毕赤酵母表达知识归纳.docx
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毕赤酵母表达知识归纳
毕赤酵母表达知识归纳1
a.配制500×BIOTINstocksolution（0.02％）有这么3种方案：
1、懒人是将Biotin直接溶在去离子水中，放过夜，基本就能溶；
2、急性子是将溶液配成0.02N的NaOH，就很容易溶解了；
3、水浴加热，温度不能高于50度。
D－生物素是具有生物活性的生物素，也就是vitaminH。
在毕赤酵母代谢过程中，作为多种酶的辅基起作用。
天然培养基中一般可以不单独添加，因为YNB中、酵母粉、蛋白胨中均含有一定量的生物素，但是做高密度发酵还是必须要添加的。
b.有几个比较迷惑的问题请教大家：
（很典型的小问题）
1、制感受态细胞，OD多少比较好？
pyrimidine战友的方法：
取1mlGS115过夜培养物（OD约6-10）分装到1.5mlEP管中。
说明书还有一些文献是说在1.3左右效率高，再高了效率会很低
2、关于高效转化法，文献说用（LiAc），而invitrogen的说明书说转化毕赤酵母用（LiAc）没用，要用LiCl。
LithiumacetatedoesnotworkwithPichiapastoris.Useonlylithiumchloride.
3、YNB到底能高温灭么？
有的说能有的说不能。
过滤灭菌的怎么操作？
我是把滤器装好膜绑到瓶口用纱布盖上，报纸包上，瓶盖放烧杯里单灭。
然后把配好的溶液用注射器一点点推进去。
4、葡萄糖为什么在YPD里一起灭颜色很深，单灭则不会。
该115度还是121度灭？
网上搜了下，都有人用！
5、电转化参数用400欧还是200欧？
有的用400，有的还专门说不是用400。
都是从园里看到的！
电击参数：
1.5KV，25uF，200欧姆（不是400）
6、电转后，在MD平板上长的应该就是整合了目的基因的重组子了吧？
如果不想筛高拷贝的，是否PCR验证一下即可？
网友的回答：
ynb最好不灭菌，我是0.22um过滤处理的。
invitrogen手册上可以灭菌的。
glucose和含氮化合物在一起容易产生美拉德反应，这是配制培养基中的禁忌。
颜色很深的话，基本不能使用了。
想请教下关于菌种保存的方法。
我现在是采用斜面保存的方法，但感觉每次接菌都要打开斜面，而且每次的接菌量难免会有不少的误差，所以很想问一下大家都是怎么保存菌种的，特别是甘油菌的保存方法。
我一般吸取300ul的菌液到灭菌的ＥＰ管然后加等体积的甘油，混匀．防于－２０度．保存长的话最好放－８０度冰箱一般OD是2-6，过夜菌
在筛选高表达菌种中，我一般有一下步骤，很很多人做的不太一样，和说明书也有点差异，如下：
每次转化前，均用多种酶切，BlgII/salI/sacI同时切，然后转化时，用GS115/KM71/KM71H同时转化，转化的条件也和大家一样，即1.5/25/200但是我用的是0.1的杯子，不是0.2的，转化后涂MM及YPD+0.25G，长出菌落后，即进行大规模的表达试验，这里我要重点说明的是，我直接用YPD表达的，一般48h后即进行大量的SDS-PAGE鉴定，鉴定时，样品不用浓缩，直接上样，看到目的带后再做PCR，测序。
我已用这儿方法做了好几个基因出来。
关于酵母表达时BMMY的PH值
我也觉得PH7.0-7.5要比PH6.0好，我表达的两个蛋白都是这样，表达量要高一些。
但也不能一概而论，不同目标蛋白表达最适pH不一样，不过表达的pH值最好要远离目标蛋白的pI。
像目前国内外做的最好的rHSA，最适pH大概5-6左右，也有不同的报道，可能和工艺页有关系。
而我自己正在做的一个蛋白pH4较好，3、5表达时上清电泳目标带大量减少，杂带大量增多。
求助一下很棘手的问题，大家在酵母表达过程中控制目标蛋白降解方面有什么高招，小弟最近为这个有点儿焦头烂额。
我试过用酸消解酪蛋白，可是作用并不是很明显。
不知道兄台是胞内表达还是胞外表达，如果是分泌表达，目标蛋白确实容易被降解。
你可以尝试以下几种办法：
1、尽可能降低培养液的pH值减少酶活，酵母生长pH值比较广，4～7都可以试一下；2、多试几种蛋白添加剂，充当酶解底物；3、摸索最适下罐（摇瓶也一样），宁可少表达点也别给降解光了。
实在没办法，只好换菌株或做pcr突变酶切位点（当然不能影响表达和蛋白活性）。
SeveralstrategieshavebeenreportedaseffectiveinminimizingtheproteolyticinstabilityofspecificforeignproteinssecretedintotheP.pastorisculturemedium.
Thefirstisaddingtotheculturemediumofamino-acidrichsupplementsuchaspeptoneorcasaminoacid,whichreduceproductdegradationpossiblybyactingasexecesssubstratesforoneormoreproblemproteases.
ThesecondstrategytominimizeproteolyticdegradationistooptimizetheculturepHbetweenpH3.0andpH7.0.
Thethirdstrategyinvolveselevatingthelevelofammoniumintheculturebrothadequately,whichisexplainedbythehypothesisthatporteaseactivityisinducedundernitrogenstarvation.
Theforthstrategyislettheculturetemperature28deginsteadof30deg.
如何优化密码子来提高蛋白表达量，具体考虑哪些因素（肯定不是单纯的全部置换为使用频率高的密码子吧）看有些文献优化后的密码子有些都是使用频率不高的，实在很困惑.有没有做过这方面的，急切的想得到你的指导，收取一定的费用也可以。
谢谢了，我在上海。
密码子改造对提高表达量只有有限的作用。
影响外源蛋白在Pichia中表达水平的限速步骤（rate-limitingfactors）很多。
涉及到转录，翻译，蛋白在ER和Golgi的合成和折叠，以及分泌信号肽定位和切割，蛋白修饰等很多方面（H.Hohenblum,BiotechnologyandBioenginering,2004,85:
367-374）。
关键是根据你要表达的蛋白性质以及DNA序列特性来推测（！
）哪个步骤是关键的限速步骤。
实际上，很多分泌表达的蛋白，蛋白在ER中合成和折叠以及信号肽的切割是关键步骤。
现象是很多错误折叠的蛋白在胞内聚集和降解。
密码子作为限速步骤很多时候体现在某些蛋白由于高AT含量或者其他因素转录提前终止，这方面文献在NCBI上有一些。
毕赤酵母表达知识归纳2
我用Pichia酵母分泌表达两个不同的蛋白，结果WesternBlot的结果显示，两个蛋白均比理论分子量少了20k左右。
难道都是被发酵液中的蛋白酶降解了？
大家碰到过这样的情况吗？
如果是少了20K左右,肯定要考虑酶解的可能了.你的目的蛋白一级序列是否有Pichia酵母的Kex2酶降解位点.我现在做的蛋白就有这种情况,但是是降解产物和目的蛋白共存,有的蛋白幸免遇难
用BglII、SalI、SacI酶切的区别是什么？
我是想做蛋白表达，用BglII后转化行么？
它们三个是不是哪个可以用了？
BglII好像能把质粒切成两段，与其它两种线性化方法比较，较易生成muts型的转化子，当然比例也是少。
SalI、SacI酶切基本只能产生mut+型的转化子，我看文献介绍，后者的转化效率比前者要高。
我用前者线性化的，感受态也是用常规方法，没有DTTLiCl什么的，板子也是长得满满的。
哪位有毕赤酵母上罐的一些无机培养基配方能提供参考！
谢谢！
毕赤酵母表达知识归纳3
毕赤酵母基因组DNAPCR怎么也p不出来，
质粒和线性化后的质粒都能P出来，
但是电转化进入毕赤酵母GS115后怎么也p不出来，
不知怎么了？
以前做的都是小菜一碟呀，
那位战友有这方面的经验啊？
是不菌株有问题啊？
恳求指点一下！
非常感谢！
电转化后涂在MD平板上的么？
应该大部分都是阳性克隆，可能是你提基因组的方法有问题，
以前有战友介绍过菌落PCR的方法，我刚试过，效果非常非常好。
2.2kb的片段非常清楚。
退火温度我用的56度1min，72度2min，35个循环。
挑取单菌落均匀涂抹于管底，开盖在微波炉中档加热1min，-80℃5min，再加热一次，然后加入20ul水，取1ul作为PCR模板。
他本来说离心取上清为模板，我就直接取的。
非常非常好用，
一般的方法提基因组，比如煮冻煮法等，很难P出2.2kb的AOX1基因
而这个方法就能，还非常明显。
你翻一下前两页吧，我还把自己的图贴出来了。
选5‘aox和3’aox这两个引物，这样还能判断你的转化子是mut+或muts型的。
跑出两条来说明是mut+，其中一条2.2kb的就是aox1基因。
这里不涉及aox2，建议你去invitrogen网站下一本multicopypichiaexpressionmanual，看一遍就很清楚了。
MD平板上的阳性克隆应该比例很大的，我觉得3个就至少有一个是。
万事都没那么觉对的，在整合时，可能仅His4基因整合入了酵母基因组，所以也能生长，但无目的基因。
请教几个问题
1.鉴定重组时候，我煮冻煮方法获取酵母基因组作为模板，用目的基因的引物进行扩增，结果有些产物很强，有些很弱，为什么？
2。
是否存在这样情况，线性化载体进入酵母内，没有进入核内进行重组，或者进入核内，仅仅黏附在酵母基因组上，没有发生重组呢？
如果有这个情况，该如何区别？
3.用烧瓶摇菌的转速对表达有什么影响，听说过高转速使酵母总处于分裂增殖，而表达低？
4.大家大规模发酵的步骤是怎么样的，能提供一个方案吗？
关于PCR的问题，我觉得你的模板差异大吗？
我做很多次PCR鉴定，发觉模板量的差别对PCR的结果会有非常大的影响。
不过我做的PCR鉴定，基本上都是用AOX1引物P的，倒是没用过目的基因引物。
摇瓶的问题我也说不出来，因为我到目前为止都没做出分泌性表达来，汗啊……（都在胞内了）速度我都是按照Protocol上的推荐速度摇的，一般都是250rpm以上。
我做的时候使用蜗牛酶消化0.5h，然后沸水浴15min，12000g离心3min，取1ul做模板即可。
再问个有关GAP质粒表达的问题。
小量摇瓶表达的时候需要保证氧通量而使用双层纱布包住瓶口吗？
还是直接用牛皮纸包住就行了？
一般说来，小瓶发酵的时候只需要用牛皮纸包住瓶口就可以了，摇床的速度不要过快，那样会使得通气量不够，小瓶发酵时由于不添加消泡剂所以应该避免摇速过快而引起得泡沫。
泡沫得产生直接影响到通气的效果。
我们在做大规模发酵时才用纱布将发酵罐的饿通气口都包住，小瓶发酵，那么做得话，可能会导致污染，因为酵母是长得比较慢的。
这个想法可以阿
盐浓度对表达的影响
我想有个问题，缓冲液是起缓冲作用的，
浓度低了影响缓冲效果，浓度高了抑制菌生长？
可以做不同pH的比较试验，
再加上其他的因素，比如转速，所加培养基的量（通气量），甲醇量等
做个正交设计，学了统计，就是不会用阿，呵呵
pH和甲醇浓度我之前都有尝试过。
转速啥的没做过。
浓度也是偶然想到的，所以想尝试下。
我的目的基因序列中有一个AAAATT,不知道这个序列是否会影响我的目的蛋白的表达，心里没有谱，希望能有高手指点。
应该不会，现在鉴定出来的导致转录提前终止的序列只有HIVgp120蛋白上一段序列包含TTTTATA。
如果不怕麻烦，做一下Northern鉴定，或者直接突变掉一两个碱基。
酵母发酵两三天后有些菌体发红，是怎么回事啊
是突变还是真菌污染呢
我的最近也出现这样情况，是否真的是污染呢？
我的最近也出现这样情况，是否真的是污染呢？
个人认为是老化了
试过同一批转化的克隆，有些克隆在培养几天后就转粉红，但多数克隆没有转变，听说是培养的代数多了，酵母的某个酶发生突变
回纤夫兄：
你的目的基因是1.7kb，有没有加493bp左右的载体序列？
你有没有做一个空载体的转化？
应该是500bp左右，这样你的带也在2.2kb左右，呵呵
分不清了，可以用a-factor3‘aox来扩，这样好像增加196
pPIC9K：
9276bp
AOX1基因为2.2kb
以GS115基因组为模板，5’AOX1/3’AOX1为引物，将扩出2.2kb的AOX1基因。
以α-factor/3’AOX1为引物，将不能扩出任何片段。
以整合了pPIC9K的GS115基因组为模板，5’AOX1/3’AOX1为引物，将扩出2.2kb的AOX1基因以及pPIC9K载体上的493bp，以α-factor/3’AOX1为引物，将扩出pPIC9K载体上的196bp。
毕赤酵母表达知识归纳4
另外求助以下几个问题：
1、BCA法测酵母上清总蛋白含量（BMMY）可以么？
详细的见下面的帖子，请在此贴回复，谢谢。
BCA法测酵母上清蛋白浓度的问题
我做的时候是把上清稀释了20倍，然后才落在标准曲线范围内，
蛋白的量是6ug吧（标准曲线范围是0-10ug，是每孔的蛋白量，不是浓度）
那样，也就是说稀释20倍后的上清浓度是6ug除以20ul（96孔板测得，每孔加20ul样品）
未稀释的上清就是6ug/ul，每升就是6g，我的蛋白跑SDS-PAGE，占上清的80%，那我蛋白的量岂不达到克级了！
而通过SDS-PAGE判断，30多mg左右吧，这是怎么回事呢？
请问是否有干扰？
就是BMMY培养上清阿
添加了1%的酪蛋白氨基酸，会影响么？
2、用软件分析的SDS-PAGE光密度，是否与其蛋白浓度成正比？
如果一条带是另一个带的3倍，是否蛋白量就是它的3倍？
但我测其蛋白浓度，却相差不是很多？
3、电泳看到我的蛋白占上清的绝大多数，70%以上吧，但上亲和柱，流出液的吸收都在5000mAU，好像大部分都流出了阿，我流速1ml/min，柱子是5ml的，绝对没有过载，因为洗脱时可以看到，我的蛋白才从顶端下来，也就利用了1/10的柱子不到。
这是怎么回事呢？
是否也与BCA法测蛋白浓度达到g级有关呢？
我用Lowry法测定的BMMY培养基中总蛋白浓度约200－300mg/L，使用的是Sigma的试剂盒，不过没有加1％酪蛋白氨基酸，我看过的文献BMMY培养基上清总蛋白浓度一般这个范围。
BCA法应该也可以，但是6g/L的总蛋白浓度似乎太高，不过也有可能，因为1升培养基你加了10g酪蛋白氨基酸。
另外你绝对不能根据你所谓的SDS-PAGE的蛋白含量来计算你的蛋白表达量，实际值应该要小很多很多倍，酵母粉、蛋白胨和酪蛋白中那么多的蛋白降解片段和小肽等，电泳上是看不出来的，你过柱时光吸收值5000mAU，这就说明了5000mAU绝大部分是BMMY培养基中的杂蛋白。
感谢husiyi兄出来给我解答！
我也不知为什么BCA法测出来这么高，
我用TCA法将上清沉淀后，跑电泳，后来见蛋白质技术手册上说用TCA法沉淀上清能去除干扰物质，我就测了下TCA沉淀后的蛋白浓度，经过换算，是153mg/L。
TCA法应该不沉淀小肽吧？
我记得以前做空载体对照的诱导表达，好像沉淀不出东西。
那我该如何估算我目的蛋白的表达量呢？
我见过都是用SDS-PAGE分析目的蛋白占上清总蛋白的比例阿，然后根据上清总蛋白推算。
标准的方法该是什么样呢？
SDS-PAGE上显示不出小肽，显示的只是分泌的蛋白，这样的话推算也该比较准的吧？
我的GS115宿主放在-80°C冻存有两年多了，最近拿出来做了感受态做转化，用的是LiCl法，载体是pPIC9，按照推荐的量最后铺板，生长48h后RDB板上密密麻麻一层，设阴性对照同样也长了一层。
我觉得可能是GS115的组氨酸缺陷标记丢失了，于是用RDB＆RDBH板筛选（这两个板我没配错可以确定），结果挑了16个单菌落化版在RDB板上也均能生长，我不知道是不是全部冻存的GS115均已丢失标记，大家有遇到过这种情况嘛？
能给我一些建议？
我在两年前做过一批酵母转化，用此方法均很顺利的就挑出来阳性克隆，那个时候宿主是刚刚和别人讨来的应该是筛选过的。
其他试剂我都重新配过了应该没有问题。
组氨酸缺陷标记丢失不太可能
因为GS115菌株组氨酸基因本身就是整合在基因上组的
保种菌株搞混倒有可能，说不定是一个你以前的转化菌株
"原始单克隆菌重复生长"是这个意思:
单克隆菌摇起来再涂板的话,也会长出许多个,它们其实是一种,这对于以后筛选多拷贝重组子来说增加了无谓的困难。
sooow，你好！
你说的方法我看到了，正在尝试，只是煮了煮，没有液氮处理，扩了两次，可能是我挑菌后用无菌去离子水稀释的浓度不对，或是其它原因，还没有扩增出来，我会继续摸索条件的。
husiyi你说的方法在Invitrogen手册上是用96孔板，小孔液体培养的，我看过外文也有在电转化之后，将转化子直接涂不同G418浓度的YPDS平板（不是涂MD平板），我还没有试过这种方法，我现在是要筛选MD板上长出的HIS＋重组子，我觉得这个方法不合适，还是对"原始单克隆菌重复生长"有顾虑。
因为课题是以应用为主的，必须为后面的高产着想。
用极少量的菌涂YPD－G418板，浓度提高，我会尝试的。
谢谢你们
依我看过的文献和我们这边表达的至少十几个不同类型的蛋白来看
高拷贝对应高表达在99％的情况下是瞎扯，尤其对分泌表达的蛋白来说
决定蛋白分泌表达水平的一个重要因素是蛋白在胞内正确折叠和信号肽分泌处理过程，很多蛋白表达量太低基本上都是由于这个问题
酵母对二硫键的加工能力有一定局限性，所以二硫键含量较多的蛋白，以及一些很大的蛋白表达不是很好
我个人认为MD板结合G418－YPD板筛选的主要作用是利用两个标记进行“双保险”筛选，保证挑选的克隆基本是整合了目的基因的阳性克隆，但是不代表重组蛋白一定会有表达
毕赤酵母表达知识归纳5
影响蛋白分泌表达水平的因素有很多，如:
蛋白本身性质、基因剂量（拷贝数）、启动子类型、信号肽种类、细胞内蛋白折叠能力、蛋白降解以及培养条件、诱导起始菌体浓度、诱导时间等等。
这些从DNA、转录、翻译到翻译后加工水平的各种因素都可以说是蛋白高水平分泌表达的必要条件，不是充分条件。
在起始条件下，可能某一因素是限制条件，如基因剂量。
你提高了基因拷贝数，表达有所提高。
提高到一定水平，细胞内蛋白折叠能力又成为了限制因素。
加入分子伴侣提高了折叠能力，表达提高了，这时蛋白降解问题又出来了。
所以具体蛋白要具体分析。
能找到蛋白表达水平的特定限制因素那就是水平。
就单一强调某一因素而不结合具体表达目标情况，那都是片面的。
毕赤酵母表达系统现在研究的热点包括：
1寻找新的启动子、信号肽和筛选标志；
2蛋白折叠、聚合和降解；
3表达蛋白糖基化；
4表达全抗体、膜蛋白及富含二硫键蛋白；
5基础研究包括过氧化物酶体、基因组测序（已完成，正注释）。
哎！
我的问题解决了！
！
！
！
！
！
冷丙酮造成的盐共沉淀，不是蛋白沉淀！
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！
！
！
看来我的分泌表达量是太少了，做了半年了，哎！
！
！
！
我该如何优化表达条件，提高表达量呢？
？
我半年的工作时间呀！
！
！
！
！
！
我也碰到了类似问题。
请问，你如何知道是“冷丙酮造成的盐共沉淀”呢？
1.蛋白沉淀为絮状,盐沉淀呈片状晶体;
2.我用tca沉淀做了对照,沉淀两很少,在有丙酮不预热沉淀会很少,不过还是盐沉淀.
就是这样了!
Casaminoacid中文名叫什么呢？
能加热灭菌吗?
酸水解酪素，可以加热灭菌。
没有问题。
1、采用pyrimidine兄弟推荐的毕赤酵母高效转化实验方案,方法附后.果然每个MD板子上长了上千个克隆.但是洗涤菌体后,稀释200倍涂G418板子,在2~4mg的G418上都没有生长.相反,上次每个MD板子上只长了30个左右克隆,在在2~4mg的G418上都有生长.大家知道什么原因吗?
2、在G418板子上长出的克隆,大家都用什么办法,简捷而又准确地知道蛋白是否表达了呢?
是否PCR鉴定正确的克隆,都能表达呢?
1.对于能用抗体检测的表达产物,用westernblot法,可以直接检测电转化后MD板上生长出来的HIS+转化子,方法就是在BMMY平板上,覆上NC膜（无菌）,用牙签将菌落点到膜上,培养几天,期间往平板盖上补加甲醇,因为是倒置的,甲醇挥发可以补充培养里的甲醇消耗.到时取出NC膜,检测,通过显色圈位置与大小,就可初步判断是否表达与表达量的多少.
2.另外的情况,就是没有抗体可用的.遇到上千个重组子要筛选的话,真的很头疼,看到很多发表的文献上,用G418浓度梯度,从最小的0.25mg/mL,0.5mg/mL.....,4mg/mL.操作条件和检测效果真的有这么理想么?
?
?
假若1000个重组子里有一个是抗4mg/mL的多拷贝,其他都无抗性,这一个重组子也会增值,可能在每个浓度梯度的板上都会长,在4mg/mL的板上也可能会长出好多个,结果做花了这么多功夫,到底还是就那么一个.（这是推测了,但可能就是事实）
所以当你面对--几千--个MD板上长出的HIS+转化子时,是---喜悦还是苦恼呢?
!
（除了Invitrogen手册上,在96孔板里传3代,使每个转化子都达到相同的稀释外）,还有什么好方法能使每个转化子的浓度均一?
或有什么更简便有效的方法?
用G418浓度梯度,想把梯度放大,少做几板,有什么经验可以参考呀?
请教了
对于楼上的，我也有相同的困惑。
如果载体是pPIC9K,pPIC3K,这样转化出的重组子可以进行G418筛选，如果对于普通的载体转化的重组子除了进行营养型筛选，PCR鉴定目的片断已经整合到酵母基因组中，对于其是否表达，表达产物的量多少，大家有没有好点的方法啊？
对于楼上说的鉴定多拷贝的烦恼我也理解，
不过我觉得如果你的转化子很多的话，
也就说明你的转化率很高，
形成多拷贝的几率也越大，
我这几次做的时就是直接点到G4184mg/ml的平板上，
这样虽然费点事，
但是各个克隆还是独立的，
比较可靠！
G418筛选不能用点的方法，你会发现所有的克隆在高浓度平板上都会长。
应该是把MD板上的菌落全洗下来，稀释到一定浓度，然后涂板。
0.250.511.52mg/ml，我做了这几个浓度，每个浓度就是一个板，不是很多吧？
可以看到每个板长得菌落数是越来越少，长出来的时间也越来越长。
当然存在你从0.25板上取得可能是抗更高浓度的，可以通过杂交法准确确定拷贝数的，说明书上提到了。
但肯定不存在seventhcat说的那种情况，高拷贝生成的几率是非常低的。
电转化过程，生成了低拷贝的基
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