浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解.docx
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浅谈对实时荧光定量PCR技术的理解
实时荧光定量PCR（RealtimefluorescencequantitativePCR，RT-qPCR）是一种实时监控DNA扩增反应的技术。
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累进行实时监测整个PCR过程，并将DNA的累积速率绘制成动态变化图，在扩增的指数期对起始模板进行定量，从而消除了在测定终端产物丰度时有较大变异系数的问题。
该项技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，促使PCR技术从定性到定量的飞跃，而且集特异性强、自动化程度高、灵敏度好、污染少等优点为一体，现已在生物研究、医药、食品等领域得到广泛应用。
1RT-qPCR的基本原理和应用
1.1基本原理
RT-qPCR的分类方法根据其化学原理可分为探针类和非探针类两种,下面以TaqMan探针类和SYBRGreenⅠ非探针类两种常见方法简述其原理。
1.1.1TaqMan探针法
TaqMan探针是一种长度为20-24bp寡核苷酸探针，在其5′末端标记一个荧光报告基团（reporter,R），在3′末端则标记一个荧光淬灭基团。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入TaqMan荧光探针,其结合位点在两条引物之间,只与模板特异地结合。
当完整的探针与目标序列杂交时,荧光基团发射的荧光信号与3′端的淬灭剂接近而被淬灭。
但在进行延伸反应时,聚合酶的5′外切酶活性将探针进行酶切,将DNA探针逐个降解，使得荧光基团与淬灭剂分离。
这样PCR体系中荧光的强度与PCR产物量之间呈正比,可通过测定荧光强度而对PCR产物定量。
如下图1-1至图1-11所示为TaqMan探针工作原理简图：
荧光共振能量转移，FRET
能量
激发光
淬灭基团
激发光
图1 1切断的探针，检测到报告荧光
图1 2完整的探针，检测不到报告荧光
图1 3变性
图1 4退火
图1 5延伸
（1）
具有5′-3′外切酶活性
5′-3′外切酶活性
图1 6延伸
（2）
图1 7延伸（3）
图1 8延伸（4）
图1 9延伸（5）
报告基团和淬灭基团分离而发光
图1 10延伸（6）
图1 11延伸（7）
1.1.2SYBRGreenⅠ染料法
SYBRGreenⅠ荧光染料是一种非饱和菁类荧光素，可以嵌合于DNA双链的小沟区域，其最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号。
因此，根据荧光信号检测出PCR体系中存在的双链DNA数量。
如图1-12和图1-13为SYBRGreenⅠ工作原理简图:
图1 12SYBR染料处于游离状态
图1 13SYBR染料与双链DNA分子结合
1.1.3两种方法的优缺点
总而言之，探针类是利用与靶序列特异性结合的探针来指示扩增产物的增加，非探针类则是利用荧光染料或特殊设计的引物来指示扩增产物的增加。
前者由于增加了探针的识别步骤，特异性更高，但价格昂贵。
后者可以与所有的双链DNA相结合,因此设计的程序通用性好,且价格相对较低，更简便易行。
特别地，由于SYBRGreenI与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性。
可以通过测量升高温度后荧光的变化帮助降低非特异产物的影响，由解链曲线来分析产物的均一性有助于分析由SYBRGreenI得到的定量结果。
1.2RT-qPCR技术的主要应用
1.2.1医学领域
RT－qPCR技术目前应用最为广泛的是医学领域，包括病原体的检测，例如病毒、细菌、病原体的定量监测及治疗药效评价；基因的点突变及单核苷酸多态性（SNP）分析；临床疾病的诊断，如各型肝炎、艾滋病、禽流感、结核、性病诊断，肿瘤基因的检测和诊断等。
1.2.2植物中的应用
RT－qPCR技术是一种很好的检测基因表达的方法，通过RT－qPCR可以分析植物在不同处理条件下基因样本的表达差异，也可以分析植物在不同生长发育时期基因表达的差异。
该项技术的应用对植物病理学研究和植物遗传育种研究起到了推进作用。
1.2.3食品安全
应用RT－qPCR技术对食品中的微生物进行检测和研究，不仅可以对活体微生物核酸量进行检测，还可以对已死的生物进行检测。
该项技术的应用也使得转基因食品的检测突破了从定性到定量的界限。
1.2.4其他科学研究
此外，RT－qPCR技术在其他分子生物学相关定量研究领域的应用也取得了较大进展，如：
在动植物基因工程、微生物鉴定与分类、昆虫分类和鉴定中的应用及昆虫检疫等。
2一般实验步骤
在进行实时荧光定量PCR前，主要有RNA样品抽提、RNA质量检测、样品cDNA的合成，引物设计合成及其他药品购买，选择合适的荧光定量方法等。
在正式试验前需进行验证实验，以确定扩增效率（一般大于1.9为有效）、动力学范围，确保准确度、精密度。
接着需要做的有：
梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR、制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板、待测样品的待测基因实时定量PCR、电泳检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带及数据分析。
特别地，学院现有的7500型实时荧光定量PCR仪可同时实现特异性靶基因检测与定量。
7500型实时荧光定量PCR仪采用96孔反应板或单个及8联管，反应体积25-100ul。
该仪器将PCR热循环，荧光检测和各种应用分析软件结合在一起，可以动态观察PCR每一循环各反应管中PCR扩增产物逐渐增加的情况。
PCR实验结束后可以马上得到定量结果，无需凝胶电泳分析和PCR产物纯化。
3常见问题分析
3.1如何甄别可疑的扩增
根据电脑自动给出的标准曲线，确定样品所含的目的DNA初始量时，标准曲线的相关性应该不小于95%。
同一样品的3个平行反应所得出的Ct值之间的差值不应大于0.5。
甄别可疑扩增还可以通过这三方面来判别，看扩增曲线的形状，正确的扩增一般有明显扩增阶段（特别是指数增长期），所有的曲线有较好平行性。
查看Y轴的数值，“可疑”曲线的指数增长期范围常常是落在1e-2的范围内。
看线性图，曲线没有明显的上升趋势则提示不存在正确扩增。
3.2试验重复的问题
一般来说，为了减少加样以及实验系统的误差，每一次实验内包含两个生物学重复，即处理同样的东西两份，也有两个相应的对照。
所以一般直接取平均值，若出现一个数值偏差，则去除离群值，取剩下的两个值平均。
若三个值分散都太大，则说明实验操作可能存在问题，需要重新实验。
实验重复率低首先可以考虑是否加样出现问题，试剂混合均匀问题、出现泊松分布，或者反应体系过大、液体超出反应孔平面，没有使用ROX校准等。
3.3扩增曲线的斜率不一致
一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：
荧光背景信号阶段，荧光信号指数扩增阶段，线性扩增阶段和平台期。
只有在指数扩增期，PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，选择该阶段进行定量分析。
但如果在此阶段扩增曲线的斜率出现不一致，则提示可能样本不好，即可能存在乙醇、蛋白酶等抑制物。
可用分光光度计测量样品260/280比值，重新检测样品质量。
另外，也可以考虑是否是因为加样不准确，标准品出现降解、引物设计不好等问题。
3.4如何判断有无非特异性扩增
在染料法实时荧光定量时，可以根据溶解曲线进行分析是否存在特异性扩增。
如果出现单一峰且峰值在Tm值位置出现，证明没有非特异性扩增，且初始模板没有被污染；如果出现多个峰，估计是有非特异性扩增了或者初始模板被污染了。
出现非特异性扩增，可能的原因有：
样本污染、引物特异性不好、形成了引物二聚体、镁离子浓度过高等，根据可能出现的原因进行逐一排除分析，改变条件。
因退火温度引起的非特异性扩增，可以通过梯度PCR确定最佳退火温度。
另外，对于GC含量较高的片段，可以考虑加入适量二甲基亚砜（DMSO）提高DNA片段的特异性。
3.5荧光信号的读取
荧光信号的读取（PlateRead）是用来显示PCR产物的浓度的，一方面来看，如果定量过程中发现PCR未出现扩增，不仅仅应该考虑模板或实验操作的问题，还需把产物进行电泳看看是否有条带，以排除染料或探针的问题而导致的未读取信号。
另一方面，荧光信号的读取一般延伸步骤，但如果在该步读取荧光值总是出现非特征峰，可以考虑在后面加一步高温步骤（约80-85度）读取荧光值。
3.6荧光信号标准曲线的制作
一般仪器很难做到100拷贝以下的准确定量，一般用来做标准曲线的最小浓度为1000拷贝，以确保可靠性。
3.7其他问题
在实验中特别要注意实验的清洁，戴手套防止试剂污染。
另外，也要注意仪器使用的规范，严格按照操作流程使用。
先开电脑，待电脑完全启动后再开启定量PCR仪主机，等主机面板上的绿灯亮后即可打开定量PCR的收集软件，进行实验。
确认实验已经结束后，首先关闭信号收集软件，然后关掉定量PCR仪主机的电源，最后关闭电脑。
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