大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化.docx
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大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
集团标准化小组：
[VVOPPT-JOPP28-JPPTL98-LOPPNN]
大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
8.大肠杆菌表达系统与蛋白表达纯化
大肠杆菌表达系统遗传背景清楚，目的基因表达水平高，培养周期短，抗污染能力强等特点,是分子生物学研究和生物技术产业化发展进程中的重要工具。
因此熟练掌握并运用大肠杆菌表达系统的基本原理和常规操作是对每一个研究生来说是非常必要的。
本章节介绍了实验室常用的大肠杆菌表达系统的构成特点，归纳了利用大肠杆菌表达系统纯化重组蛋白的基本流程和详细操作步骤，并且结合笔者的操作经验，总结了初学者在操作过程中可能遇到的问题和解决策略。
8.1大肠杆菌表达系统的选择与构建
根据启动子的不同这些载体大致可以分为热诱导启动子，如λPL，cspA等和另外一类就是广泛使用的IPTG诱导的启动子，如lac，trc，tac，T5/lacoperator，T5/lacoperator等。
根据表达蛋白质的类型可分为单纯表达载体和融合表达载体。
融合表达是在目标蛋白的N端或C端添加特殊的序列，以提高蛋白的可溶性，促进蛋白的正确折叠，实现目的蛋白的快速亲和纯化，或者实现目标蛋白的表达定位。
常用的用于亲和纯化融合标签包括Poly-Arg，Poly-His,Strep-TagⅡ，S-tag，MBP等。
其中His-Tag和GST-Tag是目前使用最多的。
HisTag大多数是连续的六个His融合于目标蛋白的N端或C端，通过His与金属离子：
Cu2+>Fe2+>Zn2+>Ni2+的螯合作用而实现亲和纯化，其中Ni2+是目前使用最广泛的。
His标签具有较小的分子量，融合于目标蛋白的N端和C端不影响目标蛋白的活性，因此纯化过程中大多不需要去除。
目前常使用的表达载体主要是由Novagen提供的pET系列和Qiagen公司提供的pQE系列。
除了His标签外，还原性谷胱甘肽S-转移酶是另一种实验室常用的融合标签。
它可以通过还原性谷胱甘肽琼脂糖亲和层析而快速纯化。
此外，与His相比，GST很多时候能够促进目标蛋白的正确折叠，提高目标蛋白表达的可溶性，因此，对于那些用his标签表达易形成包涵体的蛋白，可以尝试用GST融合表达来改进。
当然，GST具有较大的分子量（26kDa），可能对目的蛋白的活性有影响，因此很多时候切除GST是必须的。
目前，GST融合表达系统主要是由GEHealthcare（原Amersham）提供。
重组质粒的构建一般选择遗传稳定，转化效率高，质粒产量高的菌株作为受体菌，常用的有E.coliDH5α，E.coliJM109，E.coliDH10B，E.coliNovaBlμe等recA–和endA–型细胞。
作为表达宿主菌必须具备几个基本特点：
遗传稳定，生长速度快，表达蛋白稳定。
具体操作过程中，根据所使用的表达载体的特点，目的基因密码子的组成等选择特定的表达宿主菌。
以下是实验室常用的几种表达宿主：
BL2：
lon和ompT蛋白酶缺陷型，避免了宿主对外源蛋白的降解。
是经典的使用最广泛的表达受体。
适用于Tac，Trc，Lac，λPL，cspA等作为启动子的载体。
BL21（DE3）：
DE3噬菌体溶源于BL21形成的带有染色体T7RNA聚合酶基因大肠杆菌。
IPTG诱导的lacΜV5启动子控制T7RNA聚合酶基因表达T7RNA聚合酶，进而控制T7表达系统表达目的蛋白。
BL21（DE3）衍生系列：
在经典的T7表达系统BL21（DE3）的基础上，Novagen公司开发了一些特殊的表达宿主细胞。
比如：
Origami（DE3），OrigamiB（DE3）和Rosetta-gami（DE3）菌株带有trxB和gor双突变。
拥有trxB和gor突变的菌株比单具，trxB突变的菌株更有可能促进二硫键的形成，使蛋白可溶性更好，活性更高。
Rosetta?
系列：
是经过修饰，专用于带有大肠杆菌稀有密码子的真核蛋白表达的菌株。
经提高稀有tRNA水平，可以提高一些真核基因表达效率（更多信息可参考相应公司的资料）。
BL21-CodonPlus系列：
包括BL21-CodonPlus?
（DE3）-RIPL，BL21-CodonPlμs?
-RIL，BL21-CodonPlμs?
（DE3）-RIL,BL21-CodonPlμs?
-RP，BL21-CodonPlus?
（DE3）-RP等。
这些受体菌添加了大肠杆菌中编码精氨酸（R），亮氨酸（L），异亮氨酸（I）和脯氨酸（P）稀有密码子的tRNA基因，更多用于表达一些真核生物的基因。
其中RIL系列常用于AT含量高的基因，而RP系列主要用于GC含量高的基因（更多信息参考Stratagene公司资料）。
M15/SG13009：
自身表达T5RNApolymerase，主要用于pQE系列载体的表达。
另一个需要考虑的是大肠杆菌的密码子及其偏爱性。
表1大肠杆菌密码子使用频率统计
T
AA
FRQ
C
AA
FRQ
A
AA
FRQ
G
AA
FRQ
T
TTT
F
19.7
TCT
S
5.7
TAT
Y
16.8
TGT
C
5.9
TTC
F
15
TCC
S
5.5
TAC
Y
14.6
TGC
C
8
TTA
L
15.2
TCA
S
7.8
TAA
stop
1.8
TGA
stop
1
TTG
L
11.9
TCG
S
8
TAG
stop
0
TGG
W
10.7
C
CTT
L
12
CCT
P
8.4
CAT
H
15.8
CGT
R
21.1
CTC
L
11
CCC
P
6.4
CAC
H
13.1
CGC
R
26
CTA
L
5.3
CCA
P
6.6
CAA
Q
12.1
CGA
R
4.3
CTG
L
46.9
CCG
P
26.7
CAG
Q
27.7
CGG
R
4.1
A
ATT
I
30.5
ACT
T
8
AAT
N
21.9
AGT
S
7.2
ATC
I
30.6
ACC
T
22.8
AAC
N
24.4
AGC
S
16.6
ATA
I
30.7
ACA
T
6.4
AAA
K
33.2
AGA
R
1.4
ATG
M
30.8
ACG
T
11.5
AAG
K
12.1
AGG
R
1.6
G
GTT
V
16.8
GCT
A
10.7
GAT
D
37.9
GGT
G
21.3
GTC
V
16.9
GCC
A
31.6
GAC
D
20.5
GGC
G
33.4
GTA
V
16.1
GCA
A
21.1
GAA
E
43.7
GGA
G
9.2
GTG
V
16.11
GCG
A
38.5
GAG
E
18.4
GGG
G
8.6
8.2表达条件的建立
为了方便后续的纯化操作,保持目标蛋白的活性,提高蛋白的得率，我们在进行蛋白的大量制备之前应该首先确定目标蛋白的最佳表达条件。
首先，保证表达蛋白稳定，尽量避免蛋白酶的降解，我们可以通过使用一些蛋白酶缺陷性的表达宿主，其次在表达的过程中可以在培养体系中添加一些蛋白酶抑制剂等来解决。
与实现外源蛋白的稳定表达相比，更多时候保证目标蛋白的可溶性表达，是建立表达条件的主要工作。
很多外源基因在大肠杆菌表达时很容易形成不可容的包涵体，其原因可能有：
表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体；蛋白合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对；过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。
目前对包涵体的形成和复性过程中发生聚集的机制尚不清楚,但已经报道了很多用于优化表达以增加目标蛋白可溶性的方法。
转化构建好的质粒至表达宿主感受细胞，挑取单克隆子至5ml含有相应抗性的LB培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600=0.5左右，加入IPTG至终浓度0.2mM，转移至28℃，200rpm继续诱导培养，可以在2h，4h，6h分别取样以分析表达状况。
将取出的1ml菌液12000rpm离心1min，收集菌体，加入1mlPBS缓冲液重悬沉淀，同样离心1min。
再加入300～500mlPBS重悬细胞。
超声破碎细胞（具体见操作细胞破碎）
将破碎液体4℃，12000rpm离心10min，分离上清和沉淀。
SDS-PAGE分析上清和沉淀的蛋白分布（具体操作参考SDS-PAGE）。
若在上清中有明显的目的蛋白的条带，即可以放大培养进而纯化目标蛋白。
若目标蛋白的表达主要分布于沉淀，则可以尝试一下几种方法来改善表达。
改变表达载体下手，像GST，NΜS，MBP,TrxA等融合标签能够提高很多蛋白在大肠杆菌中表达的可溶性，此外一些分泌标签如ompA,Pet-22b上的pelB也能够将目标蛋白运输至细胞的周质空间，从而提高目标蛋白的可溶性。
降低表达速度，可采取低温诱导，如15℃诱导过夜，或者采用弱启动子表达载体。
尝试一些特殊设计的表达宿主Origami：
thioredoxinredμctase/glμtathioneredμctase双突变适合带thioredoxinredμctase的融合表达载体，帮助形成更多的二硫键。
对于一些蛋白可能无法实现可溶性表达，这时候溶解包涵体后再纯化是唯一的解决办法。
大肠杆菌表达纯化外源蛋白，SDS-PAGE是必不可少的操作。
可以用来检测蛋白的表达情况（表达量，表达分布等），用来分析纯化的目的蛋白的纯度。
本小节列出SDS-PAGE操作中一些试剂的配置及其基本的操作过程。
（1）30%丙烯酰胺贮存液：
29g丙烯酰胺和1gN,N’-亚甲双丙烯酰胺溶于100ml热水中，验证其pH值不大于7.0。
置棕色瓶中，4℃保存。
丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可以通过皮肤吸收，其作用具累积性。
称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少量未聚合材料。
建议实验室划出专门的台面，设置单独的配置器皿进行SDS-PAGE的相关实验。
（2）1.5mol/LTris（pH8.8）溶液。
（3）10%SDS溶液：
SDS10.0g加入ddH2OToTo100。
（4）10%过硫酸铵：
新鲜配制。
（5）TEMED溶液：
4℃保存。
（6）1.0mol/LTris（pH6.8）溶液。
（7）2×样品溶解液：
2%SDS，5%巯基乙醇，10%甘油，0.02%溴酚蓝，0.01mol/LTris-HCl（pH8.0）缓冲液。
（8）5×Tris-甘氨酸电极缓冲液：
15.1gTris，94g甘氨酸和5gSDS定容到1000ml（建议每次电泳用新稀释的缓冲液）。
（9）考马斯亮蓝R染色液：
每100ml甲醇、水、冰乙酸混合物（9:
9:
2）中，溶解0.25g考马斯亮蓝R，搅拌溶解。
（10）脱色液：
10%冰醋酸（可加如乙醇，建议不要使用甲醇）。
1、凝胶制备
（1）安装洗涤干净的玻璃板、板条，并将玻璃板固定在电泳槽中。
（2）配制10%的分离胶（具体参考表2）：
迅速在两玻璃板间隙中灌注分离胶，直至剩余的板宽比梳子长度多1cm。
小心在胶上覆盖一薄层异丙醇或水。
（3）在分离胶聚合的过程（可置于37℃，约10min）中，配制5%的积层胶（参考表格3）。
（4）分离胶聚合完全后，倒去异丙醇或水，用滤纸吸干胶面上的残余。
（5）灌注积层胶，立即插入干净的梳子，避免产生气泡。
（6）积层胶聚合完全后，小心拔出梳子，拨去封胶用的塑料条，固定于电泳槽。
（7）在上下电泳槽中加入足够的电泳缓冲液。
2、样品的制备
在蛋白溶液中加入等体积的2×样品溶解液，混合液在沸水浴中加热5min，冷却后即可上样。
3、上样
用微量移液器上样，每加入一种样品，上样量根据根据具体的样品浓度确定，未知浓度一般用10微升。
4、电泳
对于一块胶，在浓缩胶中电流设置在15～20mA,?
当染料进入分离胶后可设置电压至电流约为25～30mA，继续电泳直至染料到达离凝胶底部1cm处。
5、后处理
（1）染色：
加入染色液（用量同上），室温染色30min～1h。
Tip：
染色前可将染色液在微波炉里加热至沸，然后摇床震荡染色约10min即可。
（2）脱色：
将染色后的胶块用水洗涤三次去除表面染料，然后加入脱色液脱色，其间更换脱色液3～4次至条带清晰。
Tip：
10min快速脱色:
将脱色液置于微波炉煮沸，更换三次脱色液。
表2.配制SDS-PAGE不同浓度分离胶的配置
不同体积（ml）凝胶液中各成分所需体积（ml）
Gel%
组成
所需要各成份体积（ml）
5
10
15
20
25
30
6%
水
2.6
5.3
7.9
10.6
13.2
15.9
30%丙烯酰胺溶液
1
2
3
4
5
6
1.5mol/LTris（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
TEMED
0.004
0.008
0.012
0.016
0.02
0.024
8%
水
2.3
4.6
6.9
9.3
11.5
13.9
30%丙烯酰胺溶液
1.3
2.7
4
5.3
6.7
8
1.5mol/LTris（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
TEMED
0.003
0.006
0.009
0.012
0.015
0.018
10%
水
1.9
4
5.9
7.9
9.9
11.9
30%丙烯酰胺溶液
1.7
3.3
5
6.7
8.3
10
1.5mol/LTris（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
12%
水
1.6
3.3
4.9
6.6
8.2
9.9
30%丙烯酰胺溶液
2
4
6
8
10
12
1.5mol/LTris（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
15%
水
1.1
2.3
3.4
4.6
5.7
6.9
30%丙烯酰胺溶液
2.5
5
7.5
10
12.5
15
1.5mol/LTris（pH8.8）
1.3
2.5
3.8
5
6.3
7.5
10%SDS
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
10%过硫酸氨
0.05
0.1
0.15
0.2
0.25
0.3
TEMED
0.002
0.004
0.006
0.008
0.01
0.012
表3.SDS-PAGE5%浓缩胶的配置
Gel%
组成
所需要各成份体积（ml）
1
2
3
4
5
6
5%
水
0.68
1.4
2.1
2.7
3.4
4.1
30%丙烯酰胺溶液
0.17
0.33
0.5
0.67
0.83
1.0
1.0mol/LTris（pH6.8）
0.13
0.25
0.38
0.5
0.63
0.75
10%SDS
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
10%过硫酸氨
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
TEMED
0.01
0.02
0.03
0.04
0.05
0.06
8.3细胞破碎获取蛋白质
大肠杆菌细胞破碎有很多方法，譬如反复冻融法，渗透冲击，超声破碎，压力破碎等。
其中超声破碎和压力破碎破碎是我室常用方法。
在建立表达条件过程中，小量制备样品可用小型超声细胞粉碎仪。
离心1.0～1.5ml诱导后的菌液收集菌体，然后视菌体的量加入300～500μl的缓冲液重悬细胞，然后置于冰上超声破碎。
因很多实验室有自己的小型超声粉碎器,各个操作不尽相同，具体操作参考仪器说明书。
常规操作步骤如下（以100ml培养液为例）：
（1）100ml诱导后的菌液（OD600=1.2左右），12000rpm，4℃离心2min，收集菌体。
（2）加入预冷的缓冲液50ml，重悬细胞洗涤菌体一次，12000rpm，4℃离心2min，收集菌体；常规的操作所使用的缓冲液多为PBS或者Tris-NaCl，针对不同的载体和纯化方法，选择相应的缓冲液。
对于一些蛋白酶敏感的目的蛋白，可以在整个操作过程中加入一些蛋白酶抑制剂。
（3）向沉淀中加入15ml的缓冲液同上（若菌体太浓，可加倍），充分悬浮，将菌悬液装在一个玻璃小烧杯中，置于冰水混合物中。
（4）破碎：
将用缓冲液洗涤过的超声探头伸入到菌液中，不要接触烧杯底部，每处理30sec间隔1min使菌液冷却，输出强度为5～6，频率为60～70％。
（5）分离上清和沉淀：
12000rpm，4℃离心20min，分离上清和沉淀。
（6）SDS-PAGE分析蛋白表达情况。
（7）准备纯化蛋白。
超声破碎注意事项与一些小的改进：
（1）破碎完全的判断：
超声前菌悬液是浑浊的，超声完全后变的透明、清澈。
（2）如果超声时出现黑色沉淀，说明超声功率太强。
（3）超声时间太长、功率太高对蛋白活性肯定有影响。
（4）尽量防止泡沫的产生。
（5）大量破碎时将菌液置于一玻璃器皿中，破碎时放在冰水混合物中，以增加散热，减小对蛋白的破坏作用。
（6）破碎前的预处理，在破碎前可用溶菌酶（100μg/ml）处理破环细胞壁（10min，30℃），增加细胞的通透性。
高压破碎是大量的破碎提取细胞内成份的首先方法，相对于超声破碎，它具有过程温和，操作迅速等优点，具体使用需要根据具体的仪器使用说明。
FRENCH?
PRESS细胞破碎仪标准操作规程
（1）使用前将高压腔、底座、活塞杆在4℃冰箱中预冷30min。
（2）将三脚固定器置于水平桌面上，将高压腔正放在固定器器上；在活塞杆的O型环、底座的O型环和针形阀的O型环上均匀涂上少量凡士林。
（3）?
把活塞杆正向插入高压腔至最大加样线，将整个腔体连同活塞杆一起倒转固定在固定器上。
（4）?
将菌液倒入腔体，最大处理量为35ml，最小为5ml。
视样品体积，大致估计并调整活塞杆的位置。
（5）将针形阀和样品喷射管装配于底座上，针形阀拧到轻轻不能拧动为止，并向反方向稍微松动，保证阀门处于开启状态（注意：
务必不能用力拧紧，否则会降低其密封性）。
把底座倒扣于腔体上，向上调整活塞杆的位置，直至腔内空气完全排出，流出一滴样品为止，轻轻旋紧针形阀。
（6）双手托起整个高压腔组件，翻转至正向位置，将其置于升降台上（事先要确保操作台足够的低，以容的下整个组件），向后推动底座，使底座固定于三个位置校准针之间，并调整腔体使针形阀朝向正面。
将固定夹固定于支持杆上，拧紧固定夹上的两个螺丝以固定腔体。
将活塞杆上的手柄转至与固定夹垂直的方向。
（7）?
打开电源，将档位手柄转至HIGH档，顺时针旋转压力控制阀至50psi，升降台开始上升，当活塞杆接触上顶台后，继续顺时针旋转压力控制阀，直至压力达到需要的压力（大肠杆菌的破碎压力一半设定为12000psi，芽孢杆菌设定为2000psi）。
（7）取一冰预冷的离心管（或者将离心管至于冰中）置于样品喷射管出口处，轻轻逆时针转动针形阀，小心控制样品的流出速度，根据破碎程度决定流速（建议在喷射管出口处接一个1cm长的透明的塑料管如输液管，通过观察塑料管流出样品的透明度来判断破碎是否完全）。
当活塞杆上的安全指示线（StopLine）降至腔体上表面时，迅速关紧针形阀（不要过紧），旋转档位手柄至DOWN位置。
待升降台完全下降后，继续降低压力至零，关闭电源。
（8）松开固定夹，取出高压腔，重新倒置于三脚固定器上，取出底座。
将各部分拆开，彻底清洗。
底座及喷射管的内壁要重点冲洗，涂有凡士林处要用洗洁精彻底洗净。
【注意事项】
（1）仪器最大承受压力为4000psi（指示针2500）。
（2）各O形环处（包括样高压腔，底座，活塞杆和针形阀）一定要涂凡士林润滑，以降低磨损，防止损伤。
（3）压力的升高或降低速度要控制在一定范围内。
升高压力前务必保证整个组件固定于升降台上,任何的松动可能导致事故。
（4）活塞杆的手柄要与固定夹垂直，否则会发生危险。
（5）严禁将出样阀过分拧紧，否则会损坏内部撞针，以不流出液体为准。
（6）严禁使活塞杆下至安全线以下，否则会导致活塞杆与底座损坏。
（7）使用完毕要将压力控制阀转至压力为零。
（8）各部件清洗要彻底，否则底座小孔容易堵死，活塞杆上残留的菌体会在未洗净的凡士林上滋生。
（9）长期不用应保存在干燥的环境中，必要时可涂凡士林防止生锈。
（10）压力腔的空气一定要完全排出，否则当样品完全排出时，造成活塞与压力池底座直接接触，造成损伤，由于压力非常大，有可能导致活塞或压力池底座变形，造成永久性损伤！
（11）在搬动装好的样品池时，一定要双手，一手扶住住高压腔，一手托住底座，防止底座脱落而造成事故。
（12）O型环若老化则及时更换。
（13）操作过程中禁止将液体溅入机箱内部。
（14）仪器使用过程中出现故障应及时与负责人联系。
8.4目的蛋白的纯化
8.4.1HisTag纯化操作实例
本实验室中所用的表达载体pET28a（+）中含有一个编码多聚组氨酸的序列，即His-Tag，因此会获得带有His-Tag的重组目标蛋白。
His-Tag可与金属Ni2+离子结合，从而有利于目标蛋白的纯化。
加上了His-Tag的蛋白在非变性的条件下可用Ni2+亲和层析柱纯化。
纯化蛋白的原理是：
当亲和层析柱负载了Ni2+后，可以选择性吸附暴露在蛋白表面具有复杂结构的氨基酸残基（特别是组氨酸残基）。
蛋白质中含有的组氨酸越多，与Ni2+结合的特异性就越高，则将其洗脱下来会需要更高的咪唑浓度。
含有组氨酸标签的目标蛋白与细胞中的总蛋白相比，具有更高的Ni2+结合特异性。
为了得到具有较高纯度的目标蛋白，必须找到一个合适咪唑浓度的洗脱液（结合缓冲液），在此浓度下非特异性的杂蛋白能从柱上洗脱下来，而与Ni2+特异性结合的目标蛋白不会被洗脱。
最后用更高咪唑浓度的缓冲液（洗脱缓冲液）将目标蛋白洗脱下来，此时目标蛋白特异性的存在于该咪唑浓度的洗脱液中，从而得到纯化了的目标蛋白质。
（1）载体构建：
本实验采用pET-28a（+）表达载体，克隆受体
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