃）（时间可调整）。

4.复筛（周五）

两个平板初筛菌株在同一块平板上分别划线培养，培养72h（37℃）（时间可调整）。

5.精筛（周一）

用滴加碘液的方式挑选出最佳菌株

6.菌种鉴定（周二）

最后通过观察筛选到的菌株的菌落大小、形态，颜色及革兰氏染色等情况对筛选到的菌株进行初步鉴定。

（以上内容为原定步骤，在实际操作中由于条件变化情况，个别细节会有所改动，下文将说明）

第3章实验过程与结果

3.1实验过程

按照试验设计步骤的大方向进行试验，个别细节有所改变，具体过程及试验时间如下：

（1）配置固体淀粉培养基（周二）

固体培养基（NH4）2SO45g，KH2PO45g，淀粉5g，蛋白胨1.5g，牛肉膏3g，琼脂8g，蒸馏水400ml，pH7.0—7.5放于烧杯在加热套上加热，待瓶中颗粒完全融化后停止加热并倒入锥形瓶（500ml）然后用棉塞塞住瓶口，再用棉绳系好。

试管、培养皿、移液管、锥形瓶一同高压蒸汽灭菌。

（2）培养（周三）

取5支试管（无菌），用移液管（无菌）吸取1mL活性污泥放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀后即为10-1，再用无菌移液管吸取10-1的菌悬液1mL放入装有9.0mL无菌水的试管中吹吸数次混匀即为l0-2稀释液，照此方法分别制成l0-3～l0-5的稀释液。

将10-1～10-5稀释液1mL涂布于平板培养基表面。

用对应的移液管按浓度顺序依低到高分别往培养皿中各加1ml菌液，并标注对应的标签为10-1～10-5，在无菌条件下往各个培养皿中加入加热后适当温度的培养液，置于37℃的恒温培养箱中培养48h。

培养24h后取培养基进行观察，并无明显菌落生成。

（3）初筛（周五）

经48h培养后已经有较多菌株生成，通过滴加碘液选取几株长势较好，水解圈较大的菌株（图一）

制作两个平板，在长出的菌落中，滴加碘液选取的菌株挑取出来，在两个平板进行划线并在37℃的恒温箱中培养72h。

（5）复筛（周一）

选取两个平板中经初筛后长势较好的菌株（图二）在同一块平板上分别划线，在37℃的恒温箱中培养24h。

3.2实验结果

菌种鉴定（周二）

最后通过革兰氏染色对筛选到的菌株进行鉴定。

染色后的显微观察图（图三）

最终观察发现该菌落为白色湿润，易挑取。

革兰氏染色后的显微观察为红色杆状菌体。

结论

经过此次实验，本组同学成功地筛选和分离出了一株淀粉降解菌，即在淀粉培养基内的该菌株附近有明显的水解圈，且经碘液检测水解圈内的淀粉已经水解。

同时本组采用的方法有简便、易行、快速的优点。

通过对整个环境处理方式的观察，废水处理工艺技术越来越向着多种技术组合为一体的新技术、新工艺发展，将其他物理、化学法同生物法相结合的综合手段往往具有效率高，运行好等诸多优点。

可以看出，环境废水处理正朝着综合、系统、高科技的方向发展，不仅对于淀粉废水，甚至对于整个工业的发展都是是必不可少的配套技术，其意义十分深远。

但是，对废水的治理毕竟还只是一种被动的环境保护手段，不能从根本上解决环境和生产之间的矛盾，所以在淀粉产品开发及生产过程中，应尽量优化原料的使用和加工的手段，从污染源头削减产污量，使废消除在生产过程中，最终实现环境、经济、效益的统一。

个人体会与建议

以下是本人对实验操作过程中出现问题的思考总结：

1.固体培养基配方中琼脂的成分偏低，造成培养基凝固性差，给划线培养增加了较大的难度。

2.没有设置关于降解菌对淀粉降解能力测定的实验环节，未能取得有说服力的实验数据。

3.实验操作水平不高，影响实验效率。

4.理论知识及实验经验缺乏，不能准确预计菌落生长所需的时间。

个人体会

本次实验我们以小组的形式进行了从活性污泥中分离和筛选出具有特定功能的环境微生物，对其功能进行了初步的鉴定，及观察菌落形态、染色并镜检对其进行菌种鉴定的过程。

这是一个综合的技术训练，通过这次训练，让我对环境微生物的作用的理解更为加深了，而且更加深刻的明白了实践与理论相结合的重要性。

建议

如果条件允许希望可以优化实验设施，改善实验条件

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