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参考文献References应用与环境生物学报

添加乙酸对干玉米秸秆与白菜废弃物混贮品质的影响*

任海伟,2孙安琪1马延琴1范文广1李志忠1**孙文斌1沈佳莉1刘菲菲1

1兰州理工大学生命科学与工程学院兰州730050

2甘肃省生物质能与太阳能互补供能系统重点实验室兰州730050

摘要为促进干秸秆的跨季节贮存及尾菜资源化利用，利用青贮原理将干玉米秸秆与白菜废弃物进行混合贮存发酵，探讨了不同添加量乙酸对二者混贮发酵品质的影响，并通过Miseq高通量测序技术解析发酵过程中的微生物多样性。

试验设置ME组（无乙酸添加）为对照组，AA组（添加量0.3%）和AB组（添加量0.6%）为2个乙酸处理组，18±1℃恒温密闭混贮60d，间隔30d分析其化学组分、发酵品质及微生物多样性。

结果表明，AA组贮存60d时的干物质（DM）、可溶性碳水化合物（WSC）和粗蛋白（CP）含量均显著高于ME组，酸性洗涤纤维（ADF）和酸性洗涤木质素（ADL）含量显著下降，半纤维素（HC）、纤维素（CL）和综纤维素（HOC）含量显著增加。

AB组在30d和60d时pH均显著低于ME组，乳酸含量在30d时显著增加，60d时显著降低。

AA组和AB组中乳酸/乙酸、乳酸/总有机酸及氨氮/总氮值均低于ME组。

混贮发酵期间ME组、AA组和AB组的门水平细菌主要为Proteobacteria和Firmicutes，属水平细菌包括Lactobacillus、Paralactobacillus、Enterobacter、Pediococcus、Flavobacterium、Chryseobacterium、Pedobacter、Sphingomonadaceae、Erwinia等，其中Lactobacillus、Paralactobacillus和Enterobacter为优势菌。

与ME组相比，AA组和AB组中腐败菌Enterobacter丰度呈下降趋势；2个乙酸处理组的总乳酸菌丰度高于ME组，但乳酸菌多样性较ME组有所减少，主要包括Lactobacillus、Paralactobacillus和Pediococcus等乳酸菌属。

总之，干玉米秸秆与白菜废弃物能以适宜比例混贮60d不变质，尽管添加乙酸后的乳酸发酵强度有所抑制，但低剂量乙酸更有助于保存DM、WSC、CP、HOC等有机组分，建议乙酸添加量为0.3%。

（图3，表5，参42）

关键词干玉米秸秆；白菜废弃物；乙酸；混贮；发酵品质；高通量测序

EffectsofdifferentdosesofaceticacidonmixedstoragequalityofdrycornstalkandChinesecabbagewaste*

RENHaiwei1,2,SUNAnqi1,MAYanqin1,FANWenguang1,LIZhizhong1**,SUNWenbin1,SHENJiali1&LIUFeifei1

1SchoolofLifeScienceandEngineering,LanzhouUniversityofTechnology,Lanzhou730050,China

2KeyLaboratoryofComplementaryEnergySystemofBiomassandSolarEnergy,Lanzhou730050,China

AbstractInordertorealizethetrans-seasonalstorageofdrymaizestraw（DMS）andutilizationofvegetablewastes,themixedairtightwet-storageofDMSandcabbagewaste（CW）wereimplementedat18±1℃for60daysbasedonthesilagetheory.Thedynamiceffectsofdifferentdosesofaceticacidonthestorageandfermentationqualitywereinvestigated,andthedynamicruleofmicrobialcommunitydiversityduringstoragewerealsoinvestigatedbyIlluminaMiSeqhigh-throughputsequencing.GroupME（withouttheadditionofaceticacid）,groupAA（theadditionofaceticacidwiththedosageof0.3%）andgroupAB（theadditionofaceticacidwiththedosageof0.6%）wereset,thechangesofthechemicalcomposition,fermentationqualityandmicrobialcommunitydiversitywereanalyzedfortheintervaloffor30days.Theexperimentalresultshowedthatthecontentsofdrymatter（DM）,watersolublecarbohydrates（WSC）andcrudeprotein（CP）weresignificantly（p<0.05）higherthanthoseingroupMEat60d,thecontentsofaciddetergentfiber（ADF）andaciddetergentlignin（ADL）weresignificantly（p<0.05）decreasedcomparedwithgroupME,thecontentsofhemicellulose（HC）,cellulose（CL）andholocellulose（HOC）ingroupAAweresignificantlyincreasedcomparedwithgroupME（p<0.05）.ThepHvalueingroupABwassignificantly（p<0.05）lowerthanthatofgroupMEat30dand60d,thecontentsoflacticacidwereincreasedsignificantly（p<0.05）at30d,andthendecreasedsignificantly（p<0.05）at60dcomparedwithgroupME.Asaresult,theratiooflacticacidandaceticacid（LA/AA）,theratiooflacticacidandtotalorganicacid（LA/TOA）andtheratioofammonianitrogenandtotalnitrogen（AN/TN）ingroupAAandABwerelowerthanthatofgroupME.ThedominantbacteriumcommunitiesinthreegroupswereProteobacteriaandFirmicutesatphylum.ThebacteriumcommunitiesatgenusincludingLactobacillus,Paralactobacillus,Enterobacter,Pediococcus,Flavobacterium,Chryseobacterium,Pedobacter,SphingomonadaceaeandErwinia,Furthermore,Lactobacillus,ParalactobacillusandEnterobacterweredominantbacteriumcommunities.TheabundanceofEnterobacterwasdemonstrateddecreasedtendencyduringmixedstorageperiod.TheabundanceoftotallacticacidbacteriaingroupAAandABwerehigherthanthatofgroupME,butthelacticacidbacteriadiversityingroupAAandABwerelowerthanthatofgroupME,andthemainlacticacidbacteriawereLactobacillus,ParalactobacillusandPediococcus.Inconclusion,DMSandCWwithoptimumproportioncanbemixedstoragebyensilingfermentationfor60dwithgoodquality,thestoragequalitywerefurtherimprovedbytheadditionofaceticacid,theadditionofaceticacidwiththedoseof0.3%canbeproposedandconducivetothepreservationoftheorganiccomponents,suchasDM,WSC,CPandHOC.

Keywordsdrymaizestraw（DMS）;cabbagewaste（CW）;aceticacid;mixedstorage;fermentationquality;high-throughputsequencing

玉米秸秆是我国资源量较为丰富的常见大宗农副产品，被广泛用于生产动物青贮饲料[1]、生物能源[2-3]、活性炭制备[4]等领域，但因其收获具有明显的季节性与时效性，如何将收集的玉米秸秆资源进行跨季节保质贮存始终是其规模化应用的主要限制因素。

另一方面，由于我国农耕条件和耕作习惯等因素，大多数玉米秸秆收获时已处于萎蔫或干黄状态，此时玉米秸秆中的水分和糖分等养分已大量损失，甚至高度纤维化，直接贮存不利于后期动物消化和能源转化。

研究表明，借鉴青贮原理将干黄秸秆与蔬菜废弃物[5-7]、马铃薯渣[8]、玉米浆[9]等高水分、高养分物料进行混合发酵，不仅能实现干秸秆的保质贮存，还能减少食品加工废弃物和尾菜的排放量。

据报道，秸秆青贮过程中加入适宜的添加剂能改善其发酵品质，其中有机酸是常用的青贮发酵抑制剂，能在发酵初期快速降低pH，有效抑制腐败菌生长。

张晓庆等[10]认为高添加量（6mL•kg-1）甲酸能显著降低pH值和氨态氮，得到品质优良的麻叶荨麻青贮饲料。

郭艳萍等[11]发现添加乙酸能显著提高高粱青贮饲料的乳酸含量，添加丙酸能显著降低青贮pH和氨态氮含量。

任海伟等[7]认为添加甲酸能使干玉米秸秆与莴笋叶的混贮pH快速下降，最大程度减少干物质损失，且显著降低木质纤维组分和氨氮/总氮含量，有利于增加乳酸含量从而改善发酵品质。

Schmidt等[12]也发现添加乙酸能有效降低玉米青贮饲料的pH，防止腐败变质。

鉴此，为了进一步改善干黄玉米秸秆的贮存效果，更好地保存营养物质，有必要通过添加剂青贮方式进一步优化干黄玉米秸秆与蔬菜废弃物的发酵过程，从而提高其转化利用效率[13]，但有关添加剂作用效果的研究报道较少。

秸秆青贮发酵本质上是乳酸菌等微生物菌群协同作用的动态生化变化过程，了解贮存过程中微生物菌群的多样性对其发酵品质调控至关重要。

目前研究青贮原料中微生物多样性方法主要有传统培养法、16SrRNA鉴定、PCR-DGGE技术、限制性片段长度多态性（RFLP）和高通量测序技术等，其中高通量测序能更全面准确描述微生物群落信息，被广泛用于土壤、海洋、肠道及极端生境的微生物研究，但在青贮领域的研究报道还相对较少。

陶莲等[14]用Miseq平台分析了玉米秸秆青贮前后的菌群变化，发现青贮后Firmicutes、Pediococcus和Lactobacillus的菌群丰度显著增加。

Ni等[15]用IlluminaMiSeqPE300平台分析了大豆青贮过程中的微生物群落变化。

胡宗福等[16]用Miseq平台研究了全株玉米青贮期间和暴露空气后的微生物群落变化。

Li等[17]通过MiSeqPE300发现加入微藻会影响五节芒青贮过程中的微生物菌群，优势乳酸菌由Enterococcus变为Lactobacillus，Enterococcus和Lactococcus其丰度明显下降。

为深度剖析玉米秸秆/蔬菜废弃物混贮发酵过程中的发酵品质变化和微生物菌群演绎，本文以干玉米秸秆和白菜废弃物为研究对象，从感官品质、化学组分、发酵产物构成模式等方面探讨了不同添加量乙酸对二者混贮发酵品质的动态变化影响，并利用MiSeq高通量测序技术分析微生物群落结构，以期筛选出适宜的乙酸添加量，为玉米秸秆/尾菜的混合贮存及资源化利用提供理论基础。

1材料与方法

1.1材料与试剂

干玉米秸秆（Driedmaizestraw,DMS）取自甘肃省定西市陇西县，摘穗后田间留置3个月，含水量10.23%，粉碎至0.5～1cm备用；白菜废弃物（Cabbagewaste,CW）收集自兰州市七里河区职工菜市场，含水量91.41%，切碎至2cm×2cm备用。

乙酸（Aceticacid）为普通市售化学纯。

DNA试剂盒（WaterDNAIsolationKit）购自成都福际生物技术有限公司。

表1干玉米秸秆和白菜废弃物原料中的有机组分含量

Table1Chemicalcompositionsofdriedmaizestraw（DMS）andcabbagewaste（CW）

原料materials

干物质

drymatter

（DM）/%FW

可溶性碳水化合物watersolublecarbohydrates

（WSC）/%DM

粗蛋白crudeprotein

（CP）/%DM

中性洗涤纤维neutraldetergentfiber

（NDF）/%DM

酸性洗涤纤维aciddetergentfiber

（ADF）/%DM

酸性洗涤木质素aciddetergentlignin

（ADL）/%DM

纤维素cellulose

（CL）

/%DM

半纤维素hemicellulose（HC）

/%DM

综纤维素holocellulose（HOC）/%DM

干玉米秸秆drymaizestraw（DMS）

89.77

8.05

7.32

76.47

46.53

7.56

38.99

29.97

68.94

白菜废弃物cabbagewaste（CW）

8.59

14.57

22.48

36.25

33.83

16.21

17.62

2.42

20.04

DM：

干物质；WSC：

可溶性碳水化合物；CP：

粗蛋白；NDF：

中性洗涤纤维；ADF：

酸性洗涤纤维；ADL：

酸性洗涤木质素；CL：

纤维素；HC：

半纤维素；HOC：

综纤维素；DMS：

干玉米秸秆；CW：

白菜废弃物。

DM:

drymatter;WSC:

watersolublecarbohydrates;CP:

crudeprotein;NDF:

neutraldetergentfiber;ADF:

aciddetergentfiber;ADL:

aciddetergentlignin;CL:

cellulose;HC:

hemicellulose;HOC:

holocellulose;DMS:

drymaizestraw;CW:

cabbagewaste.

1.2混合贮存发酵过程与试验设计

根据前期研究结果[6]，准确称取3.23kgDMS和9.87kgCW混合均匀，喷洒一定量事先调配好的乙酸溶液，使混贮体系水分含量为73%，对照组喷洒相同体积蒸馏水，填实密封后恒温（18±1℃）厌氧贮存60d，每30d动态分析其感官品质、化学组分、发酵品质和细菌多样性。

试验设置对照组和2个乙酸处理组，每组进行3个平行，对照组为无添加剂的DMS/CW混贮组（ME组），2个乙酸处理组分别为低剂量AA组（乙酸添加量为原料总质量0.3%）和高剂量AB组（乙酸添加量为原料总质量0.6%）[11]。

1.3混贮样品的取样与预处理

按照四分法称取3份有代表性的混贮样品20g，其中一份以1:

9比例加蒸馏水混合打浆，经4层纱布和定性滤纸过滤后3900r/min离心10min，离心后的上清液经抽滤得到浸提液，测定pH后-20℃冻存，用于测定乳酸、乙酸、丙酸、丁酸、乙醇和氨氮等小分子有机物。

另一份样品于105℃烘干至恒重，粉碎过40目筛，装袋封存，用于测定可溶性碳水化合物（WSC）、总氮（TN）以及酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤木质素（ADL）等木质纤维组分。

第三份样品于-20℃冻存，用于DNA提取和微生物菌群分析。

1.4细菌多样性研究

无菌环境下，将20g混贮样品与200mL无菌生理盐水混合，37℃恒温振荡2h制得菌悬液，再用孔径0.22μm无菌滤膜过滤得到微生物菌体。

将整张带有菌体的滤膜剪碎后置于2mL无菌离心管中，按照WaterDNAIsolationKit试剂盒方法提取总DNA，经2%琼脂糖凝胶电泳检测合格后送至上海派森诺生物科技有限公司进行IlluminaMiseq测序。

选择扩增区域16SrDNAv3-v4，设计正反向加上transposasesequences的引物，扩增得到带transposasesequences的PCR产物片段。

95℃3min,95℃30sec,60℃30sec,72℃30sec,25cycle,72℃10min。

目的PCR产物用0.8倍体积AMPureXPBeads纯化后，用P5+indexi5和P7+indexi7引物进行第二轮扩增，得到的PCR产物即带有P5/P7接头序列和双端index。

第二轮PCR产物用1倍体积AMPureXPBeads纯化后，用QubitdsDNAHSassaykit（Invitrogen，美国）进行荧光定量（Qubit2.0Fluorometer），多个样本等量混合成测序pool。

95℃3min,95℃30sec,55℃30sec,72℃30sec,8cycle,72℃10min。

取10ng的测序pool，用MiSeqReagentKitv3在IlluminaMiSeq中进行双向测序，得到2x300bp的数据。

下机数据预处理后进行生物信息学分析、多样性分析和物种组成分析。

选定相对丰度高于0.1%的细菌群落制作菌群微生态分布图，并从门水平和属水平进行微生物多样性分析[18]。

1.5分析方法

1.5.1化学成分分析DM测定采用105℃烘干恒重法；WSC测定采用蒽酮-硫酸比色法；NDF、ADF、ADL用F800纤维测定仪测定，CL、HC和HOC用公式CL=ADF－ADL，HC=NDF－ADF，HOC=CL+HC计算；总氮用K9840凯氏定氮仪测定。

1.5.2发酵品质分析pH测定采用丹佛UB-7型酸度计。

乳酸测定采用SBA-40X生物传感器。

氨氮采用苯酚-次氯酸比色法测定。

乙醇、乙酸、丙酸和丁酸等有机酸测定采用GC9790II气相色谱仪。

总有机酸（Totalorganicacid）包括乳酸、乙酸、丙酸和丁酸等小分子有机酸。

1.6数据分析

基础数据经Excel2010软件整理，利用SPSS20.0软件进行统计分析，结果用平均值±标准差表示，对不同处理组数据进行单因素方差分析，P<0.05代表数据存在显著性差异。

2结果与分析

2.1化学组分分析

2.1.1乙酸添加量对干物质（DM）、可溶性碳水化合物（WSC）和粗蛋白（CP）含量的影响由表2可以看出，与0d相比，ME组和AB组中DM含量随时间延长均呈下降趋势，而AA组则呈先下降后升高趋势。

与ME组相比，AB组在贮存期间的DM含量显著下降，而AA组在60d时DM含量显著高于ME组。

另一方面，随时间延长对照ME组和2个乙酸处理组中的WSC和CP含量均显著下降，AA组和AB组中WSC含量均显著高于ME组，并存在剂量效应。

贮存期间AA组中CP含量显著高于ME组，AB组中CP含量也未发生下降，且60d时显著高于ME组。

表2乙酸添加量对贮存过程中DM、WSC和CP含量变化的动态影响

Table2DynamiceffectsofaceticacidonthecontentofDM,WSCandCPduringstorage（%DM）

处理Treatment

贮存时间Time/d

干物质

drymatter（DM）/%

可溶性碳水化合物

watersolublecarbohydrates（WSC）/%

粗蛋白

crudeprotein（CP）/%

ME

0

28.83±0.01Aa

9.53±0.20Aa

10.75±0.26Aa

30

28.60±0.01Ba

1.94±0.05Bc

0.58±0.05Bb

60

28.38±0.01Cb

2.12±0.05Bc

0.41±0.05Bb

AA

0

28.83±0.01Ba

9.53±0.20Aa

10.75±0.26Aa

30

27.46±0.01Cb

3.74±0.19Cb

0.73±0.10Ba

60

31.56±0.01Aa

4.20±0.09Bb

0.67±0.05Ba

AB

0

28.83±0.01Aa

9.53±0.20Aa

10.75±0.26Aa

30

25.38±0.01Cc

5.35±0.14Ba

0.55±0.05Bb

60

26.07±0.01Bc

4.79±0.14Ca

0.70±0.09Ba

DM：

干物质；WSC：

可溶性碳水化合物；CP：

粗蛋白；ME：

无添加剂混贮组；AA：

低剂量乙酸组；AB：

高剂量乙酸组。

DM:

drymatter;WSC:

watersolublecarbohydrates;CP:

crudeprotein;ME:

mixedstorageofDMSandCWwithoutaddictive;AA:

mixedstorage